Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Resumo

Estudar os primeiros eventos de progressão de células pré-neoplásicas e interação célula imune inato é fundamental para compreender e tratar o câncer. Aqui nós descrevemos um método para induzir condicionalmente transformações de células epiteliais e do subsequente imagens ao vivo de interação célula imune inato com HRAS ^G12V expressando células da pele em larvas do peixe.

Resumo

Aqui descrevemos um método para induzir condicionalmente a transformação de células epiteliais pelo uso^{do sistema de} expressão KalTA4-ER^T2/UAS induzível por 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) 1 em larvas de peixe-zebra e a subsequente imagem ao vivo da interação de células imunes inatas com células da pele que expressam HRAS^G12V. O sistema KalTA4-ER^T2/UAS é induzível e reversível, o que nos permite induzir a transformação celular com resolução temporal/espacial precisa in vivo. Isso nos dá uma oportunidade única de imaginar ao vivo como as células pré-neoplásicas individuais interagem com os tecidos hospedeiros assim que emergem e, em seguida, seguem sua progressão e regressão. Estudos recentes em larvas de peixe-zebra mostraram uma função trófica da imunidade inata nos estágios iniciais da tumorigênese^2,3. Nosso sistema induzível nos permitiria visualizar ao vivo o início da transformação celular e a subsequente resposta do hospedeiro, o que pode levar a informações importantes sobre os mecanismos subjacentes à regulação das respostas inflamatórias tróficas oncogênicas. Também discutimos como se pode adaptar nosso protocolo para obter controle temporal e espacial da expressão gênica ectópica em qualquer tecido de interesse.

Introdução

O crescimento de uma progênie de células pré-neoplásicas dentro de uma folha epitelial de outra maneira normal depende fortemente de uma interação com seu microambiente. A interação com o seu tecido hospedeiro é provável que seja o principal determinante de saber se uma célula pré-neoplásica é capaz de estabelecer um nicho clonal para desenvolver ainda mais em um câncer desenvolvido. Apesar de sua importância no desenvolvimento, esta fase inicial de progressão do câncer é inacessível em sistemas modelo mais comumente usados, in vivo.

O peixe-zebra, Danio rerio, é um organismo modelo bem estabelecido para estudos de imagem ao vivo por causa de sua transparência ao longo do desenvolvimento, a possibilidade de manipulação genética, e acessibilidade para os medicamentos solúveis em água. Estudos recentes, utilizando um modelo de larvas de peixe-zebra, que sobre-expressam o oncogene humano HRAS ^G12V para transformar células epiteliais, mostraram que sinais da célula hospedeira derivada, em especial H ₂ O ₂ a chumboo recrutamento de células imunitárias inatas. Interessantemente, as células imunes recrutadas, neutrófilos e macrófagos, mostraram ter um papel trófico no apoio a proliferação de células pré-neoplásicas ^2,3.

A fim de compreender os primeiros eventos de início e progressão do tumor, bem como a contribuição de uma resposta inflamatória, é necessário ser capaz de imagem estes eventos desde o ponto de tempo mais curto em diante. Por isso, é necessário controlar as transformações celulares de uma forma específica de tecido e temporais. Nós utilizamos o sistema / UAS de Gal4 que foi adaptado com sucesso a partir de Drosophila ⁴ de expressar condicionalmente o oncogene humano HRAS ^G12V sob o controlo do promotor específico de queratina da pele 4 (krt4) ^5. A versão modificada do activador da transcrição Gal4, nomeadamente KalTA4 ^6, permite a expressão de HRAS ^G12V sob o controle da sequência activadora a montante (UAS). Para induzir a expressão condicionalmente activador transcricional, KalTA4 foi fundido com o domínio de ligação ao ligando mutante das α do receptor de estrogénio humano (ER ^{T2) 7,} que se liga especificamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) ^1. Na ausência de 4-OHT ^T2 RE está ligado no citoplasma por proteínas de choque térmico. Após 4-OHT obrigatório o choque térmico proteínas dissociar, permitindo a translocação nuclear de KalTA4-ER ^T2 e consequente ativação dos UAS gene de interesse ⁸ controlados (Figura 1C, b). Como este sistema de expressão depende da presença de 4-OHT, a expressão KalTA4 controlada de um gene de interesse é reversível. Em contraste com o sistema Cre-ER ^T2 / Lox, o que leva a um evento de recombinação irreversível, a indução da activação transcricional pela KalTA4 ^ER-T2 é reversível pela adição ou remoção de 4-OHT.

