Artigo de método

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

DOI:

10.3791/52095

⸱

18 de novembro de 2014

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe amplamente conservada de moléculas reguladoras. Aqui descrevemos um método de clonagem de miRNA que se baseia em duas etapas de ligação potentes seguidas de sequenciamento de alto rendimento. Nosso método permite a quantificação precisa de miRNAs em todo o genoma.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mirna clonagem e sequenciamento de alto rendimento, denominada miR-Seq, assume-se como uma abordagem ampla transcriptoma quantificar miRNAs com resolução de nucleotídeo único. Esta técnica de captura miARNs, anexando os adaptadores 3 'e 5' de oligonucleótidos para moléculas de miARN e permite a descoberta de novo miARN. Acoplamento com plataformas de sequenciamento de próxima geração poderosos, miR-Seq tem sido fundamental para o estudo da biologia miRNA. Contudo, desvios significativos introduzidas por passos de ligação de oligonucleótidos têm impedido o miR-SEQ de ser empregado como uma ferramenta de quantificação precisa. Os estudos anteriores demonstram que polarizações em métodos de miR-Seq actuais conduzem frequentemente a quantificação imprecisa miARN com erros de até 1.000 vezes superior para algumas miARNs 1,2. Para resolver estes preconceitos, transmitidas por meio de ligação de ARN, temos desenvolvido um método de ligação de ARN pequenas que resulta em eficiências de ligação de mais de 95% tanto para 3 'e 5' etapas de ligação. O benchmarking este improvou método de construção da biblioteca utilizando miARNs equimolares sintéticos ou mistos diferencialmente, produz consistentemente lê números com desvio inferior a duas vezes a partir do valor esperado. Além disso, essa alta eficiência método miR-Seq permite preciso de todo o genoma miRNA perfil de in vivo total de amostras de RNA 2.

Introdução

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Metodologias baseadas em alta capacidade de sequenciamento têm sido amplamente aplicada em muitas amostras biológicas nos últimos anos em expandir muito a nossa compreensão da complexidade molecular de sistemas biológicos 3,4. No entanto, a preparação de amostras de RNA de high-throughput seqüenciamento muitas vezes transmite preconceitos específicos inerentes à metodologia empregada, o que limita a utilidade potencial destas técnicas poderosas. Estes método específico polarizações ter sido bem documentado para preparações de biblioteca, de pequena ligadura de ARN baseado em 1,2,5,6. Estes preconceitos resultar em variação mil vezes na lê números de miRNAs sintéticos equimolares, fazendo inferência de abundância miRNA a partir de dados de sequenciamento descontroladamente variável e sujeito a erros.

Os estudos focam as propriedades de ligases T4 RNA derivadas de fagos têm documentado que as enzimas exibem preferências à base de nucleótidos 7, que se manifestam como bibliotecas enviesados ​​em experiências de sequenciação de alto rendimento 1,2,8. A fim de minimizar os preconceitos transmitidos por ligases RNA, várias estratégias têm sido empregadas; macromolecular aglomerando 9, randomizando a sequência de nucleótidos do adaptador que é proximal em relação ao local de ligação 6, e empregando concentrações elevadas de adaptador de ligação 2. Através de uma combinação destes três abordagens temos desenvolvido um fluxo de trabalho para a preparação isenta de bibliotecas de ARN pequenas compatíveis para a sequenciação de alto rendimento (Figura 1). Para comparações diretas entre os protocolos atuais e nosso método otimizado, por favor consulte o nosso recente relatório 2. Este método produz optimizado eficiências de ligação de mais de 95% em ambas as 3 'e 5' etapas e permite a ligação isenta de moléculas de ARN a partir de pequenas amostras biológicas sintéticas e 2.

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Protocolo

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NOTA: É crítico para manter condições isentas de RNase durante todo o procedimento.

