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Artigo de método

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

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DOI:

10.3791/52114

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5 de novembro de 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

Neste artigo

Resumo

PAD4 é uma enzima responsável pela conversão de peptidil-arginina em peptidil-citrulina. A desregulação do PAD4 tem sido implicada em várias doenças humanas. Um ensaio PAD4 baseado em fluorescência fácil e compatível com alto rendimento é descrito.

Resumo

Modificações pós-traducionais podem levar a estados funcionais de proteínas alterados, aumentando as variações covalentes nas cadeias laterais de muitos substratos proteicos. As caudas das histonas representam um dos trechos mais fortemente modificados dentro de todas as proteínas humanas. A peptidil-arginina deiminase 4 (PAD4) demonstrou converter resíduos de arginina em resíduos de citrulina não codificados geneticamente. Poucos ensaios descritos até o momento foram operacionalmente fáceis com sensibilidade satisfatória. Assim, a falta de ensaios adequados provavelmente contribuiu para a ausência de potentes inibidores não covalentes de PAD4. Aqui, um novo ensaio baseado em fluorescência que permite o monitoramento da atividade do PAD4 é descrito. Um análogo de substrato pró-fluorescente foi projetado para ligar a atividade enzimática do PAD4 à liberação de fluorescência após a adição da tripsina protease. Foi demonstrado que o ensaio é compatível com condições de triagem de alto rendimento e tem uma forte relação sinal-ruído. Além disso, o ensaio também pode ser realizado com lisados de células brutas contendo PAD4 superexpresso.

Introdução

Um grande número de proteínas de mamífero são fortemente modificado pela acção de enzimas após a biossíntese de proteínas pelo ribossoma. Estas modificações pós-translacionais (PTMs) pode aumentar significativamente a diversidade funcional do proteoma mudando o tamanho, carga, estrutura, e estado de oligomerização (entre outras características) de proteínas 1-3. Como resultado, a variação na estrutura da proteína podem conduzir a consequências fisiológicas, tais como a degradação das proteínas, a diferenciação celular, a sinalização, a modulação da expressão do gene, e interacções proteína-proteína. Enquanto essas modificações são predominantes em uma grande porcentagem de todas as proteínas humanas, o terminal termina em proteínas histonas passam por um número anormalmente elevado de modificações covalentes 4. Proteínas histona são uma família de proteínas estruturais que facilitam a condensação de ADN genómico. Modificações covalentes das caudas das histonas não estruturados são realizadas e regulado por uma series de enzimas que podem catalisar a modificação covalente de resíduos (escritores), inverter as mesmas modificações (borrachas), e distinguem entre as mudanças que estão sendo impressas para as caudas das histonas (leitores) 5-7. Na verdade, a maioria dos PTMs conhecidos pode ser observado dentro deste segmento curto da histona, incluindo a metilação, fosforilação, acetilação, sumoilação, ubiquitinação, e citrulinação 8.

Citrulinação envolve a conversão de peptidil-arginina para o t ARN não codificado peptidil-citrulina (Figura 1A). As proteínas, responsáveis ​​por esta cadeia lateral de neutralização, são membros da DAP (p eptide um eiminase rginine d) a família de proteínas, todas as quais são enzimas dependentes de cálcio 9,10.. Até à data, cinco membros da família PAD foram descritos (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Cada membro desta família parece alvejar proteínas celulares distintas e também exibe uniperfis de distribuição de tecido Que. PAD4 é o único membro desta família de proteínas conhecida por estar localizada dentro do núcleo através de uma sequência de localização nuclear 11. Deste modo, tem sido demonstrado que deiminate um número de alvos nucleares, incluindo cadeias laterais de arginina sobre as caudas N-terminais das histonas H2A arginina resíduo 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Enquanto cada uma das isozimas PAD têm funções fisiológicas específicas e críticos, PAD4 tem recebido bastante mais atenção devido ao seu papel numa série de processos humanos em ambas as células doentes e saudáveis. Recentemente, PAD4 mostrou ser um membro da rede transcricional pluripotência 14. Ambos os níveis de expressão PAD4 e atividade mostraram-se elevados durante a reprogramação e estatais chão estados pluripotentes em camundongos. Ao controlar a regulação de genes de células-tronco, PAD4 pode reter um papel crucial na eficiência de reprogramação celular. PAD4 também tem sido implicado naformação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, o qual após a ligação de agentes patogénicos possibilitar a sua recarga do sistema. O hypercitrullination de proteínas histona por PAD4 induz descondensação da cromatina, o que serve como o material de base para o encapsulamento de bactérias patogénicas por a armadilha extracelular, assim, afastar infecções bacterianas 15,16.