O seguinte protocolo de alo ws uma transformação condicional de células da pele em larvas do peixe e um posterior acompanhamento da interação com as células imunitárias inatas por expressão da proteína fluorescente. As metodologias básicas empregadas neste protocolo são semelhantes a algumas técnicas comumente utilizadas na Comunidade peixe-zebra ^9-13.

A geração e uso combinatória de linhagens transgênicas em conjunto com a microinjeção de construções transgênicas possibilita uma abordagem transitória para apenas transformar células individuais de uma forma de mosaico. A permeabilidade ao oxigênio da pele do peixe-zebra embrionário e larval levanta a possibilidade de time-lapse estudos de imagens ao vivo através de microscopia de alta resolução de horas a dias. Além disso, a sua acessibilidade aos medicamentos solúveis em água vai permitir que futuros estudos sobre os mecanismos e o acompanhamento dos celulares eventos biológicos in vivo que poderiam levar a uma melhor compreensão dos estágios iniciais do desenvolvimento do câncer.

_content "> Este protocolo pode ser adaptado para realizar a expressão génica condicional em qualquer tecido de interesse em larvas do peixe, de um modo mosaico. Pode-se também optimizar a configuração, a fim de viver imagem outros tecidos mais profundos do que a pele microscópio.

Protocolo

Os seguintes procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com os Animals Act 1986 (Procedimentos Científicos).

1. Preparação de ADN de plasmídeo para microinjecção

1. Purifica-se o plasmídeo pTol2-krt4: KalTA4 ^ER-T2; cmlc2: eGFP com um kit de purificação de ADN de plasmídeo comercial de acordo com as instruções do fabricante e diluir o ADN plasmídico até uma concentração final de solução de estoque de 100 ng / mL.
2. Linearizar o plasmídeo transposase contendo pT3TS / Tol2 ¹⁴ por digestão de restrição BamHI, seguindo o protocolo do fabricante. Este passo pode ser alargado durante a noite. Precipitar o DNA linearizado por uma extracção com fenol / clorofórmio, seguindo o protocolo padrão.
3. In vitro transcrever o ARNm da transposase do plasmídeo linearizado com um kit comercial para a transcrição de grandes quantidades de ARN tampado acordo com as instruções do fabricante, diluídos e a aliquotaa concentração da solução estoque final de 100 ng / mL em água livre de nuclease. Garantir a qualidade do ARN purificado com um nativo de 1-2% de TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) a electroforese em gel de agarose (80-120 V). Armazenar o ARN a -80 ° C.

2. microinjeção de DNA plasmídeo para Transient Expression Gene

1. Prepare uma placa de injeção agarose para manter os ovos fertilizados durante a injeção. Pour líquido 3% de agarose em uma placa de Petri de 90 mm. Deixe a arrefecer de agarose a 40-50 ° C e adicionar a molde em forma de cunha microinjecção TU-1 no topo do líquido de agarose. Após o endurecimento à temperatura ambiente, deixar o resto de agarose a 4 ° C durante 30 minutos antes de remover o molde. Moldes microinjeção armazenar a 4 ° C e reutilização.
2. Prepara-se uma alíquota da solução de injecção. Execute os seguintes passos no gelo. Pipetar 1 ul de DNA de plasmídeo (concentração final de 10 ng / ul), 2 ul de ARNm da transposase (concentração final de 20 ng / ul), 2ul de 10 mg / mL de isotiocianato de rodamina B-Dextrano, 2 uL de solução de 5x Danieau (NaCl 290 mM, KCl 3,5 mM, 2 mM de _MgSO4, Ca 3 mM (NO _{3) 2,} 25 mM de HEPES, pH 7,6) para uma volume final de 10 uL em água isenta de nuclease.
3. Preparar a partir de agulhas capilares de vidro de borossilicato de 1 mm de diâmetro contendo um filamento interior puxando o capilar em direcções opostas com uma micropipeta extrator. Use o seguinte programa: aquecer 530, puxe 200, velocidade e tempo de 80 150.
4. Encha uma agulha com 2 mL da solução de injecção (mantidos em gelo). Evitar bolhas mediante a retirada cuidadosamente a ponta microloader enquanto liberta a solução para o capilar. Parta cuidadosamente a ponta da agulha com uma pinça.
5. Regule o tamanho de gota com uma bomba de pico pneumático. Meça o diâmetro da gota / volume (V = 4/3 πr ³⁾ e ajuste o tamanho de gota com um micrômetro ocular sob um estereoscópio em dimetilpolisiloxano. Recomendamos100 mm, o que corresponde a 0,5 nl. Isto assegura a concentrações uniformes e reprodutíveis por cada embrião injectado. Titular da concentração injetada e ajustar para cada preparação de construção e plasmídeo.
6. Colocar os zigotos (Figura 1A) obtido a partir de um cruzamento de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 ¹⁵ com Tg (LysC: DsRed2) nz50Tg ¹⁶ para os moldes de injecção a placa por utilização de um 3 ml pastette. Enquanto isso, de manter a ponta da agulha de injecção previamente preparada em dimetilpolissiloxano para evitar a solução e secando a partir de coagulação.
7. Injectar a gota pré-medida (100 um correspondendo a 0,5 nl) sob um microscópio estereoscópico através do cório na discoidal ^17, antes da primeira clivagem (Figura 1A). Injecção no estádio de uma célula aumenta o potencial de uma distribuição uniforme do ADN de plasmídeo e de ARN na massa de células em desenvolvimento e a possibilidade de transmissão da linha germinativa. Éde notar que a expressão de construções mais frequentemente tende a ser mosaico.

