É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Síntese de Immunotargeted magneto-plasmónico Nanoclusters

14.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/52090

⸱

22 de agosto de 2014

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas de magneto-plasmônica com um forte momento magnético e um (NIR) absorção forte de infravermelho próximo. O protocolo também inclui a conjugação de anticorpos para as nanopartículas, através da unidade Fc para diversas aplicações biomédicas que requerem direccionamento específico molecular.

Resumo

Propriedades magnéticas e plasmonic combinadas em um único nanopartícula proporcionar uma sinergia que é vantajoso em algumas aplicações biomédicas, incluindo aumento de contraste em novas modalidades de imagem magnetomotrizes, captação simultânea e detecção de células tumorais em circulação (CTC), e imagiologia molecular multimodal combinada com terapia fototérmica de células cancerosas. Estas aplicações têm estimulado um interesse significativo no desenvolvimento de protocolos para a síntese de nanopartículas de magneto-plasmônica com absorção óptica na região do infravermelho próximo (NIR) e um forte momento magnético. Aqui, nós apresentamos um novo protocolo para a síntese de tais nanopartículas híbridas que é baseada num método de microemulsão óleo-em-água. A característica única do protocolo aqui descrito é a síntese de nanopartículas de magneto-plasmônica de vários tamanhos de blocos primários que também têm características magneto-plasmônicos. Esta abordagem produz nanopartículas com uma alta densidade de funcionalidades magnéticos e plasmonic que são distribuídos uniformemente em todo o volume de nanopartículas. As nanopartículas híbridos podem ser facilmente funcionalizados anexando anticorpos através da porção Fc deixando a porção Fab que é responsável pela ligação ao antigénio disponíveis para direccionamento.

Introdução

Nanopartículas híbridas, compreendendo diferentes materiais com propriedades físico-químicas distintas pode abrir novas oportunidades em aplicações biomédicas, incluindo imagens multimodal molecular, a administração de terapêutica e acompanhamento, nova triagem e testes de diagnóstico 1-3. A combinação de propriedades magnéticas e plasmonic num nanopartículas é de particular interesse uma vez que proporciona uma muito forte absorção de luz e dispersão de secções transversais associadas com ressonâncias plasmon e capacidade de resposta a um campo magnético. Por exemplo, as nanopartículas magneto-plasmonic foram usadas para aumentar o contraste de imagem de campo escuro de células marcadas por aplicação de uma modulação de sinal temporal, através de um electroíman externo 3-5. Mais recentemente, um princípio semelhante foi aplicada no desenvolvimento de uma nova modalidade de imagens - imagiologia magneto-fotoacústica, onde nanopartículas magneto-plasmónico permitir grandes melhorias em contraste rato e de sinal para fundoio 6,7. Mostrou-se também que as nanopartículas híbridas podem ser usadas para a captura e detecção de células tumorais em circulação em todo o sangue e in vivo 8,9 simultânea. Além disso, as nanopartículas magneto-plasmônicos são promissores agentes theranostic que podem ser usados ​​para imagiologia óptica molecular e MR especifica combinada com a terapia de células cancerosas fototérmica 10.