Além disso, foi encontrado PAD4 a desempenhar um papel activo num número de doenças humanas. Foi previamente mostrado que a expressão aberrante de PAD4 está associada com o aparecimento e gravidade da artrite reumatóide, a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e esclerose múltipla 17. Na verdade, a presença de anticorpos anti-citrulinados proteína é um dos biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico mais fiáveis ​​e definitivas 18 de artrite reumatóide. Do mesmo modo, a actividade desregulada PAD4 foi recentemente observado num número de cancros humanos incluindo ovário, mama, pulmão, umad cânceres de esôfago 19-22. A ligação entre PAD4 e cancro tem sido mostrado para ser mediada através do oncogene ELK1 ou através da proteína supressora de tumor p53 22,23 e trabalho anterior sugeriu que PAD4 poderia ser um alvo terapêutico anti-cancro da novela 17,24,25. Como prova do princípio do estudo, a depleção de PAD4 através shRNA na linha celular de cancro colo-rectal HCT116 foi revelado para ser suficiente para induzir a apoptose e paragem do ciclo celular 26. Um inibidor irreversível PAD4 recentemente desenvolvido conduziu a uma redução de setenta por cento da massa do tumor em ratos 27. Muito notavelmente, a inibição PAD4 apareceu para actuar como uma terapia-alvo que resultou na morte selectiva de células cancerígenas, enquanto poupando células não transformadas.

O uso de pequenas moléculas para desligar a função de PAD4 pode vir a ser uma nova e poderosa estratégia para atingir as células cancerosas ou para aumentar quimioterápicos de câncer existentes 28. Infelizmente, a potenda inibidor reversível PAD4 tem ainda a ser descoberto. Uma série de inibidores covalentes foram desenvolvidos usando o / alça imidine flúor cloro que imita o substrato arginina 27,29,30 e provaram ser ferramentas práticas para a compreensão do papel da PAD4 em ambas as células estaduais saudáveis ​​e doentes. No entanto, estas moléculas inibem a todos os PADs activos com potência similar. Portanto, a necessidade de um ensaio fácil, que relata sobre a actividade de PAD4 é crucial. Até à data, PAD4 ensaios foram descritos que vincular a liberação de amônia a partir da reação de uma leitura colorimétrica 31, utilizar um análogo do substrato chloroamidine fluorescente etiquetado para teste de polarização fluorescente de 32, contam com a reação assistida por ácido entre glioxal e citrulina 33, e par a actividade PAD4 a um passo de fluorescência dequenching 34. Destes, apenas a estratégia haloacetamidine modificador covalente tem provado ser compatíveis com scre de alto rendimentoplataformas ening 32,35,36. Nós descrevemos um ensaio baseado fluorescência fácil, que mede de forma confiável a atividade de PAD4. O ensaio, que exibe uma forte relação de sinal-para-ruído, a velocidade de análise, e robustez de medição, tem o potencial para descobrir um verdadeiramente potente e selectivo inibidor PAD4.

