Summary
Elektrofizyolojik inceleme ile belirlendiği zaman Aedes aegypti büyük tat uzantıları gen ekspresyonunu değerlendirmek için iki yöntem kullanılarak,, varsayım olarak, acı ve itici bileşikler, nöronal yanıtları altında yatan genlerin dizi belirledik.
Introduction
DEET, Picaridin, sitronellal ve IR3535 gibi bileşikler etkili bir 1,2 aegypti önemli hastalık vektörü Aedes dahil sivrisinek, püskürtmek için gösterilmiştir. Biz sivrisinek iticilik ile ilgili hücreleri belirlemek için özel tat Sensilla ile ilişkili duyusal nöronlar aksiyon potansiyelleri kayıt. Bu dokularda eksprese edilen genlerin alt baş dizilemesi ile birleştiğinde, geliştirilmiş iticilik özellikleri için yeni bileşiklerin taranması için büyük olasılıkla bu hücrelerin yanıtlara aracılık genleri tespit edebilir.
RNA-seq hızla gen ifadesinde zamansal ve mekansal değişiklikleri izleme için standart haline güçlü bir araçtır. RNA seq böcek duyusal kulakçıkların analizleri ve organların büyük gen 6 geleneksel PCR bazlı arama gen iyileştirilmesi, çeşitli insekt türlerinin 3-5 moleküler reseptörlerine ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Böcekler en çeşitli hayvan sınıfını temsil, önbirçok fırsat reyi genler ve benzersiz fenotipleri arasındaki bağlantıyı incelemek için. RNA seq teknoloji herhangi bir yaşayan böcek doku üzerinde kullanılabilecektir. Benzer şekilde, uniporous tat Sensilla duyu hücrelerinden elektrofizyolojik kayıt birçok farklı böcek türleri elde edilebilmektedir. Bu iki teknik eşleştirme araştırmacılar gözlenen kimyasal duyu fenotip dahil set genleri daraltmak için izin verir. Farklı türler belirli zorlukları sunacak, ancak kimyasal duyu reseptör genleri ve bir kimyasal duyu adaptasyon arasındaki bağlantıyı bilgilendirebilir. büyüklüğü ve kimyasal duyu Sensilla morfolojisi değişkendir ve gürültüyü azaltmak ve tekrarlanabilir sinyalleri tespit aksiyon potansiyelleri kaydederken kapsamlı sorun giderme gerekebilir. Kimyasal duyu organlarının diseksiyonu önemsiz ya da hassas ve zaman böcek morfolojisi ve büyüklüğüne bağlı olarak, alıcı olabilir. Yüksek kaliteli RNA Kurtarma böyle sırasında belirli pigmentleri kaçınarak, yanı sıra bazı sorun giderme gerekebilirDoku Kolleksivonu.
Davranış denemelerle itici bileşiklerin etkisini gösteren doğrudan ve bilgilendirici olmakla birlikte, bu yaklaşım, zaman etki mekanizması ile ilgili olarak, yoğun ve geniştir. RNA-seq ile birleştiğinde Elektrofizyoloji böcekler kaçınma davranışları neyin daha spesifik analizler için izin verir. Kimyasal ayrımcılık "araç", bir böcek türlerinde tanımlanmıştır sonra, daha özel girişimler bilinmektedir kovucular mümkündür geliştirmek için. Bu davranışlarından sorumlu duyu hücrelerinde reseptörleri ve ilgili proteinler doğrudan kimyasal tarama için heterolog bir şekilde eksprese edilebilir. Ayrıca, moleküler modelleme kimyasallar bu reseptörlerin 7 güçlü tepkiler hangi tahmin edebilirsiniz.
duyusal dokuların dar kümesindeki tüm aktif genlerin fotoğraf da diğer türlerdeki benzer genlerin tanımlanması yararlı olabilir. Dizi homolojisi ve sentezleme si kullanılarakmilarities, araştırmacılar büyük olasılıkla böcekler üzerinde geniş etkili kovucular yanıtlar aracılık moleküler reseptör setleri oluşturabilir. Biz böcek kimyasal duyu yolları yapısökümünden araştırmacılar yardımcı olmak ve sigara modeli ve ekonomik açıdan önemli böceklerin Nöroetoloji dalmak için fazla ikna için aşağıdaki protokol mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yetiştirme Ae. aegypti yetişkin
- Sığ tepside yaklaşık ¾ inç suda Hatch yumurta. Aşırı kalabalık yetişkinler boyutunu azaltacaktır.