Várias abordagens foram exploradas para a síntese de nanopartículas magneto-plasmónico. Por exemplo, Yu et al. Decomposição utilizado e a oxidação de Fe (CO) 5, em nanopartículas de ouro para formar haltere-bifuncionais como Au-Fe 3 O 4 nanopartículas 11. Wang et al. Sintetizaram nanopartículas de óxido de ferro revestidas com ouro usando o método de decomposição térmica 12. Alguns outros métodos baseiam-se em polímero de revestimento ou de amina moléculas funcionais a nanopartículas de núcleo magnético, seguido de deposição de agshell de idade sobre a superfície do polímero para criar o híbrido partículas 7,13. Além disso, as nanopartículas de óxido de ferro foram anexados ao nanobastões de ouro via interações eletrostáticas ou uma reação química 14,15. Embora estas abordagens produzir nanoestruturas magneto-plasmonic, que comprometem a algumas propriedades de extensão da combinação magneto-plasmónico como absorvância óptica na janela do infravermelho próximo (NIR), ou um forte momento magnético ambos os quais são altamente desejáveis ​​em aplicações biomédicas. Por exemplo, haltere Au-Fe 3 O 4 nanopartículas tem um pico de ressonância de plasmon de a 520 nm, o que limita a sua utilidade in vivo devido à turvação elevado tecido nesta gama espectral. Além disso, as nanopartículas magneto-plasmónico produzidas por protocolos correntes estão limitados a apenas um ou alguns (11 a menos de 10) 14,15 metades superparamagnéticas (por exemplo, nanopartículas de óxido de ferro) que é significativamente menor do que poderia ser achquistada em uma nanoestrutura densamente. Por exemplo, a 60 nm de diâmetro das nanopartículas esféricas densamente pode conter na ordem de um milhar de 6 nanopartículas superparamagnéticas nm. Por conseguinte, existe uma grande margem para melhorar as propriedades magnéticas das nanopartículas híbridas. Além disso, alguns dos protocolos anteriormente descritos são relativamente complexas e requerem optimização cuidadosa, a fim de evitar a agregação das partículas durante a síntese 14,15.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas magneto-plasmónico com um forte momento magnético e uma forte absorvância NIR que aborda as principais limitações da técnica actual. A síntese tem suas origens no método 16 microemulsão óleo em água. Ele baseia-se na montagem de nanopartículas de um tamanho desejado de uma muito menores partículas primárias. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso para a produção de nanoestruturas de um único material, tal como ouro, óxido de ferro, e pri semicondutormary partículas 16. Nós alargado a síntese de nanopartículas de magneto-plasmônica, por um lado, fazendo 6 nm de diâmetro de concha de ouro / núcleo de ferro óxido de partículas e, em seguida, montar as partículas híbridas primárias para a nanoestrutura esférico final. Montagem partículas primárias em nanopartículas não só permite melhorar as propriedades das nanopartículas constituintes, tais como realização de um momento magnético mais forte, preservando as propriedades superparamagnéticas, mas também tira proveito da interação entre nanopartículas individuais, criando assim novas características ausentes das nanopartículas constituintes, como a forte absorção óptica na janela de NIR. Este protocolo resulta nanopartículas híbridas com uma alta densidade de funcionalidades magnéticos e plasmonic. Depois de as partículas primárias são sintetizados, o nosso método é essencialmente uma reacção simples de um só recipiente. A força total de ressonância de plasmon de momento magnético e são determinadas por um certo número de partículas primárias e, utrasntes, pode ser facilmente otimizado de acordo com o pedido. Além disso, também desenvolvemos um procedimento para anticorpo conjugação com as nanopartículas híbridas para várias aplicações biomédicas que exigem segmentação específica molecular. Os anticorpos são ligados através da unidade Fc deixando a porção Fab que é responsável pela ligação ao antigénio disponíveis para direccionamento.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Aparelhos de Copos Preparação

  1. Usar equipamento de proteção adequado, ou seja, um jaleco, luvas descartáveis ​​e proteção para os olhos.
  2. Conectar um balão de fundo redondo com um condensador e mergulhá-lo em um banho de óleo de silicone com uma monitorização de temperatura por um termómetro. Coloque uma fonte de calor (por exemplo, placa de aquecimento), sob o banho de óleo (Figura 1). Utilizar um termómetro capaz de medir a temperatura mais elevada do que 260 ° C.

