Artigo de método

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

DOI:

10.3791/52104

⸱

11 de novembro de 2014

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são utilizados clinicamente para o tratamento de transplante para reconstruir o sistema hematopoiético de um paciente em muitas doenças, tais como leucemia e linfoma. Elucidação dos mecanismos que controlam HSCs auto-renovação e diferenciação é importante para a aplicação de HSCs para a pesquisa e usos clínicos. No entanto, não é possível obter grande quantidade de HSCs, devido à sua incapacidade para proliferar in vitro. Para superar este obstáculo, foi utilizada uma linha de células derivadas da medula óssea do rato, a linhagem de células EML (eritróide, mielóide e linfóide), como um sistema modelo para este estudo.

RNA-seqüenciamento (RNA-Seq) tem sido cada vez mais usado para substituir microarray para estudos de expressão gênica. Nós relatamos aqui um método detalhado do uso da tecnologia de RNA-Seq para investigar os possíveis fatores-chave na regulação da célula EML auto-renovação e diferenciação. O protocolo fornecido neste artigo está dividido em três partes. O primeiro part explica como a cultura de células de EML e separado Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. A segunda parte do protocolo oferece procedimentos detalhados para a preparação total de RNA ea construção da biblioteca para posterior de alto rendimento de sequenciamento. A última parte descreve o método para análise de dados de RNA-Seq e explica como usar os dados para identificar fatores de transcrição diferencialmente expressos entre Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. Os fatores de transcrição mais significativamente diferencialmente expressos foram identificados como sendo os possíveis reguladores chave que controlam as células EML auto-renovação e diferenciação. Na discussão deste trabalho, destacamos as principais etapas para um desempenho de sucesso desta experiência.

Em resumo, este trabalho oferece um método de usar a tecnologia de RNA-Seq para identificar potenciais reguladores de auto-renovação e diferenciação em células EML. Os principais fatores identificados são submetidos à análise funcional jusante in vitro e in vivo.

Introdução

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As células estaminais hematopoiéticas são células sanguíneas raras que residem principalmente no nicho da medula óssea de adultos. Eles são responsáveis ​​pela produção de células necessárias para a reconstituição do sangue e os sistemas imunitários 1. Como um tipo de células estaminais, HSCs são capazes de tanto a auto-renovação e diferenciação. Elucidar os mecanismos que controlam a decisão destino de HSCs, direção ou auto-renovação ou diferenciação, vai oferecer orientações valiosas sobre a manipulação de HSCs para pesquisas de doenças de sangue e uso clínico 2. Um problema enfrentado pelos pesquisadores é que HSCs podem ser mantidas e expandidas in vitro de forma muito limitada; a grande maioria dos seus descendentes são parcialmente diferenciadas em cultura 2.

A fim de identificar os principais reguladores que controlam os processos de auto-renovação e diferenciação em uma escala de todo o genoma, foi utilizada uma linha primitiva de células progenitoras hematopoiéticas do rato EML como um sistema modelo. Thé A linha celular foi derivada a partir de 3,4 medula óssea de murino. Quando alimentados com diferentes factores de crescimento, as células podem diferenciar-se em EML eritróide, mielóide, e células linfóides in vitro, 5. É importante notar que esta linhagem celular pode ser propagada em grande quantidade no meio de cultura contendo factor de células estaminais (SCF) e ainda reter a sua multipotencialidade. Células EML podem ser separados em subpopulações de auto-renovação Lin-SCA + CD34 + e parcialmente diferenciadas células Lin-SCA-CD34 @ com base em marcadores de superfície CD34 e SCA 6. Semelhante a curto prazo HSCs, SCA + CD34 + células são capazes de auto-renovação. Quando tratados com células CD34 + SCF, Lin-SCA + pode regenerar rapidamente uma população mista de células CD34 + e Lin-SCA-CD34 @ Lin-SCA + e continuam a proliferar 6. As duas populações são semelhantes na morfologia e têm níveis semelhantes de ARNm de c-kit e proteína 6. Células Lin-SCA-CD34 @ são capazes de propagar em meios contendo IL-3 em vez de SCF 3. Unveiling principais reguladores da EML decisão destino celular vai oferecer melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares em transição inicial de desenvolvimento durante a hematopoiese.