3. Condicional Transformação celular Skin by 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT)

1. Transferir os embriões injectados em solução 0,3x Danieau e mantê-los a 28,5 ° C num incubador. Retire os ovos não fertilizados do prato em fase esfera ^17. A co-injectado isotiocianato de rodamina B-dextrano pode ser utilizado como um controle de injecção sob um estereoscópio fluorescente.
2. Embriões tela em 24 hpf (hr após a fertilização) para a expressão cardíaca de eGFP. Continue a elevar CMLC: eGFP embriões de peixes-zebra positivos até 72 hpf. Monitorar cuidadosamente a qualidade da água (0,3x Danieau).
3. Retire o chorion desses embriões que não eclodiram com uma pinça em 72 hpf. Picar cuidadosamente o chorion com uma pinça e puxe-o para além, usando o outro. Selecionar embriões para LysC: expressão DsRed2 usando um estereoscópio fluorescentes.
4. Adicionar 10 ul de 10 mMestoque de (Z) -4-hidroxitamoxifeno a 20 ml de solução Danieau 0,3x (concentração final de 5 uM). Use a indução de uma solução de 4-OHT para uma placa de Petri padrão (90 mm) em um lote de 40-60 embriões.
5. Transferir os embriões em uma nova placa de Petri contendo 20 ml de recém-made solução de indução. 4-OHT tem de ser armazenado e manuseado no escuro. Os primeiros sinais de expressão pode ser detectado 2 horas após a indução de início. A indução de uma etapa pode ser alargado durante a noite, mantendo em mente que a célula hospedeira inicial: interacções de células pré-neoplásicas pode ocorrer já algumas horas após o tratamento.

4. Montagem e Imagens ao vivo de Zebrafish Larvas

1. Prepara-se uma placa de Petri de 60 milímetros por introdução de um orifício com um diâmetro de 18-20 mm. Use massa de silicone de alto vácuo, para cobrir e selar o furo na parte inferior exterior da placa de Petri com uma tampa de vidro de 25 mm (Figura 1B).
2. Prepare 1% de baixo ponto de fusão (LMP) agarose. Manter um tubo de 1,5 mlde agarose LMP a 37 ° C num bloco de aquecimento.
3. Pré-seleção Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) larvas de célula de pele verde fluorescente e DsRed2 expressão célula imune inata positivo, sob um estereoscópio fluorescente. Anestesiar larvas pela adição de 1 ml de 0,4% tricaina ¹⁸ à solução 20 ml de indução.
4. Transferir as larvas pré-seleccionada com um pastette em agarose LMP o líquido. Deixe as larvas afundar na LMP agarose e transferi-los para a tampa de vidro (Figura 1B). Orientar os embriões sob um estereoscópio. As larvas devem ser colocados directamente sobre o vidro, para reduzir a distância de trabalho (até 6 larvas).
5. Cubra a agarose LMP com a solução contendo tricaina indução após o endurecimento (Figura 1B seta).
6. Imagem larvas incorporado usando uma fluorescente invertida, laser de varrimento ou de disco rotativo microscópio confocal. Use um 40X ou 63Xobjetivo como objetivos com distâncias de trabalho longos permitem concentrando toda a larvas.