- Arka larva 25 ° C (12-HL: 12-HD) de ve zemin balık gıda ile beslemek.
NOT: Fazla besleme sağkalım oranlarını azaltmak olabilir. - Günlük Pasteur pipeti tek tek pupa çıkarın ve böylece 24 saat yaş gruplaşmalar kurulması, ince örgü kapaklı plastik tabaklar küçük çevreleme kovalar içinde (5.5 cm x 9 cm) aktarın.
- Bir kafes yuvanın elek çeperlerine yerleştirilen pamuk besleme yetişkin sivrisinekler,% 10 sukroz çözeltisi larvaları ile aynı bir fotoperyod ile 27 ° C'de ve% 70 nispi nemde bir çevre odasında sivrisinekler.
- Elektrofizyoloji için, 5-10 gün eski hayvanları kullanın. Genel olarak, büyük hayvanların daha iyi sonuçlar üretecektir. RNA izolasyonu için, 5-10 gün eski aralığında bir tek 24 saat yaş gruplama içinde olan hayvanları kullanın.
- Seçilen duyusal nöronlar minimal aktivite ortaya çıkaran elektrolit (örneğin, 1-10 mM), uygun bir konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 mM NaCl veya 1mm KCl bir deney başlarken temel aktiviteyi test etmek için makul elektrolitler bulunmaktadır.
- Tek başına elektrolit ile karşılaştırıldığında büyük çivi aktivitesi üzerinde hiç veya çok az etkiye sahip olan her deney uygun bir çözücü içinde kimyasal (eğer su kullanılması etanol ya da DMSO) içinde çözülür. % 10 etanol ya da% 1 DMSO nihai konsantrasyonu uygun başlangıç konsantrasyonlardır.
- Böcekler besleme caydırıcı veya uyarıcı iyi tarif edilmiştir kontrol kimyasalları (tatlı için acı veya sukroz gibi kinin) uygun seçin.
3. Elektrofizyoloji (8 ipucu kayıt; 1 Şekil)
- Mekanik cam kılcal çekerek Formu cam elektrotlar. Isı Optimize ve uygun şekilli recordi oluşturmak için cam çekmek için ayarları çekinng elektrotlar. Dikkatle hedef Sensillum zarf yeterince geniş, ama komşu yapılarla temas önlemek için yeterince küçük açılış elektrot ucu oluşturmak için bir mikroskop altında forseps kullanılarak cam elektrot ucu kesiyorum.
- Bir mikroskop altında, görsel morfoloji ile tespit ve ucu kayıt tekrarlanabilirlik sağlamak için hedef Sensilla / Sensillum yerleştirin. Hazırlık hayvanlar elektrot giriş açıdan Sensilla ücretsiz erişim sağlamak için.
- -20 ° C'de derin dondurucuda soğuk anestezisi yetişkin böcekler. Soğuğa aşırı maruz periferik nöronlarda zarar kaçının. Cam slayt jilet ile selofan bantı dar şeritler halinde kesilir. Dar şeritler kullanılarak cam slayt tüm böcek hareketsiz.
- Kayıtsız (toprak) elektrot olarak hizmet dorsal toraks veya göz içine bir kimyasal bilenmiş tungsten tel yerleştirin.
- Ilgi uyarıcı çözeltisi ile adım 3.1 yapılan cam elektrot doldurun. Eklenen bir şırınga kullanarak, kapağı doldurmakçekti ucundan Illary ucunu künt. Aşağı çekti ucunu tutarak, tüm hava kabarcıklarını dışarı itin. Kayıt ve uyarıcı elektrot olarak hizmet adım 3.1 yapılan cam elektrot içine bir gümüş tel (chloriding isteğe bağlı) takın.
- Böceklerde temas chemoreceptive Sensilla gelen kayıtları için tasarlanmış bir ön amplifikatöre elektrotları bağlayın. Bu Preamplifikatör (300 Hz-3 kHz bant geçiren filtre) mümkün olduğunca giriş uyarıcı kadar yakın nöronal aktiviteyi yakalamak için yerleşme süresini azaltacaktır. Toplamak mağaza ve başak kayıt yazılımı ile donatılmış bir mikrobilgisayar kullanarak elektrik sinyallerini analiz.