A fim de investigar as diferenças moleculares subjacentes entre a auto-renovação de células Lin-SCA-CD34 @ parcialmente diferenciados Lin-SCA + CD34 + e, usamos RNA-Seq para identificar genes diferencialmente expressos. Em particular, vamos nos concentrar em fatores de transcrição, como fatores de transcrição são cruciais na determinação do destino da célula. RNA-Seq é uma abordagem desenvolvida recentemente, que utiliza as capacidades de sequenciamento de próxima geração (NGS) tecnologias para o perfil e quantificar RNAs transcritos do genoma 7,8. Em resumo, o ARN total é poli-A e fragmentada seleccionado como o modelo template.The ARN inicial é então convertido em cDNA usando transcriptase reversa. De modo a mapear full-length transcritos de ARN, utilizando, ARN não degradado intacta para a construção da biblioteca de cDNA é importante. Para o purrepresentar de sequenciamento, as sequências adaptadoras específicos são adicionados a ambas as extremidades do cDNA. Em seguida, na maioria dos casos, as moléculas de ADNc são amplificados por PCR e sequenciado de uma forma de alto rendimento.

Após o seqüenciamento, a resultante leituras podem ser alinhados com um genoma de referência e um banco de dados de transcriptoma. O número de leituras que mapeiam para o gene de referência é contada e essa informação pode ser usada para estimar o nível de expressão do gene. A lê também podem ser montados, de novo sem um genoma de referência, permitindo que o estudo de transcriptomes em organismos modelo não-9. Tecnologia de RNA-seq também tem sido usado para detectar as isoformas de splicing, 10-12 novos transcritos 13 e 14 fusões de genes. Em adição à detecção de genes codificadores de proteínas, o RNA-Seq também pode ser usada para detectar e analisar romance nível de transcrição de RNAs não-codificantes, tais como longa não codificante de ARN 15,16, microARN 17, 18, ​​etc siRNA. Por causa de tele precisão deste método, tem sido utilizado para a detecção de variações de nucleótidos simples 19,20.

Antes do advento da tecnologia de RNA-Seq, microarray foi o principal método utilizado para analisar o perfil de expressão do gene. Pré-concebidas sondas são sintetizados e subsequentemente ligado a uma superfície sólida para formar uma lâmina de microarray 21. ARNm é extraído e convertido em cDNA. Durante o processo de transcrição reversa, os nucleótidos marcados com fluorescência são incorporados no cDNA e o cDNA pode ser hibridado nas lâminas de microarray. A intensidade do sinal recolhido a partir de um ponto específico depende da quantidade de ADNc de ligação com a sonda específica naquele ponto 21. Em comparação com a tecnologia de RNA-Seq, microarray tem várias limitações. Primeiro, microarray confia no conhecimento pré-existente de anotação de genes, enquanto a tecnologia de RNA-Seq é capaz de detectar novas transcrições em alto nível de fundo relativa, o que limita a sua utilização quando a GEnível de expressão ne é baixo. Além disso, a tecnologia de RNA-Seq tem muito maior alcance dinâmico de detecção (8.000 vezes) 7, que, devido ao fundo e saturação dos sinais, a precisão de microarray é limitado para ambos os genes altamente expressos e humilde 7,22. Finalmente, as sondas de microarranjo diferem em suas eficiências de hibridização, que tornam os resultados menos confiáveis ​​quando se comparam os níveis de expressão relativos de diferentes transcritos dentro de uma amostra de 23. Embora RNA-Seq tem muitas vantagens sobre microarranjo, a análise de dados é complexo. Esta é uma das razões que muitos pesquisadores ainda usam microarray em vez de RNA-Seq. Várias ferramentas de bioinformática são necessários para o processamento de dados de RNA-Seq e análise 24.