Resultados

Zigotos de um cruzamento entre Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 e Tg (LysC: DsRed2) nz50Tg foram recolhidos 10-15 minutos após a fertilização (Figura 1A) para obter uma embriões em estágio de célula. Após a injecção os embriões foram criadas até 3 dpf, antes da indução com 4-OHT e montagem para imagens em tempo real (Figura 1B). 2-6 horas pós indução as embriões foram montadas colocado quer sob um microscópio de fluorescência invertido (Figura 2A) ou um microscópio invertido confocal (Figura 2B-C) e fotografada por 2-3 h com 1,5 minutos de intervalo. As células pré-neoplásicas da pele superficiais podem ser identificados pela sua morfologia mais arredondada em comparação com os queratinócitos normais, bem como a emissão fluorescente verde da membrana localizada eGFP-HRAS ^G12V. Áreas de imagem foram selecionados para co-localização das células da pele e células pré-neoplásicas da imunidade inata (Figura 2A cabeça de seta). Devido ao rápido migprocesso de ração dos neutrófilos nos intervalos de lapso de tempo foram escolhidos para estar entre 1-1,5 min com pilha Z tamanhos de passo de 0,7-1,7 mm para obter projeções máximos de intensidade (Figura 2, Video 1). Existe uma vasta gama de comportamentos que podem ser observados enquanto imagens ao vivo: neutrófilos migram ao lado e sob as células pré-neoplásicas (Figura 2C, Vídeo 1), formam contactos directos para as células (Figura 2B e C), remova restos de células pré-neoplásicas que se submetem apoptose (Vídeo 1), ou activamente engolir partes de células pré-neoplásicas (não mostrado). Para capturar o espectro completo de interações, é aconselhável seguir os seus comportamentos por time-lapse imagens ao vivo.

Figura 1: Esquema para a transformação de células da pele condicional em larvas do peixe. (A) Uma imagem de um zigoto de TG (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) zebrafish em 10 min após a fertilização (MPF). O ovo fertilizado é cercado pelo chorion (seta). O local para a injecção é a discoidal (asterisco), formada por correntes citoplasmáticos da gema (seta) que define o polo animal do embrião. (B) de montagem de larvas de peixe-zebra. Placa de 60 mm de Petri com um orifício de 18-20 mm (ponta de seta) que é selada por uma tampa de vidro de 25 mm. As larvas do peixe-zebra são imobilizados e montado na tampa de vidro de 1% agarose LMP. Solução 0,3x Danieau (seta) contendo 5 uM 4-OHT é utilizado para cobrir a agarose LMP. (C) 4-OHT transformações de células superficiais da pele. (A) de perfil transversal esquemático de pele induzida larval. A pele embrionário e larval é composto de duas camadas de células epiteliais, uma camada superficial de células e uma camada basal de células de queratinócitos que estão ligadas à membrana basal subjacente (BM). (B) A expressão transiente do sistema tPara induzir um clone de células pré-neoplásicas entre as células superficiais da pele. KalTA4 ^ER-T2 é expresso exclusivamente na camada mais externa da pele dirigido pelo promotor krt4 (amarelo). Mosaico de expressão KalTA4-ER ^T2 activa UAS controlada (azul) eGFP-HRAS ^G12V expressão em células superficiais, levando a um clone de células pré-neoplásicas (verde). (D) esquemática do sistema de expressão transiente. (A) da cassete Tol2 pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP vector expressão utilizada transitoriamente (b) indução da expressão condicional ativador da transcrição.. KalTA4 é fundido com o domínio de ligação ao ligando do receptor mutante α estrogénio humano (ER ^T2) que se liga especificamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). Na ausência de 4-OHT ^T2 RE está ligado no citoplasma por proteínas de choque térmico (Hsp90). Após a ligação de 4-OHT Hsp90 dissocia-se, permitindo que uma translocação nuclear de KalTA4-ER^T2 e consequente ativação dos UAS expressão eGFP-HRAS ^G12V controladas. Barra de escala A = 500 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Figura 2: Imagens ao vivo da interação célula imunológica inata e pré-neoplásica. (AC) Imagens de um 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) embrião, que foi injetado com pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP e mRNA transposase em um estágio de célula. As imagens foram recolhidas após 6 horas de indução de 4-OHT (A) vista lateral da região da tailfin às 6 horas após o tratamento, que mostra porções de eGFP-HRAS ^G12V que expressam as células da pele (seta), e LysC:. DsRed2 + neutrófilos (ponta de seta). (BC) Imagens representativas taken a partir de um filme de lapso de tempo confocal, mostrando neutrófilos (vermelho) interacções com eGFP-HRAS ^G12V que expressam as células da pele (verde). (B) Uma célula pr�neopl�ica forma uma extensão curta filopodial com o contacto de neutrófilos (ponta de seta). (C) Os neutrófilos (vermelho) está em contacto estreito com um clone de células da pele pré-neoplásicas (verde). Barra de escala em A = 100 mm; B / C = 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Vídeo 1 : Time-lapse imagens ao vivo de interação célula imunológica inata e pré-neoplásica. Time-lapse de um 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) embrião, injetado com pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP e mRNA transposase em um estágio de célula. Confocal filme de lapso de tempo 6-9 hoUrs depois de 4-OHT indução mostrando LysC: DsRed2 + neutrófilos (vermelho) interações com eGFP-HRAS ^G12V expressando células da pele (verde). Os neutrófilos migram ao lado e sob as células pré-neoplásicas e remover restos de um celular pré-neoplásica que sofre apoptose. Intervalos de lapso de tempo de 1,5 minutos durante 3 horas com a pilha Z tamanhos de passo de 1,3 mm.