NOT: ölçüde sinyal-gürültü oranını artırabilir düzgün kayıt kurulumu Topraklama. - Işlevselliği sağlamak için bir kontrol çözümü (elektrolit yalnızca) ile Sensilla teşvik. Tüm hazırlıklar için uyaran artifact aşağıdaki 200 msn başlayan ani sayın.
- Doz-cevap çalışmaları hariç, bütün deneyler için Test kimyasal sırasını Rastgele,önyargı ortadan kaldırmak için. Doz-cevap çalışmaları için, deney kimyasal artan konsantrasyonlarına Sensilla maruz kalmaktadır. Yeterli iyileşme sağlamak için uyarılara arasında 3 dk en az bekleyin.
NOT: Bu gereklilik, böcek ve Sensilla bağlı olarak değişebilir. Eşik standart sapması test edilen en düşük konsantrasyonda standart hata ile örtüşmeyen olan konsantrasyon olarak tanımlanır.
4. RNA izolasyonu ve Sıralama (Şekil 2)
- Sıkıca geçmeli kapak tüpleri uygun doku disruption.Prepare eşlik RNaz ücretsiz havan elleri önce kuru buz üzerinde onları soğutma sıkıca uydurma RNAse ücretsiz pestles hazırlayın. Aktif aşırı yoğunlaşmayı önlemek için diseksiyon sürece kapalı toplama tüpleri tutun.
- Süzülmüş aspiratör kullanarak, 30 ila 40 soğuk anestezi sivrisinek (° C derin dondurucuda -20 15 sn), soğuk sahnede ve sıralama cinsiyete göre yerleştirin. Yer hayvanlar tat uzantıları zarar değil kanatlarını kavrama, aşağı tarafı dorsal.
- Ince forseps iki çift kullanarak, bir mikroskop altında erkek veya kadınlardan eşleştirilmiş Labella veya tarsi incelemek ve komşu dokuların dahil sınırlamak.
Not: 500 eşleştirilmiş labella mRNA'nın yaklaşık 800-1.000 nanogram elde edilir. 400 ayrı tarsi (5 segmentlerinin her biri) toplam mRNA 1,200-1,800 nanogram verir. - Nefes nefese-forseps bir çift, hafifçe iç stileleri açığa Labella'ya sadece proksimal sivrisinek burnumun kavramak. Toplama-forseps diğer çifti kullanarak, Labella kaldırmak ve soğuk toplama tüp tarafına doku ekleyin.
- Forseps bir çift ile hafifçe tibia ve ilk tarsal segment kavşakta sivrisinek bacak kavramak. Forseps diğer çifti kullanarak, tarsi çıkarın ve soğuk toplama tüpünün yan doku ekleyin.
NOT: istedim ve istenmeyen doku arayüzünde dikkate hücre tipleri alın. Bu doku komşu dahil sınırlamak için önemli olmakla birlikte, istenen doku bölümlerini ihmal değil aynı derecede önemlidir. final numune doğru çıkar tüm organı temsil etmelidir. Toplama forseps tam kazıma veya sadece istenilen doku kapma kurtarmak öyle ki doyumsuz forseps ile kesin bir sınır oluşturun. - Periyodik olarak, tüpün alt kısmında doku tutmak için 9.000 xg'de kısaca 0 ° C santrifüj toplama tüpü aşağı doğru döndürün. Nem diseksiyonu sırasında toplama tüpleri birikir ise, toplanan doku kapsayacak şekilde soğuk Trizol reaktif 50ul ekleyin.
- Anti-leke laboratuvar işaretleyici kullanarak, açıkça bir RNaz ücretsiz 1.5 ml toplama her doku türü için kapak tüp ek etiket. (Trizol eğer ince parçalara) 1.5 ml tüp raf ve sıvı azot kullanarak, sonra ince toz haline doku öğütmek donma. Kez tekrarlayın. 1 ml Trizol toplam hacmi getirin ve vorteks zemin dokusu tekrar süspansiyon.