Entre vários sequenciamento de próxima geração (NGS) plataformas, 454, Illumina, SOLID e Ion Torrent são os mais utilizados. 454 foi a primeira plataforma de NGS comercial. Em contraste com as outras plataformas de sequenciaçãocomprimento como illumina e sólida, a plataforma 454 gera mais ler (em média 700 base de leituras) 25. Lê mais são melhores para a caracterização inicial de transcriptiome devido à sua maior eficiência montar 25. A principal desvantagem da plataforma 454 é o seu custo elevado por megabases de sequência. A Illumina e plataformas SÓLIDOS gerar lê com aumento e comprimentos curtos. O custo por megabases de sequência é muito mais baixa do que a plataforma 454. Devido ao grande número de curta lê para a Illumina e plataformas SÓLIDOS, análise de dados é muito mais computacionalmente intensivo. O preço do instrumento e reagentes para sequenciamento para a plataforma Ion Torrent é mais barato eo tempo de seqüenciamento é mais curto 25. No entanto, a taxa de erro e o custo por megabases de sequência são mais elevados em comparação com o Ilumina e plataformas SÓLIDOS. Plataformas diferentes têm suas próprias vantagens e desvantagens e exigem métodos diferentes para análise de dados. O plaTForm deve ser escolhido com base na finalidade de seqüenciamento e da disponibilidade de financiamento.

Neste artigo, tomamos plataforma Illumina RNA-Seq como um exemplo. Utilizou-se EML célula como um sistema modelo para investigar os reguladores-chave na EML celular auto-renovação e diferenciação, e fornecida uma métodos detalhados de construção da biblioteca de ARN-Seq e análise de dados para o cálculo do nível de expressão e detecção de novo transcrito. Temos mostrado na nossa publicação anterior que estudo RNA-seq no sistema modelo EML 2, quando acoplado com teste funcional (por exemplo, shRNA knockdown) proporcionar uma abordagem poderosa para compreender o mecanismo molecular dos primeiros estágios de diferenciação hematopoiética, e pode servir como um modelo para a análise de células de auto-renovação e diferenciação em geral.

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Protocolo

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1. EML cultura de células e separação das células CD34 + Lin-Lin e-CD34 @ Usar celular Magnetic Classificando Sistema e fluorescência-ativado celular método de classificação