1. adenilação de 3 'Linker

  1. Diluir oligonucleótido de ADN concebidos para reacções 3 'de ligação para 100 uM em meio livre de nuclease de H 2 O.
    NOTA: O oligonucleótido deve ter um 'grupo fosfato, um dinucleótido randomizados no terminal 5' 5 fim, e um "3 didesoxicitosina. A 5 'grupo fosfato é um requisito da enzima Mth para eficiente 5' 10 adenilação. O fosfato pode ser adicionado ao pré-tratamento do oligonucleótido com um polinucleótido-quinase, ou encomendado com a modificação directa. O dinucleótido randomizado na extremidade 5 'é importante para minimizar a preferência ligases de ARN que exibem determinados para-extremidade final juntando reacções sobre os outros seis sequência. A 3 'didesoxicitosina coloca um elemento de bloqueio na extremidade 3' do oligonucleótido to inibir a formação de concatâmeros ligante-ligante durante os passos de ligação subsequentes e também serve para bloquear 'extremidade da molécula de miARN-Ligante formada na extremidade de 3' da reacção de ligação 3 11. A sequência de oligonucleótido ligante escolhido para o método de miR-Seq imparcial é como se segue: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '.
  2. Montar o seguinte reacção adenilação: 200 pmol 3 'oligonucleótido ligante, 4 ul 10x 5' tampão de adenilação de ADN, ATP 1 mM de 4 ul, 4 ul de RNA-ligase Mth, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 40 ul.
  3. Incubar reacção a 65 ° C durante 1 hora. Terminar a reacção por aquecimento a 85 ° C durante 5 min.
  4. Precipitar ligante adenilada pela adição de 2,5 volumes de etanol a 100% e 1/3 volume de 10 M de acetato de amónio para remover o ATP residual e para evitar imprevistos em ligaduras reacções futuras.
    1. Resumidamente, misture o alcohol, sal, oligo e solução até à homogeneidade, girando à velocidade máxima numa microcentrífuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C durante 20 min. Lavou-se a pelota em etanol a 70%, ar seco, e ressuspender em um volume apropriado de livre de nuclease H 2 O para dar 50-100 uM de oligo adenilada.
  5. Confirme adenilação executando um gel de poliacrilamida 18%.
    1. Prepare o gel por mistura do seguinte em conjunto: 6,3 g de ureia, 6,75 ml de 40% de acrilamida, e 1,5 ml de 10x TBE. Adicionar H2O a 15 ml.
    2. Misturar até que a ureia é completamente dissolvido e adicionar 150 ul 10% (w / v) de persulfato de amónio (APS) e 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED).
    3. Depois gel definiu, pré-corrida por 30 minutos a 24 V / cm de largura com gel TBE 1x tampão de corrida à temperatura ambiente. Depois de 30 minutos é de até poços lave com tampão de corrida.
    4. Misturar 5 pmol de oligonucleótidos adenilada e com igual volume de tampão de carga desnaturante ARN 2x (95% (v / v) de formamida,0,02% (w / v) de SDS, 0,02% de azul de bromofenol (w / v), 0,01% (w / v), xileno cianol, EDTA 1,0 mM), o calor rapidamente para 75 ° C, e SNAP arrefecida em gelo. Dispensar amostra inteira dentro do poço do gel. Também incluem uma quantidade idêntica de controle não-adenilada e baixos padrões de tamanho peso molecular.
    5. Submeter o gel a 24 V / cm até o azul de bromofenol é ¾ do caminho para o fundo do gel. Desmonte aparelho, gel pós-mancha com uma solução de SYBR-gold 1x em 1x TBE e visualizar na caixa UV-transilluminator (Figura 2).
      NOTA: Gel purificar o oligo adenilada de um modo semelhante ao descrito acima, se "nenhum ARN de entrada" controles estão resultando numa elevada quantidade de produto de PCR, em comparação com amostras com níveis de ARN de entrada.