- Kloroform, 200 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, 4 ° C'de ve 15 dakika boyunca 11,000 x g'de santrifüj aşağı doğru döndürün. Dikkatlicegenomik DNA, filtre kolonuna sulu katman ekleyin. 5 dakika boyunca 11.000 x g'de aşağı doğru döndürün. Içeri akış ve kamış ile karıştırmak için RNaz içermeyen,% 70 etanol, eşit hacim. Bir RNA toplama kolonuna sıvı aktarın ve verilen talimatlara göre RNA ekstraksiyon devam ediyor.
- Ölçmek ve hassas spektrofotometre toplam RNA saflığını değerlendirmek ve herhangi bir standart RNA sıralama yöntemi ile devam edin.
5. Kantitatif RT-PCR RNA Dizilimine Doğrulama (Şekil 3)
- Tahmin edilen sekans bolluğu ve varsayılan duyusal gen fonksiyonu hem de bir dinamik alan üzerinde göreceli gen ekspresyonu seviyesini karşılaştırmak için mümkün olduğu kadar çok gen seçin.
- Her bir hedef genin için tasarım primer çiftleri belirli 100-180 baz çiftlik PCR ürünü amplifiye etmek için. Set başına en az bir astar sağlayarak non-spesifik gDNA amplifikasyon dışla bir intron sınır kapsamaktadır. Seçenek olarak ise, genom kirlenmeyi azaltmak için DNaz tedavisi kullanımı.
- ToplamakÖnceki bölümde tarif edildiği gibi böcek doku. Tüm Mah-PCR reaksiyonları tamamlamak için yeterli RNA sağlamak için gereken ne kadar doku hesaplayın.
NOT: Biyolojik üçlü ve teknik üçlü reaksiyonları sonuçlarında maksimum güven sağlayacaktır. - , Biyolojik ve teknik hem de her biri için her hedef gen ve ortalama (Ct [hedef] -CT [Referans]) çoğaltmak - X hedef olarak göreceli gen kantifikasyonunu hesaplayın. Biyolojik çoğaltır arasında Ct değerleri normalleştirmek için temizlik gen (ler) kullanın ve bağıl ifade karşılaştırmalarda Y ekseni ölçeği kök.
- RNA seq ve regresyon tabanlı önyükleme denklik prosedürü 9 tekrarlı her dokudan elde edilen verilere uygulanan kullanılarak QRT-PCR veri setleri benzerliğini değerlendirin.
NOT: Bu prosedür gözlenen RNA-seq ve Mah-PCR verilerine etrafında inşa edilebilir en küçük "benzerlik bölgesini" tanımlar ve qRT- ile ölçülen bağıl gen ifadesini izinPCR, RNA-seq göreceli gen ifadesinin ölçümü istatistiksel eşdeğer kabul edilecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ae aksiyon potansiyellerinin iz kayıtları. aegypti tat Sensilla (Şekil 1) kimyasal bir dizi doğrudan uyarılması etkinliğini göstermektedir. Bu teknik, makul bir zaman aralığında (genellikle az 500 ms) içinde belirli bir genlik ve süreye sahip sivri sayarak bir uyarıcı kimyasal tepkiler ölçmek için kullanılabilir. İz kayıtları deneysel koşullar, belirli bir dizi şartlar altında kolaylıkla tekrar üretilebilir olmalıdır. Aksi takdirde, gözlenen fizyolojik yanıtlar testi türlerinin bireyler arasında nadir fenotipleri temsil edebilir.
Ham RNA-seq veri yuvarlak RPKM olarak sunulmadan önce filtrasyon ve doğru haritalama gerektirir (eşlenen sayısı milyonda transkript kilobaz uzunluğu başına okur eşleştirilmiş okur) veya FPKM (milyonda transkript kilobaz uzunluğu başına okuma parçalarının sayısı eşleştirilmiş okur) sayısal değerler (Şekil 2). arasındaki ayrımBu iki RNA seq normalleştirme yöntemler, iki seminal işler 10,11 tarif edilmiştir. Toplam mRNA sıralamasının bir avantajı, aynı zamanda, büyük gen ailelerinin ekspresyonunu tespit etmek için yeteneğidir. Birçok genin sentezlenmesinin görsel sunum bir kez belirli bir doku için moleküler bir araç seti, benzersiz bir anlaşılmasına olanak vermektedir. Cinsiyetler, gelişim aşamaları veya doku tipleri arasındaki karşılaştırmalar hızla yapılabilir.