Discussão

Durante a embriogénese e desenvolvimento das larvas, a pele de peixe-zebra embrionários é composto de duas camadas epiteliais, a camada superficial chamado periderme e uma camada de queratinócitos basais que estão ligadas à membrana basal subjacente ¹⁹ (Figura 1C, a). O protocolo aqui apresentado descreve um método simples para induzir a transformação em células condicionalmente pr�neopl�ica na camada superficial da pele de larvas de peixe-zebra, e permite a análise subsequente interacção com células do sistema imune inato de imagens em tempo real. As metodologias base no nosso protocolo de seguir as técnicas bem estabelecidas de peixe-zebra ^9-13, e nosso protocolo pode ser facilmente adaptado e modificado.

O promotor utilizado aqui krt4 ⁵ dirige-ER KalTA4 expressão ^T2 especificamente na camada mais externa da pele (Figura 1C, b). No entanto, o gateway modulares MultiSiteestratégia de clonagem, utilizado para gerar o krt4: KalTA4-ER ^T2 construção (Figura 1D, a), fornece a possibilidade de clonar qualquer promotor de interesse em frente de KalTA4-ER ^T2 num único passo de clonagem. Uma adaptação do método aqui apresentado é portanto possível para a maioria dos tecidos durante a embriogénese e estádios larvares. A disponibilidade de sequências de promotor é instituído o fator limitante. Além disso, quase qualquer gene de interesse clonado atrás de uma UAS pode ser condicionalmente superexpresso em diferentes estágios de desenvolvimento pela utilização da expressão KalTA4-ER ^T2 espacial e temporalmente controlada. Por isso, o nosso protocolo pode ser adaptado para realizar a expressão génica condicional em qualquer tecido de interesse em larvas do peixe, de um modo mosaico. Pode-se também otimizar a configuração, a fim de viver imagem tecidos mais profundos, como o fígado ou pâncreas microscópio.

Nós descrevemos um aplicativo usando o protocolo queRe, da mesma forma, pode-se overexpress outros moduladores da inflamação usando esse protocolo para estudar a regulação das respostas inflamatórias, como se pode facilmente neutrófilos imagem ao vivo e mudanças comportamentais de macrófagos após a indução e parada na expressão de um modulador inflamatória candidato. Além disso, o protocolo adaptado também seria benéfico para aqueles que querem rastrear o movimento celular e mudança de comportamento durante as diferentes fases da morfogênese do tecido e formação de órgãos e, finalmente, imagem ao vivo da interação de interações entre células da imunidade inata com outras linhagens de células específicas que podem ser direcionados pelo KalTA4-ER sistema de expressão de ^T2 / UAS indutível.