Nanopartículas 2 Síntese de híbrido primário Magneto-plasmônicos

  1. Fazer Magnetic Núcleo Nanopartículas
    1. Adicionar 353,2 mg (1 mmol) de ferro acetilacetonato (III), 1 ml (2 mmol) de ácido oleico, 1 ml (2 mmol) oleilamina, 1,292 g (5 mmol) de 1,2-hexadecanediol, e 10 ml de éter de fenil a uma ronda frasco -bottom.
    2. Agita-se vigorosamente a mistura usando uma barra de agitação e aquece-magnética a 250-260 ° C durante 1 h sob refluxo. Em seguida, aguarde a solução para se refrescarpara baixo para a TA. Certifique-se de que a temperatura está abaixo de 260 ° C para evitar a ebulição do éter fenil e evitar uma explosão da mistura de reacção do balão de fundo redondo para o condensador.
      ATENÇÃO: A mistura de reacção é extremamente quente e os produtos químicos podem causar irritação. Deve operar sob um exaustor e usar equipamentos de proteção individual adequados. Assegurar uma ventilação adequada para o banho de óleo.
      NOTA: O banho de óleo mantido a 250-260 ° C de temperatura durante 1 hora durante a síntese das nanopartículas magnéticas. Em princípio, um vidro pirex pode ser utilizado para esta finalidade. No entanto, a temperatura máxima contínua de vidro Pyrex é ~ 260 ° C de acordo com a informação de vendedor. Portanto, um recipiente de metal proporciona uma opção mais segura para a reação, pois ele pode suportar uma temperatura mais elevada e durar mais tempo durante várias execuções.
  2. Deposição de uma concha de ouro em nanopartículas núcleo magnético
    1. Adicionar 411,5 mg (1,1 mmol) ace ouroTate, 0,25 ml (0,75 mmol) de ácido oleico, 1,5 ml (3,0 mmol) oleilamina, 775,3 mg (3 mmol) de 1,2-hexadecanediol, e 15 ml de éter de fenil para um balão de fundo redondo.
    2. Adicionar 5 ml de suspensão de nanopartículas magnéticas a partir do passo 2.1. Aquece-se a mistura de reacção a 180 ° C e manter sob refluxo durante 1 hora. Aguarde até que a solução para esfriar a temperatura ambiente.
    3. Adicionar 50 ml de etanol para precipitar as nanopartículas híbridos primários seguido de centrifugação a 3250 × g durante 15 min.
    4. Ressuspender o precipitado em 25 ml de hexano por meio de um banho de ultra-sons. Adicionar 25 ml de etanol para precipitar as nanopartículas híbridos primários. Centrifugar a 3.250 xg durante 15 min e ressuspender o precipitado em hexano. Repita este passo três vezes.
    5. Secam-se as nanopartículas híbridas primário precipitados em um excicador de vácuo S / N. Confirme que as partículas estão completamente secos.

Nanoclusters 3 Híbrido Magneto-plasmônicos Síntese e Separação Tamanho

  1. Ressuspender 5 mg de nanopartículas híbridas primárias secas em 1 ml de hexano, usando um sonicador de banho. Sonicar a suspensão de nanopartículas até nenhum precipitado visível está presente.
  2. Adicionar a solução do passo 3,1-10 ml de solução aquosa de dodecil sulfato de sódio (2,8 mg / ml) em um frasco de vidro de 20 ml com tampas anexadas. Adicionar a suspensão de nanopartículas híbridas primário gota a gota para evitar a mistura das duas fases antes da etapa seguinte.
  3. Sonicar a solução de duas fases, em um banho de ultra-sons, durante 2 horas, seguido por aquecimento num banho de água a 80 ° C durante 10 min. Aguarde até que a solução para esfriar a temperatura ambiente.
    1. Encha de água para a linha de nível operacional do banho de ultra-sons. Centralize o frasco de vidro no banho de ultra-sons. Forma-se um emulsão imediatamente entre as duas fases. Agitar a solução de duas fases com a mão após o início da sonicação; isso facilita a mistura entre a fase que contém nanopartículas híbridos primários e a fase aquosa inferior.
      NOTA: Lembre-se that do sonicador vai aquecer após 2 horas de operação.
  4. Centrifugar a suspensão a 100 nanocluster híbrido xg durante 30 min. Recolhe-se o precipitado e tanto o sobrenadante. Ressuspender o precipitado em 0,1 mM de citrato de sódio 10 min sob ultra-sons. O tamanho esperado das nanopartículas é ~ 180 nm de diâmetro.
  5. Transferir o sobrenadante do passo 3.3 para um novo tubo cónico.
  6. Centrifugar a suspensão a partir do passo 3.4 a 400 xg durante 30 min. Recolhe-se o precipitado e tanto o sobrenadante. Ressuspender o precipitado em 0,1 mM de citrato de sódio 10 min sob ultra-sons. O tamanho esperado das nanopartículas é ~ 130 nm de diâmetro.
  7. Transferir o sobrenadante do passo 3.5 para um novo tubo cónico.
  8. Centrifugar a suspensão a partir do passo 3.6 a 1.500 xg durante 30 min. Recolher o precipitado e ressuspender em citrato de sódio 0,1 mM menos de 10 min de sonicação. O tamanho esperado das nanopartículas é ~ 90 nm de diâmetro.
  9. Adicionar 300 _6, l nanocluster suspensão para um leitor de microplacas de 96 poços para medir um espectro de absorção de UV-Vis-NIR. Queda de 10 mL de suspensão nanocluster em malha de cobre revestido de carbono para TEM imagem.