2. Ligador Ligadura para 3 'Fim da miARN

  1. 3 'Ligadura
    1. Montar os seguintes componentes em gelo, na ordem indicada: 1,0 ul de 50% (w / v) de PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x tampão de ligase de RNA (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenilada 3 'Ligante (100 uM), 0,5 ul de inibidor de RNase, 0,5-8,0 ug de RNA total, 0,5 ul de RNA-ligase de T4 2, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 5 mL.
    2. Misturar por pipetagem a reacção como a solução é demasiado viscoso para vórtice, devido à alta concentração de PEG 8000. Uma vez cuidadosamente misturado, coloque a reacção num termociclador com uma tampa aquecida. Definir o bloco a 16 ° C, e incubar durante 4 horas.
      NOTA: A reacção pode ser dimensionado para um volume final de 20 ul, sem qualquer perda na eficiência da ligação. Reagir durante 4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, para se obter eficiências de ligação essencialmente idênticos.
  2. Gel Purificação
    1. Após 3 'ligadura, misturar a mistura reaccional com um volume igual de 2x tampão de carga de ARN. Aquece-se a 70 ° C durante 5 min, e encaixe fria em gelo.
    2. Correr a amostra num gel de poliacrilamida a 15% para a purificação PAGE.
      1. Prepare-se um gel de poliacrilamida a 15% contendo ureia 7 M, de um modo semelhante ao descrito anteriormente no passo 1.5.
      2. Pré-correr o gel a 24 V / cm de largura do gel para, pelo menos, 30 min. Desligue a alimentação, lavar poços, amostra de carga e gel corrida em mesma tensão como pré-corrida.
      3. Coloque a amostra e execute a página até o azul de bromofenol acaba de sair o gel. O produto desejado migrará perto do cianol xileno.
  3. Coloração, visualização e Excisão
    1. Desmonte aparelho de gel e coloque gel na bandeja limpa com 1x tampão de corrida (TBE), 1x SYBR-ouro e pedra para 15 min.
    2. Retire o gel da coloração prato e visualizar na caixa transiluminador UV coberta com filme plástico limpo. O produto de ligação deve ser cerca de 45 nucleótidos de comprimento.
    3. Impostos especiais de consumo da região que contém o produto da ligação com uma razo limpor lâmina e coloque em 0,5 ml tubo micro-centrífuga.
  4. Isolamento produto e precipitação
    1. Pierce fundo do tubo 0,5 ml de microcentrífuga com uma agulha de 30 G e colocar o tubo perfurado em um segundo limpo, baixa retenção, 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 5 min a 15.000 x g ~.
    2. Visualmente confirmar que toda a fatia de gel foi movido através do furo no tubo interior. Se necessário, use uma ponta de pipeta limpa para empurrar alguns fragmentos de gel mais perto do buraco.
    3. Descartar o tubo vazio de 0,5 ml e adicionar 400 ul de tampão de coluna de alto teor salino (HSCB NaCl 400 mM, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, SDS a 0,1%) para a pasta de acrilamida. Tubo (s) de rocha, a 4 ° C durante a noite.
    4. Transferência de lodo a uma coluna de rotação de acetato de celulose de 0,22 micron, com uma pipeta de ponta de todo o furo. Centrifugar durante 3 minutos à temperatura ambiente em ~ 15.000 xg para recolher todo o líquido para longe da matriz de gel de acrilamida.
    5. Transferir o líquido para um, de baixa retenção limpo, tubo de 1,5 ml contering 1 ml de 20 mg / ml de glicogênio. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Misturar a solução por inversão do tubo várias vezes e precipitar no freezer -80 ° C durante 20 min.
    6. Centrifugar a plena velocidade a 4 ° C durante 20 min para sedimentar o ácido nucleico. Remover o sobrenadante e lava-se em etanol a 70%. Ar sedimento seco durante 10 min à temperatura ambiente e seguir directamente a 5 'passo de ligação.