RNA-seq veri setleri için biyolojik çoğaltır maliyet veya doku toplama zorluğu ile sınırlı olabilir. Mah-PCR az maliyetle toplam gen ifadesinin küçük alt kümelerini doğrulamak için yeteneği sunar ve daha az kaynak RNA gerektirir. (Şekil 3A) iki yöntem gen bolluk tahmini için farklı kimyaları güveniyor gibi, RNA-seq sonuçları daha fazla güven için izin tarafında veri karşılaştırmaları yan. Istatistiksel eşdeğerliğin işlevleri (Şekil 3B), her durumda kesin sınırlarını göstermektedir.
Şekil 1: Ae labellum bir orta ölçekli Sensillum gelen elektrofizyolojik kayıtlar. bahsedilen iş 12 modifiye edilmiş aegypti kadın. İzler, 100 mM NaCl, 100 mM sukroz, 1 mM kinin,% 0.8 DEET,% 0.8 Picaridin,% 0.8 sitronelal ve% 0.8 IR3535 sırasında olan tepkileri gösterir. farklı genlikleri veya şekiller üç sivri bir, b veya c etiketli. Sırasıyla, tuz, şeker ve acı: Bu üç sivri farklı hassasiyetleri ile üç duyusal nöron alt tipleri ile gelmektedir.
Şekil 2:., 8 doku örnekleri için RNA-seq tarafından belirlenen belirtilen iş 13 modifiye gibi tat reseptör gen ifadesinin Tablo Bireysel hücreleri için RPKM değerlerini raporHer tat gen açıklama, erkek dokular (solda) ve dişi dokuları (sağda). Sayısal değerler en yakın onda yuvarlanır. Isı harita renk yoğunluğu yüksek RPKM şapkalı ve orta tek tek her gen ailesi için tartılır. Bu durumda gösterilen tek gen ailesi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Çalışmada yer alan 13 modifiye QRT-PCR verileri ve RNA seq verilerin karşılaştırılması (A), yatay eksen her kemo-alış geni iki veri sütunu ile temsil edilir. Sol sütun RNA seq ile belirlenen nispi ifade temsil eder; Kemo-alış genlerin RPKM değerleri bu dokuda sayısal oranlarını üretmek üzere temizlik gen Aaeg LASP bu bölünmüştür. sağKolon Mah-PCR ile belirlenen göreceli ifadesini temsil etmektedir. İlk olarak, labella genleri için biyolojik olarak tekrarlanan Ct değerleri, standart olarak Aaeg LASP kullanılarak normalize edildi. Her gen göreceli ifade değerlerini hesaplamak için kullanılan İkinci, Ct değerleri çoğaltmak (E hedef - (Ct [hedef] -CT [Referans])). Hata çubukları ayrı ayrı hesaplanan nispi ifade değerlerinin standart sapmasını göstermektedir. (B) RNA-seq ve Mah-PCR veri setleri ayrı bir analizde karşılaştırıldı. 1 değeri temizlik geni Aaeg LASP atfedilen ve diğer tüm gen ifadesi bu değere göre rapor ediliyor ile, RNA-seq verilerle gösterildiği gibi dikey eksen göreceli gen bolluğu temsil eder. 1 değeri temizlik geni Aaeg LASP atfedilen ve diğer tüm gen ifadesi bu değere göre rapor ediliyor ile, Mah-PCR ile tahmin yatay eksen göreceli gen bolluğu temsil eder. Kırmızı çizgiler tam denklik temsil. Kesik çizgiler istatistiksel denklik algoritması 9 hesaplanan yamaç için 'benzerlik bölge', sınırlarını temsil eder. Katı siyah çizgiler 12 hedef genlerin ve Aaeg LASP temizlik geni için RNA-seq niceliği Mah-PCR denklik en küçük kareler regresyon, daire veri noktası ile temsil her etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tat Sensilla gelen kayıt aksiyon potansiyelleri en zorlu yönü hangi yanıtları karar olduğunu "normal." verilen bir böcek türlerinin toplam sayısı ve tat reseptör nöronların hassasiyetleri (GRNs) için ilk defa kayıt tek tat Sensillum ucu istihdam zaman vardır muhtemelen bilinmeyen. Birçok ön kayıtları ilk aralığı ve test etmek için kimyasal konsantrasyonlarını karar gereklidir. Bu durumda, bir tek GRN'de DEET'in (Şekil 1) düşük konsantrasyonlarda yanıt gözlem ile başladı. Daha sonra biz, acı ya da diğer böcekler için caydırıcı olduğu bilinen kimyasal bir konsantrasyon aralığında aynı Sensillum içinde tepkileri incelenmiştir ve benzer bir başak şekli ve amplitüdü (Şekil 1) görülmektedir. Bu gözlemler, tek bir GRN alt tipi bu caydırıcı bileşiklere yanıt önerdi. Karşılaştırma için, mosqu olarak besleme uyardığı bilinmektedir şekerli bileşikleri testbenzer bir başak oluştu eğer itoes görmek için. Biz bu durumda farklı bir, daha büyük başak gözlendi. Benzer şekilde, üç toplam GRN alt tipi ulaştık, tuz uyarılmasına karşılık olarak bir üçüncü, orta boy başak görülmektedir.