4. Conjugação de Anticorpos Monoclonais para Nanoclusters

  1. Preparar solução de 100 ul de anticorpo monoclonal (1 mg / ml) em PBS, pH 7,2, por exemplo, anti-Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico 2 (HER2) ou anticorpos anti-factor de crescimento epidérmico receptor 1 (EGFR).
  2. Adicionar a solução de anticorpo a partir do passo 4,1-3,9 ml de HEPES 4 mM, pH 7,2. Centrifugar a solução através de um filtro centrífugo 10 k MWCO em 3250 xg durante 20 minutos a 8 ° C. Ressuspender o anticorpo em HEPES 4 mM, pH 7,2, para um volume final de 100 ul.
    NOTA: Este passo é realizado para substituir o suporte de dados original na solução de anticorpo com HEPES.
  3. Adicionam-se 10 ul de 100 mM NAIO 4-100 ul de solução de anticorpo. Cubra o frasco de reação com um alfolha uminum à TA e mistura-se durante 30 min utilizando um agitador orbital.
  4. Extingue-se a reacção por adição de 500 ul de 1x PBS.
  5. Adicionar 2 ml de solução de ligante de 46,5 mM (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) à solução do anticorpo a partir do passo 4.4 e agita-se durante 1 hora à temperatura ambiente.
  6. Filtrar a solução através de um filtro centrífugo 10 k MWCO em 3250 xg durante 20 minutos a 8 ° C. Ressuspender o anticorpo em 1x PBS, para um volume final de 100 uL, que conduz a uma concentração de anticorpo de ~ 1 mg / ml.
  7. Misturar 100 mL em suspensão nanocluster OD ~ 1,0 com 1 ml de anticorpos modificados a partir do passo 4.6 (1 mg / ml) durante 120 minutos à temperatura ambiente.
  8. Adicionar 10 ul de 10 -3 M de 5 kDa PEG tiol e agitar por 15 min à temperatura ambiente.
  9. Centrifuga-se a solução a 830 x g durante 3 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de 2% w / v de PEG de 5 kDa, em PBS, pH 7,2.
  10. Medir o espectro de absorção das nanopartículas de anticorpo conjugado e comparar a tele absorbância espectro das nanopartículas nuas. Espere alguns nanômetros desvio para o vermelho após a conjugação.
  11. Se as nanopartículas agregar, como mostrado por uma mudança significativa, com um aumento na OD na região do vermelho-NIR, aumentar a concentração de PEG tiol de 5 x 10 -3 M. Além disso, aumentar o tempo de incubação com o tiol de PEG a 30 min e diminui a velocidade da centrífuga, em incrementos de 200 xg.
  12. Para o teste de rotulagem de células cancerígenas, adicione o anticorpo nanopartículas conjugados a partir do passo 4.9 para suspensão de células de câncer no Médio ou 1x PBS (1 ml ~ 10 6 células) e misture por 60 min.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Um esquema para a síntese de nanopartículas magneto-plasmónico immunotargeted é mostrado na Figura 2. Primeiro, magnéticos Fe 3 O 4 nanopartículas de óxido de ferro são sintetizados através do método de decomposição térmica. Em seguida, um a cerca de 1 nm de ouro casca fina é depositado sobre as partículas de núcleo de óxido de ferro, através da decomposição térmica. As nanopartículas híbridos primários cerca de 6 nm servem como sementes para criar nanopartículas ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