3. Ligador Ligadura para 5 'Fim da miARN-3' Ligador híbrido

  1. Para o ácido nucleico sedimentadas, adicionar os seguintes componentes: 2 uL de PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul de RNA-ligase 10x Tampão, 0,5 ul de ATP (10 mM), 0,5 ul de RNA-NN oligo (100 uM), e H 2 O para um volume final de 4 mL.
    NOTA: A composição do 'oligo NN-ARN "é como se segue 5'-didesoxi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 invertido' e foi purificado por HPLC pelo fabricante.
  2. Misturaresta amostra por pipetagem cima e para baixo repetidamente. Fazer isso há algum tempo (até 5 minutos), para assegurar que o sedimento foi completamente re-solubilizado. Se a re-solubilização é problemático, aquecer a amostra brevemente (3-5 min) a 37 ° C e retomar pipetagem para misturar.
  3. Uma vez que o sedimento é de volta em solução, transferir o conteúdo para um tubo limpo de PCR contendo 1 ml de uma mistura 1: 1 de inibidor de RNase e T4 RNA ligase 1 (5 unidades). Novamente misture por pipetagem cima e para baixo.
  4. Incubar a reacção num termociclador a 37 ° C durante 4 h. Prosseguir imediatamente para a síntese de cDNA.

4. Transcrição Reversa / cDNA Synthesis

  1. Adicionar os seguintes componentes para a 5 'da reacção de ligação: 2 ul de tampão 5x RT, 0,75 ul de DTT 100 mM, 1 ul Iniciador RT Ilumina-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA 5'-3' (1 uM), e 0,5 ul de dNTPs (10 mM).
  2. Misturar por pipetagem e aquecer a 65 ° C durante 5 min. Em seguida, resfriar lentamente no banco top.
  3. Depois da reacção ter arrefecido até à temperatura ambiente, coloque o tubo em gelo e adicionar 0,5 ul de cada enzima transcriptase inversa e um inibidor de RNase. Misturar por pipetagem, e colocados no termociclador para o passo de extensão indicado nas instruções do fabricante.
  4. Uma vez completa suplemento de 5 ul livre de nuclease H2O para levar o volume final da biblioteca de cDNA até 15 ul.

5. Preparação Biblioteca

  1. Para a indexação de PCR, montar a seguinte reacção em gelo: 6 ul de 5x Tampão Phusion, 1 ul de dNTPs (10 mM), 0,9 ul de DMSO, 0,75 ul 5 'iniciador (25? M), 0,75 ul iniciador 3' (25? M), biblioteca de cDNA de 3 ul (concentração variável, dependendo da quantidade de entrada), 0,5 ul Phusion polimerase (1 unidade), isento de nuclease de H 2 O para um volume final de 30 ul. Escolha as seqüências de primers para garantir a compatibilidade com o modelo ea plataforma de sequenciamento deescolha.
    1. Executar a reacção de PCR com as seguintes definições: desnaturação inicial a 98 ° C durante 3 minutos, durante os primeiros 4 ciclos, desnaturar a 98 ° C durante 15 seg, recozimento a 50 ° C durante 15 seg, estender a 72 ° C durante 15 seg .
      NOTA: Dependendo da quantidade de material de entrada, variar o total de números de ciclos de PCR. Tipicamente, para uma entrada de 1-2 ug de RNA total, 13 ciclos de PCR no total são suficientes para gerar a biblioteca de miR-Seq.
    2. Realizar os ciclos subsequentes, por exemplo, ciclos de 5-12, de um modo em duas etapas, onde os ciclos de recozimento e de extensão são combinados e realizados a 70 ° C durante 30 seg e desnaturação é novamente 98 ° C durante 15 seg.
      NOTA: O volume de reacção é de 30 uL para permitir a pausa do programa de PCR e remover uma alíquota de 10 ul em números de ciclos pré-determinados para monitorizar a aparência do produto desejado. Tipicamente, os ciclos de 10, 13, e 16 são escolhidos para o teste a partir de uma amostra de ARN total.
  2. Preparara 8% não desnaturante em gel de acrilamida por mistura de 2 ml de 40% de acrilamida, 1 ml de 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Em seguida, adicione 100 ml de 10% de APS e 10 ml de TEMED. Despeje gel e deixe set.
    1. Pré-correr o gel a 12 V / cm de largura de gel durante 30 min. Poços flush. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de 10x (15% de Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) de SDS, 0,01% (w / v) de azul de bromofenol), adicionar 10 ul de amostra a cada poço de dimensões 5 milímetros x 1 mm x 15 milímetros. Normalmente, cada poço pode carregar até 30 l de amostras. Executar o gel de amostra a 10 V / cm de largura de gel em tampão 1 x TBE até que o corante azul de bromofenol apenas corre para fora do fundo do gel.
    2. Mancha e visualizar gel como descrito no passo 2.3.
    3. Excisar o par de banda de base 146 e elui-se durante a noite em 0,25 mL de HSCB de uma forma similar ao que é descrito na secção 2.4. Precipitar o DNA num volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Lavar o granulado em 70% eThanol e ressuspender em tampão TE.
    4. Quantificar a biblioteca usando PicoGreen de acordo com as recomendações do fabricante.