Böcekler elektrofizyolojik kayıt hazırlıkları doğal değişkendir. Hedef tat Sensilla genellikle çok küçük ve manikür camına dokunmayın kayıt elektrodu ile erişmek için uygun açıda olmalıdır. Tat nöronlara bir iletken köprü kurmak için, Sensillum terminal gözenek kayıt elektrot elektrolit ile doğrudan temas kurmak için bulunan lenf açık olmalıdır. Biz yabancı enkaz Sensilla açıklıkların biri tarafından tıkanmasına gözlenen ya da atılır ve hedef Sensillum içinde malzeme kurudu. Bu engelleri önlemek için, bakım yetiştirme ve hedef Sensilla ile temasını engellemek için böceklerin taşırken alınmalıdır. Buna ek olarak choo içinhasarsız, sağlıklı bir test böcekler, biyolojik yaş gibi faktörler, kayıtlarda değişkenliği azaltmak için kontrolleri kurarken dikkat edilmesi gereken devlet ve zeitgeber zaman çiftleşme, beslenme durumu şarkı.
Bu sürekli bir duyarlı hazırlık elde etmek zor olabilir. Birçok denemeler bireysel ani çözmek için sinyal-gürültü oranı yeterince iyileştirmek için gerekli olabilir. Anılan hazırlıkları Deneysel varyasyonları iyi sonuçlara yol açabilir. Bu sükroz veya kinin gibi bir ortak böcek başak elisitörü kullanarak test türleri için kayıt cihazının üzerinde sağlam bir yanıt kurmak için tavsiye edilir. Bir tat Sensillum yanıt sonra, bu tepkiler tekrarlanabilir olmalıdır. uyarımlar arasındaki minimum zaman uzunluğu deneysel farklı zamansal kısıtlar altında başak dinamikleri incelenerek tespit edilmelidir. Aşırı uyarım GRN sağlığını korumak ve Sensillum lenf bozulmasını önlemek için kaçınılmalıdır. Durumda that yanıtı hassasiyeti preps daha fazla sayıda bu tepkiler verilen türler için fizyolojik tipik olduğu güveni sağlamak için alınmalıdır, ilk stimülasyon sonra hızla azalır.
Bazı solventler hatta düşük nihai konsantrasyonlarda, GRN aktiviteyi etkileyebilir gibi bazı test kimyasalların çözünürlüğü, uyarıcı elektrotlar yapma zorluk yaratabilir. Bu düşünceler deneme ve yanılma yoluyla ve uygun kontroller ile ele alınabilir. Kullanılan herhangi bir çözücü yanıtları arasında tutarlılığı sağlamak için kontrol elektrolit ve test çözeltilerine ilave edilmelidir. Böylece doğrudan erişim sağlayan Hareketsizleştirici küçük böcekler, kırılgan dokulara zarar vermeden Sensilla hedef deneme yanılma gerektirebilir.
elektrofizyoloji ana sınırlama gözlenen nöronal yanıtları ve potansiyel mansap davranışsal tepkilerin talihsiz ayrılmasıdır. Bu nedenle, b kimyasalların yanıtlar test etmek avantajlıdıreen ekolojik bağlamda sonuçların önemini tartışmak için özel davranışsal tepkiler gösterilmiştir. Öneri kayıtları transgenik hayvanların değerlendirilmesi ya da davranış fenotipik farklılık gösteren kişiler için bu teknik idealdir, hücresel aktivite çok kesin tespiti için verir. Bu kayıtlar da nöronal aktivitenin görsel gazetecilere dayanarak sistemlere göre, bu tür zamansal ve genlik dinamikleri gibi nöronal yanıtları hakkında daha fazla bilgi sunuyoruz. Bazı durumlarda, sinir tepkiler davranış verilerinin 12 daha kolay ölçülebilir.