As etapas críticas na síntese bem-sucedida de nanopartículas de magneto-plasmônica incluem tornar altamente monodispersos ouro primário shell / núcleo de ferro óxido de nanopartículas e dirigir a auto-montagem das partículas primárias em nanopartículas. A proporção molar entre as partículas primárias e surfactantes desempenham um papel importante na determinação da distribuição do tamanho das nanopartículas. Distribuição de tamanho não uniforme das nanopartículas primárias podem causar a formação de grandes agregados du...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios NIH R01 e R01 EB008101 CA103830.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PYREX Balão de ebulição de fundo redondo de 50 ml com gargalo curto e junta 24/40 [ST]Corning4320A-50Reação de decomposição térmica
PYREX 41 x 300 mm Condensador Allihn de 5 lâmpadas com juntas externas/internas 24/40 [ST]Corning2480-300 Reação dedecomposição térmica
Óleo de siliconeFisherS159-500 Banho deóleo
Agitador de placa quenteCorningPC-351Aqueça o reacton com função de agitação
TermômetroThermoWorks221-092Medir a temperatura
Acetilacetonato de ferro (III)FisherAC11913-0250Material para síntese de nanopartículas híbridas primárias
Ácido oleico 99%FisherA195-500Material para síntese de nanopartículas híbridas primárias
Acetato de ouro (III)FisherAA3974206Material para síntese de nanopartículas híbridas primárias
HexanoFisherH292-1Material para síntese de nanopartículas híbridas primárias
Éter fenílico 99%FisherAC13060-0025Material para síntese de nanopartículas híbridas primárias
1,2-Hexadecanediol 90%Sigma213748-50GMaterial para síntese de nanopartículas híbridas primárias
Oleilamina 70%SigmaO7805-100GMaterial para síntese de nanopartículas híbridas primárias
Dodecil sulfato de sódioFisherBP166-100Síntese de cluster
Citrato de sódio di-hidratadoSigmaW302600Síntese de cluster
Anticorpo monoclonal anti-receptor EGFSigmaE2156Teste de especificidade de marcação celular
Anti-HER2 monoclonal anticorpoSigmaAMAB90627Teste de especificidade de marcação celular
Periodatosódio Sigma311448Região Fc de anticorpos
Ditiolaromatic PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014BLigante heterofuncional para conjugação de anticorpos a nanoclusters
Metoxi-PEG-tiol, 5 kCreative PEGworksPLS-604Passivar a superfície de ouro restante após a conjugação do anticorpo
Unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 com membrana Ultracel-10MilliporeUFC801008Purificação de proteínas
HEPESSigmaH3375Buffer
PBS, 1x soluçãoFisherBP2438-20Buffer
UV-Vis espectroscopiaBioTek Synergy HTObter espectro
CentrífugaEppendorf5810RMicroscópio
Eletrônico de Transmissão de SeparaçãoFEITECNAI G2 F20 X-TWINObter morfologia de nanoestruturas
Microscópio verticalLeicaDM6000Obter imagens de campo escuro
SonicatorBranson1510Sonicação
Filme de carbono 300 mesh placa de leitura
UV-VisCorning09-761-14596 poços
de de imagem TEM com de grade

Referências

  1. Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
  2. Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002(2013).
  3. Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
  4. Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
  5. Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
  6. Qu, M., et al. Magneto-photo-acoustic imaging. Biomedical optics express. 2, 385-396 (2011).
  7. Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41(2010).
  8. Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
  9. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
  10. Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101(2007).
  11. Yu, H., et al. Dumbbell-like bifunctional Au-Fe3O4 nanoparticles. Nano letters. 5, 379-382 (2005).
  12. Wang, L., et al. Monodispersed core-shell Fe3O4@Au nanoparticles. The journal of physical chemistry. B. 109, 21593-21601 (2005).
  13. Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
  14. Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
  15. Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
  16. Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Nanopartículas MagnetoplasmônicasNúcleo de Óxido de FerroDeposição de Casca de OuroMicroemulsão Óleo-ÁguaConjugação de AnticorposImagem de Campo EscuroAbsorbância no Infravermelho PróximoCélulas Tumorais CirculantesImagem Molecular MultimodalTerapia Fototérmica
Síntese de Immunotargeted magneto-plasmónico Nanoclusters
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.