  1. Preparação de bebê de rim de hamster (BHK) meio de cultura de células-tronco para coleta de fator de célula:
    1. Cultura de células BHK em meio DMEM contendo 10% de FBS em balão de 25cm 2 (Tabela 1), a 37 ° C, 5% de CO 2 num incubador de cultura de células.
    2. Quando as células crescem até 80 - 90% de confluência, lave as células uma vez com 10 ml de PBS. Adicionar 5 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% para a monocamada e incubar as células durante 1-5 minutos à temperatura ambiente (RT) até que as células são separadas.
    3. Pipeta a solução para cima e para baixo com cuidado para quebrar aglomerados de células. Adicionar 5 ml de DMEM completo ao frasco para parar a actividade de tripsina. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à TA.
    4. Remover o meio e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de BHK frescas meio de cultura celular. Transferência de 2 ml da suspensão de células a partir do passo 1.1.4 para um novo frasco de 75 cm2 e adicionar 48 ml de meio de cultura fresca de células BHK para o balão.
    5. Cultura as células BHK para dois dias e recolher o meio de cultura. A passagem do meio através de um filtro de 0,45 um. Armazenar a forma de -20 ° C até à sua utilização.
  2. EML cultura de células:
    1. Culturas de células em suspensão (EML) em meio básico EML contendo meio de cultura de células BHK (Tabela 1), a 37 ° C, 5% de CO 2 num incubador de cultura de células.
    2. Manter as células EML a baixa densidade celular (0,5-5 x 10 5 células / ml) com o pico de densidade inferior a 6 5 x 10 células / ml. Dividir as células a cada 2-3 dias, na proporção de 1: 5. Células passagem EML suavemente e descartar a cultura após passaging por 10 gerações.
  3. Depleção de células positivas linhagem:
    1. Colher as células por centrifugação a EML 200 xg for 5 min e lava-se as células uma vez com PBS. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min.
    2. Ressuspender as células com PBS e contagem das células com um hemocitómetro. Determinar a concentração de anticorpos no passo subsequente de separação de células de acordo com o número de células (por favor consulte as instruções proporcionadas pelo fornecedor do sistema de isolamento de células).
    3. Isolar a linhagem negativa (Lin) usando células de cocktail de anticorpos linhagem (cocktail de anticorpos monoclonais conjugados com biotina-CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 e Ter-119 ) e um sistema de triagem celular activado magnética de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Separação de células CD34 + Lin-e Lin-CD34 @:
    1. Girar as células Lin @ a partir do passo 1.3.3 a 200 xg durante 5 min. Ressuspender o sedimento de células com PBS e contagem das células com um hemocitómetro.
    2. Lavar as células duas vezes com tampão FACS e sedimentar as células a 200 xgdurante 5 min.
    3. Rotular cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml com o número 1, 2, 3, 4, 5, respectivamente. Ressuspender as células com tampão de SCAF 100 ul por 10 6 células (10 6 células por tubo).
    4. Adicionar 1 mg de anticorpo anti-CD34 FITC do rato para o tubo 1 e o tubo 2 e misturar os tubos suavemente.
    5. Incubar todos os tubos a 4 ° C durante 1 hora no escuro.
    6. Adicionar 0,25 g de anticorpo anti-Sca1 conjugado com PE e 20 ul de anticorpos Linhagem cocktail de APC-conjugado a um tubo, de 0,25 ug de anticorpo conjugado com PE anti-Sca1 de tubo 3, e 20 ul de anticorpos Linhagem cocktail de APC-conjugados aos tubo 4.
    7. Misturar todos os tubos suavemente e incuba-se as células a 4 ° C durante mais 30 min no escuro.
    8. Adicionar 300 ul de tampão de FACS e as células para girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min.
    9. Lavam-se as células com 500 ul de tampão de FACS para três vezes.
    10. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de FACS buffer.
    11. Use as células em tubos de 2, 3, 4 e 5 para a criação de uma compensação. Isolar células Lin-SCA + CD34 + e Lin-SCA-CD34 @ em tubo 1 usando FACS Aria.

2. RNA Preparação e Biblioteca Construção de alta capacidade Sequencing

  1. Isolamento, análise de qualidade e quantificação de RNA:
    1. Extrair o RNA total a partir de Lin-CD34 + e células Lin CD34 @, respectivamente, utilizando-TRIzol seguindo o protocolo fabrica '.
    2. Remover o ADN utilizando desoxirribonuclease contaminado I (ADNase I), seguindo o protocolo do fabricante. Opcionalmente, o RNA armazenar a -80 ° C nesta etapa para utilização posterior.
    3. Avaliar a qualidade do RNA total utilizando Bioanalyzer de acordo com as instruções proporcionadas pelo fornecedor. Use amostra de RNA com RNA Integrity Number (RIN) lager do que 9.
  2. Biblioteca de Construção e de alto rendimento seqüenciamento:
    NOTA: Este protocolo descreve RNA-Seq utilizando a plataforma Illumina. Poroutras plataformas de sequenciamento, são necessários diferentes métodos de preparação da biblioteca.
    1. Use 0,1-4 ug de RNA total de alta qualidade por amostra para a preparação da biblioteca. Normalmente 2 ug de RNA total pode ser extraído a partir de células 10 5 EML.
    2. Use um sistema de preparação de amostras RNA-seqüenciamento para purificação de RNA e fragmentação, primeira e segunda síntese de cDNA, reparação final, 3 'adenilação, adaptador de ligação e amplificação por PCR, seguindo os procedimentos padrões detalhados de instruções do provedor.
      1. Positivamente seleccionar poliA do mRNA usando oligo-dT esferas magnéticas e fragmentar o ARNm.
      2. Realizar a transcrição inversa utilizando iniciadores aleatórios para obter o cDNA e subsequentemente sintetizar a segunda cadeia de ADNc para gerar ADNc em cadeia dupla.
      3. Retirar as saliências 3 'e preencher a 5' salientes por polimerase de DNA. Adenilato extremidades 3 'para evitar a ligação de fragmentos de cDNA a partir de um para o outro.
      4. Adicionar adaptadores de indexação multiplex para ambas as extremidades do dscDNA. Executar PCR para o enriquecimento de fragmentos de ADN.
    3. Medir a A260 / A280 para obter informação sobre a concentração da biblioteca utilizando um espectrofotómetro.
    4. Avaliar a qualidade biblioteca e medir o intervalo de tamanho de fragmentos de ADN utilizando um Bioanalyzer.