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Protocolo

1. PAD4 Transformação, expressão e purificação

  1. Para PAD4 Transformação, transformar o plasmídeo pGEX contendo PAD4 GST fusão em E. quimicamente competente Coli (células BL21 (DE3)), as células para a expressão de proteínas utilizando o seguinte procedimento. Prepare (cloreto de cálcio) quimicamente competentes E. Coli (células BL21 (DE3)), as células de acordo com protocolos padrão.
    1. Descongelar 50 ul de previamente preparada quimicamente competentes BL21 (DE3) células em gelo e misturar com 1 ul do plasmídeo pGEX contendo o gene PAD4 num tubo de cultura de 5 mL. Incubar a mistura em gelo durante 10 minutos, enquanto agitando a cada 2 min.
    2. Calor chocar as células colocando a mistura em um banho de água a 42 C ° durante 40 seg. Colocar imediatamente a mistura de células-plasmídeo para trás em gelo durante 2 min para permitir que as células para recuperar. Adicionar 1 ml de caldo LB estéril à mistura e colocar em gelo durante 1 min.
    3. Incubar o calor células chocados a 37 ° C, agitação a 250 rpm durante 1hr. Pipetar 75 ul das células transformadas numa placa de ágar resistente à ampicilina e incubar a 37 ° C durante 15 h. Placa armazenar a 4 ° C.
  2. PAD4 Expressão.
    1. Picareta 1 colónia de células BL21 (DE3) a partir da placa de ágar e ampicilina-se em 5 ml de LB contendo ampicilina 1x. Colocar na incubadora e agite O / N a 37 ° C.
    2. Transferir os 5 ml de LB (kits) em 1 L de LB estéril contendo 1x tri-hidrato de ampicilina (PM 403,45 g / mol). Ponto de crescimento num incubador com agitação a 37 ° C. Monitorar a OD 600 do crescimento. Quando o crescimento atinge uma DO600 de 0,3, mova o crescimento em 16 ° C agitando incubadora.
    3. Ao atingir uma DO600 de 0,6, induzir as células com 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permitir que as células agitar por 15 horas a 16 ° C.
    4. Células colheita por centrifugação a 4000 xg durante 20 min a 0 ° C. Decantar o sobrenadante e pellet loja a -80 ° C.
  3. PAD4 Purificação
    1. Re-suspender o sedimento contendo o PAD4 expressa em BL21 (DE3) células num tampão de NaCl 50 mM (PM 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (PM 119,98 g / mol), 10 mM de imidazole (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM de ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lisar as células por sonicação durante 15 min a 4 ° C. Após sonicação, centrifugar o lisado celular a 20000 xg durante 20 min a 0 ° C. Deitar fora e salvar sobrenadante. Lote do sobrenadante com glutationa (GSH) esferas de agarose durante 30 minutos à TA.
    3. Drenar o sobrenadante das esferas de GST / coluna por acção da gravidade. Lavar as pérolas com 4 x 25 ml de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH = 8,0) à temperatura ambiente.
    4. Eluir PAD4 com 2 x 10 ml de tampão de eluição, 50 mM de tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutationa (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concentre PAD4 usando 100k MW corte-off tubos de centrífuga e centrifugar a 4000 xg durante 20 min a 4 ° C. Aliquota de proteína em 200 ul volumes de 1,0 ml em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.

2. Preparar soluções estoque para amortecedores

  1. Pesam-se cloreto de sódio (NaCl, PM 58,44 g / mol) e preparar uma solução 2 M. Misturar a solução até que clara.
  2. Pesar Tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparar uma solução 2 M, pH = 8,0. Misturar a solução até que clara.
  3. Pesam-se di-hidrato de cloreto de cálcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) e preparar uma solução 500 mM. Misturar a solução até que clara.
  4. Pesar de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparar uma solução 200 mM. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C.
  5. Pesar ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparar uma solução 1 M. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C.
  6. Prepararuma solução de 0,5% de Triton X-100.
  7. Pesar o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparar uma solução 100 mM. Misturar a solução até que clara.
  8. Pesar Z- Arg-Arg-7- amido- metilcumarina cloridrato de 4- (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparar uma solução a 10 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO).

3. PAD4 Ensaio a 37 ° C

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 125 mM de ZRcoum na água. Esta solução 125 uM ZRcoum será Solução A.
  2. Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, e PAD4 5 uM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  3. Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, e 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Este será Solução C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20° C. Este será Solução D.
  5. Obter uma placa de 96 poços e designar um número de poços para controlos (sem PAD4) e os poços de ensaio (+ PAD4).
  6. Pipeta 160 mL de solução B para poços de teste e pipeta de 160 mL de solução de C em poços de controlo. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
  7. Pipetar 40 ul de solução A em todos os poços e incubar a 37 ° C durante 45 min.
  8. Pipetar 10 ul de dH2O a metade dos poços de controlo e metade dos poços de teste. Para a outra metade dos poços de controlo e controlos de ensaio e pipetas 10 mL de solução de D. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
  9. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

4. Ensaio PAD4 à TA

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 50 mM de ZRcoum na água. Esta solução ZRcoum 50 uM será Solução A.
  2. Preparar um tampão de Na 100 mMCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, e 8 PAD4 uM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  3. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% e Triton X-100 (pH = 8,0). Este será Solução C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução D.
  5. Obter uma placa de 384 poços e poços para designar controles (sem PAD4) e poços de teste (+ PAD4).
  6. Pipetar 25 mL de solução B para poços de teste e pipeta de 25 mL de solução de C em poços de controlo. Permitir tampão com / sem PAD4 a incubar nos poços durante 20 min à TA.
  7. Pipetar 25 ul de solução C em todas as cavidades e incubar durante 45 min à temperatura ambiente.
  8. Pipetar 10 ul de dH2O a metade dos poços de controlo e metade dos poços de teste. Para a outra metade dos poços de controlo e controlos de ensaio, pipetae 10 ul de solução de D. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  9. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