Utilizou-se o vector pDestTol2CG do Tol2kit zebrafish ^20-23 que contém um cmlc2: eGFP-PA cassete (Figura 1D, a) que permite posterior seleção de embriões por corações positivos fluorescentes verdes como selection marcador ^20, que simplifica o processo de triagem F0. Uma inserção estável do gene de interesse ladeado transposão no genoma é facilitada pela co-injecção do ADN de plasmídeo em conjunto com ARNm de transposase. A preparação de DNA de plasmídeo e o ARNm da transposase para microinjecção segue protocolos convencionais. No entanto, uma integração bem sucedida da construção no genoma depende da transposição baseadas ^Tol2-14. Isso destaca a atenção especial a ser pago para trabalhar no gelo em condições estéreis para evitar contaminações e degradações por RNases e DNases. Microinjeção em embriões em estágio de uma célula é uma técnica robusta e bem estabelecida para o ganho e perda de estudos da função em ^9,10 peixe-zebra. Embora uma pessoa bem treinada pode facilmente injetar na gema de mais de 1.000 embriões em 1 hr, a injecção no blastodisc (Figura 1A, asterisco) requer mais experiência e formação. Critical durante este procedimento is o manuseamento da agulha. A agulha tem que ser muito fino para penetrar na célula sem danos e, portanto, tem de ser quebrado apenas em sua ponta. É importante para controlar regularmente e medir o tamanho de gota durante a injecção para garantir uma injecção uniforme em cada embrião. Manuseados com cuidado, a agulha pode ser usado para rodar o embrião. Isso é muitas vezes necessário para encontrar o blastodisc e o ângulo de penetração ideal.

A concentração de ADN e ARNm de transposase utilizado para injecção quase certamente influencia a eficiência de expressão. Doses mais elevadas podem conduzir a um aumento da proporção de células que expressam o transgene, mas com concentrações mais altas de ADN (> 50 ng / mL) e o ARNm da transposase (> 100 ng / mL), também o potencial de efeitos tóxicos entre os embriões injectados se coloca. Nós favorecer a utilização de 10 ng / mL de ADN e 20 ng / ul transposase ARNm para injecção, o que corresponde a 50 pg de ADN plasmídico e 100 ug de ARN por emb injectadoRyo. 100% dos embriões injectados com estas concentrações não se desenvolvem normalmente, entre 40-70% e mostra eGFP-HRAS expressão ^G12V, após a indução de 4-OHT, dependendo da eficiência injecção no única célula. Entre embriões positivos que normalmente encontrar cerca de 30% que têm 10/01 clones, 40% que têm 10-50 clones e 30% com mais de 50 clones. Devido aos nossos objetivos de pesquisa, somos a favor da utilização de embriões com poucos clones expressando eGFP-HRAS ^G12V. Nós selecionar embriões com 10-50 clones para nossos experimentos transitórios. Para a geração de peixe transgênico fundador, recomendamos que só selecionar embriões com tanto o marcador cardíaco positivo eGFP e um grande número de clones positivos eGFP-HRAS ^G12V em sua epiderme.

(Z) -4-hidroxitamoxifeno sofre uma interconversão cis-trans (EZ) quando exposto à luz ^24. Verificou-se que o isómero cis (E) é 100x menos anti-estrogénica do que a sua contraparte trans ^25,26. Exposure à luz, por conseguinte, tem de ser evitado. A solução stock de 4-OHT dissolvido em etanol podem ser armazenadas a -20 ° C no escuro durante um período de tempo longo. Recomendamos o uso de uma caixa para proteger as placas de Petri da luz durante a indução do gene alvo dentro da incubadora e transporte. Embora a área da imagem é muito pequeno e de exposição de 4-OHT para luz UV é reduzida a um mínimo, uma troca constante de solução de indução a cada 2 horas enquanto a imagem ao longo de períodos de tempo mais longos é recomendado para manter os níveis máximos de expressão. 4-OHT permeabiliza efetivamente através do córion e as camadas mais externas da pele durante a embriogênese peixe-zebra, portanto, pode induzir a expressão do gene muito rapidamente. Nós podemos facilmente observar emissão eGFP após 2 horas de indução e foi relatado que os primeiros sinais de expressão do gene-alvo pode ser observada após 1 hora e 3 horas depois de patamar de tratamento ^8. As diferenças podem ser devido ao diferente promotor utilizado no nosso estudo. Como tem sido previously informou que 4-OHT tratamento é dependente da dose ^8,27, optamos por utilizar a maior concentração relatada de 5 mM para alcançar robustas e reproduzíveis níveis de expressão em nossa abordagem transitória. Isto deveria garantir que todas as células que transportam o transgene irá induzir a expressão do gene alvo.