Análise 3. Os dados

Para referência do software utilizado nesta parte, consulte (Tabela 2).

  1. Processamento de arquivos de dados para análise a jusante:
    1. Converta .bcl (arquivo chamada base) arquivar a .fastq arquivo usando o software casava (Illumina, versão 1.8.2).
      1. Fogo até o "Terminal" no sistema Linux. Vá para a pasta de dados que contém o arquivo de dados a partir de uma máquina de sequenciamento Illumina HiSeq2000. Suponha que a pasta resultado é 'NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /', tipono comando na Figura S1A, e entrar na pasta de dados.
      2. Instale casava 1.8.2 no sistema Linux. Suponha que o outputfolder é 'Unaligned ", use o comando na Figura S1B para preparar o arquivo de configuração para a conversão. Use a opção --fastq-cluster-contagem de 0 a garantir apenas um arquivo .fastq é criada para cada amostra. O arquivo gerado é .fastq em formato .gz. Descompactá-lo para análise a jusante (Figura S1B).
      3. Depois que a pasta 'Unaligned' foi gerado, vá para a pasta 'Unaligned' (Figura S1C).
      4. Use o comando na Figura S1D para iniciar o processo de conversão. O parâmetro '-j' fornece o número cpu que será usado.
      5. Depois que o sistema terminar o processo de conversão, vá para a pasta resultado na pasta 'Unaligned' (Figura S1E).
      6. Use o comando na Figura S1F </ Strong> para descompactar o arquivo .fastq.gz em .fastq arquivo em cada pasta da amostra.
  2. Detectar novas transcrições e avaliar o nível de expressão usando smoking Suíte 26:
    1. Mapear a-end emparelhado RNA-Seq lê para o genoma de referência do mouse (UCSC versão MM9, obtido a partir http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html ) usando o software Cartola (versão 1.3.3) 27, que usa o Bowtie ler mapeador (versão 0.12.7) 28. Cartola é fornecido com a opção "-no-novela-juncs" para melhorar a precisão da estimativa do nível de expressão.
      1. Coloque os arquivos .fastq em uma pasta onde o processo de mapeamento será implementado. Suponha que há dois arquivos .fastq (renomear a Example1.read1, Example1.read2) para uma amostra de seqüenciamento emparelhado-end, use o comando na Figura S2 para fazer o mapeamento (ajustar os parâmetros de acordo com a configuração do sistema).O parâmetro "-p" fornece o número cpu que será usado. Os parâmetros "-r" e "-mate-std-dev" pode ser obtido a partir da biblioteca QC ou inferidos a partir de um subconjunto de leituras alinhadas (Figura S2).
    2. Monte o mapeados lê em transcrições de RNA utilizando o software Abotoaduras (versão 1.3.0) 29. Abotoaduras de execução usando o arquivo de anotação de genes conhecidos (mesmo arquivo .gtf usado por Cartola) e arquivo .bam produzido por Cartola.
      1. Após Cartola terminar a execução, na mesma pasta, use o comando na Figura S3A para executar abotoaduras para construir transcriptoma e estimativa transcrição nível de expressão. O 'mm9_repeatMasker.gtf' e arquivos de seqüência do genoma na pasta 'GenomeSeqMM9' pode ser obtida a partir de UCSC Genome Browser.
      2. Os arquivos genes.expr e transcripts.expr resultantes contêm o valor de genes e transcrições (isoformas) expressão. Copiar e colaro conteúdo do arquivo para um arquivo do Excel e manipular com aplicativo de planilha (Figura S3B).
      3. Use o comando na Figura S3C para comparar o arquivo resultante 'transcripts.gtf' para o arquivo de referência 'mm9_genes.gtf', a fim de identificar novos transcrições.
      4. O arquivo .tmap resultante contém o resultado da comparação. Copie e cole o conteúdo do arquivo em um arquivo de Excel e manipular com aplicativo de planilha. Transcrições com código de classe 'u' pode ser considerado como "romance" em comparação com a referência .gtf arquivo fornecido (Figura S3D).