RNA-seq ve Mah-PCR için doku toplama basittir ama soğuk depolama ve aşırı nem kaçınma yoluyla hücresel materyalin korunması için sürekli konsantrasyon ve dikkat gerektirir. RNaz etkinliği RNA kalitesini etkileyebilir; Bu nedenle doku sadece toplama ve RNA ekstraksiyonu boyunca temiz yüzeyler başvurmalısınız. Sorun giderme Mah-PCR i için gerekli olsaprimerler tasarımı ve hedef ve temizlik genleri seçerken iyi belgelenmiş s, büyük olasılıkla tuzaklar erken sürecinde ortaya çıkar. Tahmin edilebileceği gibi görece sentezleme seviyesinin bir hat boyunca eşit aralıklı noktalarını temsil eden genler, RNA-seq ve QRT-PCR veri setleri (Şekil 3) karşılaştırmak için faydalıdır. Örneğin, test edilecek olan 0, 10, 20, 30, vb sırasıyla bolluk tahmin edilebilir bir düzen sunmaktayız RPKM değerlerini göstermektedir qPCR genlerin seçilmesi.
RNA-seq (Şekil 2) asılıyor vurgulayarak tat dokuların bizim ankette genleri ifade başarılı oldu. Ae için güvenilir gen yapı. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) ve önceki kemo-alış gen tanımlama 14 gol gen ifadesi nispeten kolay. Bu amaçlar için, mevcut gen açıklamaları ve ilgi belirlenen gen aileleri böcekler değerli model sistemler vardır. Doğru bir eşik belirlemearka plan gürültüsü genel gen ifadesi için spekülatif, ancak uygun kesilecek belirleme yöntemleri 15-17 mevcuttur. İşte biz tam güven RPKM seviyesini ve biz sonuçları bizim tartışma çerçeveli hangi emsal 9 dayalı azalmış güven alt RPKM seviyesini belirledi.
Gelecekte biz böcek iticilik aracılık genlerin bilgimizi genişletmek için sivrisinek ve diğer ekonomik açıdan önemli böcekler hem de diğer kimyasal duyu dokuları incelemek istiyoruz. Biz büyük olasılıkla mevcut fonksiyonel verileri 13 ile türlerin gen dizileri karşılaştırarak caydırıcı bileşiklere yanıtları arabuluculuk birkaç aday tat genleri kurduk. Biz bu bireysel duyusal genleri eksik sivrisinek transgenik hatları üreten. Biz REPE bu mutantların davranışsal tepkiler bilinen kovucular algılamak ve değerlendirmek için hayvanın yeteneğini bu genlerin rolünü değerlendirmek için ucu kayıtları kullanacakllents. Bu aday genler önemli geçirmezlik etkilemez Bu durumda, daha yüksek çözünürlük daha kesin tek Sensillum veya hücre içinde gen ekspresyonunu veya proteinin varlığını belirlemek için gerekli olabilir. Aşağı ifade reseptörleri her yerde ifade ko-reseptörleri ile birlikte, yeni bir kovucular taranması için kritik bir hedef olabilir. Ne yazık ki, in situ hibridizasyon ve bağışık böcek tat dokusu 18 inanılmaz zor olduğu kanıtlanmıştır.
Genlerin bu fizyolojik tepkiler ve davranışları aracılık olan kurduk sonra, aday kovucular, yüksek verimli bir şekilde taranması için uygun olan hücre sistemlerinde, bu genleri ifade edebilir. Ayrıca, bileşik tipleri spesifik reseptörlere güçlü bir yanıt ortaya çıkmasına neden olur saptanmasında faydalı olabilir Taşıyıcı sistemler 7 kullanarak siliko yaklaşımlarda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