5. PAD4 tempo do curso ensaios a 37 ° C e RT

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 125 mM de ZRcoum na água. Esta solução 125 uM ZRcoum será Solução A.
  2. Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, e PAD4 5 uM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  3. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução C.
  4. Obter duas placas de 96 poços e pipeta de 160 mL de solução B em # quantidade de poços (número de poços vai depender de quantos pontos de tempo).
  5. Incubar uma placa de 96 poços, a 37 ° C. Incubar a outra placa de 96 cavidades, à TA.
  6. Pipette 40 ul de solução A em todos os poços em ambas as placas de 96 poços e imediatamente pipeta 10 ul de solução C em t = 0 o mínimo de poços. Continue a adição de 10 ul de solução C em pontos de tempo específicos até que todos os poços foram temperada.
  7. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

6. Ensaio de Inibição PAD4 à TA

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução 83 mM de ZRcoum na água. Esta solução ZRcoum 83 uM será Solução A.
  2. Pesar Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparar uma solução stock de 100 uM. Este será Solução B.
  3. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, e 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Este será Solução C.
  4. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% e Triton X-100 (pH = 8,0). Thé será Solution D.
  5. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução E.
  6. Obter uma placa de 384 poços e poços para designar controles (sem PAD4), poços de teste (+ PAD4) e poços de inibição (PAD4 + Cl-amidina).
  7. Pipetar 25 mL de solução C em poços de teste e pipeta de 25 mL de solução de D em poços de controlo. Permitir tampão com / sem PAD4 a incubar nos poços durante 20 min à TA.
  8. Pipetar 10 ul de solução B em poços de inibição e incubar durante 20 min a RTe.
  9. Pipetar 15 ul de solução A em todos os poços e incubar durante 45 min à temperatura ambiente.
  10. Pipetar 10 mL de solução E para todos os poços. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  11. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

7. Ensaio Lisado celular brutoà TA

  1. Após a colheita de células PAD4 crescimento de 1 L, ressuspender as células em 10 ml de 50 mM Tris, 50 mM de NaCl, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM de ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lisar as células por sonicação durante 15 min a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado celular a 20000 xg durante 20 min a 0 ° C. Concentra-se o sobrenadante claro até metade do volume por centrifugação a 4.000 rpm a 4 ° C utilizando 100k MW tubos de centrífuga de corte.
  3. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 250 mM de ZRcoum na água. Esta solução 250 uM ZRcoum será Solução A.
  4. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, e TCEP 2 mM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  5. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução C.
  6. Obter um preto placa de 384 poços e designcomeu poços para controles (não lisado celular) e poços de teste (+ lisado celular).
  7. Pipetar 100 mL de solução B para todos os poços e pipeta 60 mL de lisado de células nos poços de teste. Incubar durante 20 min à TA.
  8. Pipetar 40 ul de solução A em todos os poços e incubar durante 45 min à temperatura ambiente.
  9. Pipetar 10 ul de solução C a todos os poços. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  10. Obter uma fluorescência leitura em leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

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Resultados

Inicialmente, foi demonstrado que ZRcoum pode informar sobre a actividade de PAD4 num formato de placa de 96 poços. Os poços foram incubados com o substrato ZRcoum e na presença / ausência de PAD4. Após um período de incubação de 45 min a 37 ° C, a fluorescência foi medida com um 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Como esperado, os níveis permaneceram baixos de fluorescência como o fluoróforo dentro ZRcoum (ou a citrulina ZRcoum) ma...

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Discussão

Aqui, um ensaio baseado em fluorescência foi desenvolvido com sucesso que monitora a atividade do PAD4. O ensaio provou ser incrivelmente robusto em várias condições de alto rendimento e também é compatível com lisados de células inteiras37.

A afinidade entre as proteínas histonas e as fitas de DNA que as cercam diminui devido à neutralização da carga positiva na cadeia lateral da arginina após a citrulinação. Previu-se que a neutralização da cadeia lateral da arginina poderia ser a...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Lehigh University Start-up Package. Agradecemos ao Dr. Walter Fast por fornecer o plasmídeo GST-PAD4 para expressão de proteínas.

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Materiais

http://www.perkinelmer.com
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KGa href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com
Ampicilina Trihidratada (Pó Esbranquiçado), BioReagentesFisher Fisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
Isopropiltiolactonse (IPTG)Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
Todos os Sais Tampão Fisher ScientificPode comprar da Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutationa (GSH) agarose Machery-Nagel745500.10Loja em 4 ° C; http://www.mn-net.com/
Cloroamidina Cayman Chemical 10599Armazenar a -20 ° C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 e 384)Compre na Corning; Software leitor de microplacas Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-controlwww.tecan.com
<<Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter

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