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Resultados

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Os resultados esperados para o método anterior deve, inicialmente, ser observação de uma única troca de nucleótidos (aumento) no tamanho do oligonucleótido de ADN que foi sujeita a adenilação por Mth RNA ligase (Figura 2). Após 3 'ligadura, a visualização do gel de acrilamida indica (ver Figura 3) bandas de peso molecular elevado afiadas evidentes na região de nucleótidos 100-300 do gel. Isto indica que a amostra de ARN total a ser utilizado é de alta qualidade (não degradado)....

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Discussão

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A metodologia aqui descrita faz uso de diversas variáveis-chave para maximizar a eficiência de ligação, ou seja, altas concentrações de PEG, o uso de ligantes randomizados, e alta concentração de ligantes 2,6,9. Esta abordagem permite que bibliotecas de sequenciamento de forma confiável quantitativos a partir de amostras de RNA total de 2. Nós conduzimos várias titulações de ARN de entrada e concluíram que a metodologia anterior é o mais adequado para quantidades de ARN total na gama de 1-8 ug (dad...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Yi, especialmente Zhaojie Zhang, pelas discussões frutíferas sobre o design do linker e as eficiências de ligação, bem como à American Cancer Society por apoiar este trabalho por meio de uma bolsa de pós-doutorado (# 125209) para J.E.L. A pesquisa relatada nesta publicação também foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio R01AR059697 (para R.Y.) e uma bolsa de pesquisa do Instituto Linda Crnic para Síndrome de Down. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3' Linker (5' fosforilado, 3' bloqueado)Integrated DNA Technologiespersonalizado
5' LinkerIntegrated DNA Technologiespersonalizado5' bloqueado, HPLC purificado
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351SEspecializado para ligação de adaptadores de DNA pré-adenilados
10x Ligation buffer (sem ATP)New England BiolabsIncluído com M0351S
10x Tampão de ligação (com ATP)New England BiolabsIncluído com M0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
Polietilenoglicol (mol. Wt. 8.000)New England BiolabsIncluído com M0204L
Água livre de nucleaseAmbionAM9937Descobrimos que a água coletada de um aparelho de destilação é de qualidade equivalente.
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT kitInvitrogen18080-051 
Kit de PCR PhusionNew England BiolabsM0530S
Illumina RP1 primerDNATechnologiespersonalizado Informações de sequência disponíveis no
Illumina Illumina RT primerDNApersonalizadoInformações de sequência disponíveis no
Illumina Illumina Index primer(s)Technologies personalizadoInformações de sequência disponíveis na Illumina
40% AcrilamidaFisher ScientificBP14081
UreiaSigma AldrichU6504
Persulfato de amônioSigma AldrichA3678
Tetrametilenodiamina (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x Tampão de carregamento de RNA desnaturanteNew England BiolabsIncluído com M0351S
Lâminas de barbearVWR55411-050
SpinX Tubos CentriconCostarCLS8161
Tubos de microfífugas de baixa retençãoFisher Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
Kit de adenilaçãoNew England BiolabsE2610L
Integrated Integrated Technologies integrado DNA

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Etiquetas

Liga o de Pequenos RNAAdaptadores de Oligonucleot deosM todo miR SeqEfici ncia de Liga o de RNAPurifica o em GelS ntese de cDNARea o em Cadeia da PolimerasemiRNAs Sint ticos

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