        NOTA: Para a jusante conveniência análise, defina os valores FPKM a 0,1 se os valores estão abaixo de 0,1.
        NOTA: Passo 3.2.3 - 3.2.6 é opcional para aqueles que desejam melhorar a precisão da estimativa de expressão novos 'transcrições. Isso vai levar um tempo muito maior, porque o mapeamento e construção transcriptoma precisa ser run mais de uma vez.
    3. Execute Cartola usando parâmetros padrão e execute abotoaduras para arquivo .gtf gerado usando o comando na Figura S3E.
    4. Compare o arquivo .gtf resultante para o arquivo .gtf genoma de referência usando o comando na Figura S3F.
    5. Analisar o arquivo .tmap resultou, conforme descrito na etapa 3.2.2.4. Copie e cole o conteúdo do arquivo em um arquivo de Excel e manipular com aplicativo de planilha. Transcrições com código de classe 'u' pode ser considerado como "romance" em comparação com a referência .gtf arquivo fornecido.
    6. Após o passo 3.2.5, existe um ficheiro .combined.gtf na pasta que pode ser utilizada como a referência de ficheiro .gtf. Uma segunda execução de Tophat e botão de punho pode ser efectuada tal como descrito no passo 3.2.1 e 3.2.2 para se obter uma estimativa mais precisa da FPKM novos transcritos.
  3. Detectar differentially expressa genes usando o pacote DESeq 30.
    1. A entrada de DESeq é uma tabela de contagem de leitura crua. Para obter tal tabela, utilize o script htseq-count distribuído com o pacote HTSeq Python, que pode ser baixado do site HTSeq ( http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html ) .
      1. Certifique-se de que samtools, Python e htseq-count programsare instalado no sistema. Obter números de contagem de leitura brutos de saída cartola usando o comando na Figura S4A.
      2. Prepare 'Raw_Count_Table.txt', arquivos 'ExperimentDesign.txt' usando o Excel. Copie e salve o conteúdo em formato .txt para o pacote DESeq R (Figura S4B).
      3. Instalar programa de I no sistema. No terminal, digite "R" e pressione ENTER.A mensagem tela appearas mostrado na Figura S4C.
      4. Leia 'Raw_Count_Table.txt ',' ExperimentDesign.txt 'em R usando o comando na Figura S4D.
      5. Carregar pacote DESeq usando o comando na Figura S4E.
      6. Condições fatorizar em R (Figura S4F).
      7. Use o comando na Figura S4G para executar o teste binomial negativo na tabela de contagem normalizada.
      8. Use o comando na Figura S4H a saída diferencial significativo genes expressos em um arquivo .csv.
  4. Fatores de transcrição Lookup "(TFS) valores FPKM toda amostras usando Excel. Intersect DE mesa e mesa gene FT. Os genes pertencem a ambos tabela são diferencialmente expressos factores de transcrição.
    1. Ir para o site http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php e baixar os fatores de transcrição. Em seguida, procurar os fatores de transcrição DE no Excel (< strong> Figura S5).
  5. Gerando arquivo .bigwig para visualização navegador genoma UCSC.
    1. Baixar pacote de software '' bedtools do site https://github.com/arq5x/bedtools2 e instalar o software no sistema 31. Faça o download das ferramentas UCSC 'bedGraphToBigWig' do site http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ e instalar o software no sistema.
    2. Na pasta que contém o arquivo .bam, use o comando na Figura S6A para converter arquivos .bam gerado pelo cartola em arquivo .Cama.
    3. Depois que o arquivo .Cama é produzido, use o comando na Figura S6B para gerar arquivo .bigwig. O arquivo 'ChromInfo.txt' pode ser obtida no seguinte endereço:Arget = "_blank"> http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz.
    4. Observar uma faixa personalizada no UCSC Genome Browser. Consulte o site http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html sobre como exibir uma faixa personalizada usando o navegador genoma UCSC.