Tem que ser tido em conta que a abordagem transiente aqui apresentada poderia conduzir a diferentes níveis de expressão, devido à possibilidade de múltiplos eventos de inserção aleatória e genoma. Além disso, a utilização do ARNm da transposase no fundo transgénico Tol2 de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 pode levar a possíveis transposições do transgene UAS que poderia resultar no silenciamento de genes ou perturbação. No entanto, como o método aqui apresentado representa uma abordagem transiente, a pré-selecção de embriões subsequentes à injecção é obrigatória. Muitos laboratórios descobriram que as sequências UAS tendem a ser silenciados na prole transgênica, portanto, emjecting o pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP construir em Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 embriões pode não ser tão eficiente quanto a injeção de um UAS construir em Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP ) embriões. O uso da linhagem transgênica estável Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) cruzados com Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 permitirá um acompanhamento preciso das on / off cinética do tempo-dependente de dosagem ativação do gene 4-OHT .

Um passo crítico durante a montagem das larvas é a transferência para a agarose LMP e sobre a tampa de vidro (Figura 1B). Existe apenas um curto espaço de tempo para LMP agarose de temperatura de líquido que permite a transferência segura e orientação das larvas pré-seleccionado sem prejudicar os peixes, quer por choque térmico ou o endurecimento do gel. As larvas devem ser orientados diretamente sobre a tampa de vidro para reduzir a distância de trabalho para a Analy microscópico subsequentesis. Como isso pode ser um fator limitante durante microscopia a escolha dos objectivos adequados é obrigatória. Uma vez montada, a larva possa ser mantida de horas a dias.

A condicionalidade do sistema modelo aqui apresentado permite a transformação repetida por ativação 4-OHT do transgene. O sistema de expressão depende da presença de 4-OHT e, portanto, a expressão KalTA4 controlada de um gene de interesse é reversível (Figura 1D, b). Em contraste com o sistema Cre-ER ^T2 / Lox, o que facilita um evento de recombinação irreversível genómico ^28, KalTA4 ^ER-T2 / UAS pode ser activada e desactivada por adição ou remoção de 4-OHT e este potencial para indução repetida é uma vantagem de a técnica sobre o sistema ^T2 / Lox Cre-ER. No entanto, o requisito de níveis constantes de 4-OHT é uma limitação, desde que a experiência tem que ser prolongado de dias a semanas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(Z)-4-Hidroxitamoxifeno	Sigma Aldrich	H7904	diluir em etanol e armazenar no escuro a -20  ° C
20X Objetiva	Zeiss		20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Objetiva	Zeiss		40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Objetiva	Zeiss		63X/1.4 Óleo Ph3 ∞/0.17
BamHI	New England Biolabs	R0136S
Microscópio Confocal	Zeiss		LSM 510 META
Capa vidro	VWR	631-0171	Diâmetro 25 mm
Dimetilpolissiloxano	Sigma Aldrich	DMPSV
Dow Corning graxa de silicone de alto vácuo		Sigma Aldrich
Flaming/Brown P-97	Sutter Instruments Co.	Programa P-97	: calor 530, tração 200, velocidade 80, e tempo 150
Estereoscópio fluorescente	Leica		M205 FA
Kwik-Fill Capilares de vidro brosilicato	World Precision Instruments	1B100F-4
Molde de microinjeção TU-1	Ferramentas de ciência adaptativa	TU-1
Ponta de microcarregador	Eppendorf	930001007
Microscópio	Zeiss		Axiovert 200
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1348
Água livre de nuclease	Invitrogen	AM9937
Bomba pneumática pico	Precision Instruments	PV820
Bomba pneumática	pico Warner Instruments	PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2: eGFP			Dr. Thomas Ramezani / Yi Feng Lab / Universidade de Edimburgo
QIAprep Spin Miniprep Kit	Quiagen	27106
Isotiocianato de rodamina B-Dextrano	Sigma	Aldrich R8881	10 mg/μ l na água
Estereoscópio	Leica		M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg			BMC Biologia do Desenvolvimento 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006			PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaine/MS-222	Sigma Aldrich	A5040
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520-050
UltraPure Fenol : Clorofórmio : Álcool isoamílico	Invitrogen	15593-031	25:24:1, v/v