figure-protocol-1
Figura S1: Convertendo arquivo .bcl para .fastq arquivo usando o software casava.

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Figura S2: Mapeamento lê a referência genoma usando Cartola.

figure-protocol-3 Figura S3: Detecção de novas transcrições e estimativa do nível de expressão.

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Figura S4: Chamando diferencial de genes expressos usando DESeq pacote.

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Figura S5: Identificação de fatores de transcrição diferencialmente expressos.

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Figura S6: Convertendo resultado do mapeamento para a visualização de dados.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fim de analisar os genes diferencialmente expressos em Lin-CD34 + e CD34- células Lin-EML, usamos a tecnologia de RNA-Seq. A Figura 1 mostra o fluxo dos procedimentos. Após o isolamento das células de linhagem negativos por separação de células magnéticas, nós separamos as células Lin-SCA-CD34 @ usando FACS Aria Lin-SCA + CD34 + e. Células EML Lin enriquecidas foram marcadas com anti-CD34, anti-Sca1 e anticorpos cocktail de linhagem. Apenas as células Lin- foram fechado para a análise de Sca1 e CD34 e...

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Discussão

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Transcriptoma de mamíferos é muito complexo 34-38. Tecnologia de RNA-Seq desempenha um papel cada vez mais importante nos estudos de análise de transcriptoma, novela de detecção de transcrições e único nucleotídeo descoberta variação etc. Ele tem muitas vantagens sobre outros métodos de análise de expressão gênica. Como mencionado na introdução, que supera os artefactos de hibridação de microarray e pode ser utilizado para identificar novos transcritos de de novo. Uma limitação do RNA...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JQW, SZ, SD e KC são apoiados por doações do National Institutes of Health e do Staman Ogilvie Fund - Memorial Hermann Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antibiótico-AntimicóticoInvitrogen15240-062BHK cultura
de células Anti-Mouse CD34 FITCeBioscience11-0341-81Classificação FACS
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81Classificação FACS
APC Linhagem de Camundongo Anticorpo CoquetelBD Biosciences558074FACS classificação BD
FACSAria Classificador de CélulasBD BiosciencesOferta especial sistemaFACS classificação Corning
™ Frascos Tratados com Cultura de Células 75 cm2Corning incorporated430641Cultura de células
Corning™ Frascos tratados com cultura de células 25 cm2Corning incorporated430639Cultura de células
Desoxirribonuclease I, grau de amplificaçãoInvitrogen18068-015Preparação da biblioteca
DMEMInvitrogen11965-092Cultura de células BHK
DPBSGibco14190Cultura de células
HI FBSInvitrogen16140071Cultura de células BHK
Soro de cavaloInvitrogen16050-122EML cultura de células
IMDMHyCloneSH30228.02EML cultura
de células L-GlutaminaInvitrogen25030-081Cultura de células
Kit de depleção de células de linhagem, camundongoMiltenyi Biotec130-090-858Isolamento de células negativas de linhagem
NanoVue Plus espectrofotômetroGE Healthcare28-9569-62Controle de qualidade
Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Incubadoras de CO2 ThermoScientific15-497-002Cultura de células
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Referências

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