As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.
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Artigo de método
Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema de co-cultura OP9/OP9-DL1 tornou-se um método bem estabelecido para derivar tipos diferenciados de células sanguíneas de progenitores embrionários e hematopoiéticos de origem humana e de camundongos. Agora é usado para abordar uma variedade crescente de questões genéticas, celulares e moleculares complexas relacionadas à hematopoiese e está na vanguarda dos esforços para traduzir essas descobertas básicas em aplicações terapêuticas. Os procedimentos são diretos e rotineiramente produzem resultados robustos. No entanto, alcançar uma diferenciação hematopoiética bem-sucedida in vitro requer atenção especial aos detalhes da manutenção do reagente e da cultura celular. Além disso, o protocolo apresenta etapas sensíveis à técnica que, embora não sejam difíceis, exigem cuidado e prática para dominar. Aqui nos concentramos nos procedimentos de diferenciação de linfócitos T de células-tronco embrionárias de camundongos (mESC). Fornecemos um protocolo detalhado com discussões sobre as etapas e parâmetros críticos que permitem a diferenciação celular reprodutivelmente robusta in vitro. É do interesse do campo considerar uma adoção mais ampla dessa tecnologia, pois ela tem o potencial de reduzir o uso de animais, diminuir o custo e encurtar os prazos da experimentação básica e translacional.
Introdução
Um sistema de cultura de células foi estabelecido no qual células-tronco embrionárias de camundongo (mESC) são diferenciadas em células T in vitro.1 Este sistema explora a capacidade da sinalização Notch de impulsionar a diferenciação das células T. 2 A linhagem celular OP9-DL1 foi criada pela transdução de células OP9 derivadas da medula óssea3 com um ligante Notch, semelhante ao Delta 1 (DL1). 4 A ativação da cascata de sinalização Notch in vitro facilita o desenvolvimento de células T com a exclusão de outras linhagens celulares. Com a inclusão de citocinas apropriadas, este sistema fornece um "microambi....
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Protocolo
1 Preparação de Meios de Cultura, Citocinas e placas gelatinizado
- Preparar meios celulares ES utilizando Modificação de Meio de Eagle (DMEM) da Dulbecco com glucose elevada e piruvato de sódio. Adicionar 20% CES qualificado de Soro Fetal Bovino (FBS), 1% Penicilina / Estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de HEPES, 1% de não-aminoácidos essenciais, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoetanol. Esterilizar meios de células ES por filtração.
- Prepare mídia OP9, fazendo 1 L de alfa Meio Essencial Mínimo (MEM-α) de pó de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomi....
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Resultados
Quando cultivado em MEFs na presença de LIF, mESCs pode ser mantido num estado indiferenciado. Em condições ideais, eles aparecem como colônias compactas de células rodeadas por um halo brilhante em microscopia de contraste de fase (Figura 1). Estas culturas devem ser monitorizados diariamente. Dependendo da confluência das células, a mídia pode ser alterado ou células podem ser divididos. Vizinhas colônias Mesc não deve vir para o ponto de contato com o outro. Uma cultura normal, saudável de mESCs indi.......
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Discussão
O sistema OP9-DL1 co-cultura foi utilizada para estudar o papel de vários produtos de genes durante o desenvolvimento de tipos de células do sangue a partir de células estaminais. 8,12,13 Provou também um modelo eficaz para estudar a função de genes de DNA regulador durante a diferenciação celular 9,14. Usando essa abordagem como uma alternativa aos modelos inteiros rato pode render uma considerável economia de tempo e custo de experimentos que abordam muitas questões básicas na hematopoiese. No en.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Joon Kim pela assistência especializada em citometria de fluxo. A pesquisa nos laboratórios dos autores é apoiada pelo programa SCORE dos Institutos Nacionais de Saúde (concessão SC1-GM095402 para BDO) e pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (para JCZP). J.C.Z.P. é apoiado por uma Cátedra de Pesquisa do Canadá em Imunologia do Desenvolvimento. A infraestrutura de pesquisa biomédica do Hunter College é apoiada em parte pelo programa NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) por meio de MD007599 de subsídios. Também reconhecemos o Programa de Ciência de Células-Tronco do Estado de Nova York (NYSTEM) por seu apoio ao início da pesquisa....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Qualificado para células-tronco FBS | Gemini | 100-125 | inativada por calor |
| Corning | 30-002-CI | ||
| L-alanil L-glutamina | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES tampão | Millipore | TMS-003-C | |
| Aminoácidos Não Essenciais | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Solução Regent de Gentamicina (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoetanol (55 mM) em DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Unidade de Filtro | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μ m Membrana PES |
| Grau de Cultura de Células Água | Corning | 25-055-CM& | |
| alpha;-MEM | Tecnologias de Vida | 12000-022 | Pó, reconstituir por recomendação de fabricação |
| Bicarbonato de sódio | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Teste de lotes individuais necessários |
| Sulfóxido de Dimetilo | Sigma | D2650 | |
| Ligante Flt-3 humano recombinante | R& D Systems | 308-FK | |
| Recombinante Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure água com 0,1% de gelatina | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomicina C tratada | Millipore | PMEF-CF | Qualquer MEFs mitoticamente preso pode ser usado |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Filtro de células (40 μ m) | Fisher | 22363547 | |
| Placa de cultura de tecidos 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6 poços | BD Falcon | 353046 | |
| tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Tubos de centrífuga de 15 ml | BD Falcon | 352096 | |
| Tubos de centrífuga de 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| Tubo de Poliestireno de 5 ml com Tampa de Filtro | de Célula Tubos BD Falcon | 352235 | para FACS |
| Células ES R1 | Células | ||
| OP9 | As células podem ser obtidas no Riken Laboratory Cell Repository (Japão). | ||
| Células OP9-DL1 | As células podem ser solicitadas ao Zú ñ iga-Pflü Laboratório Cker. | ||
| Software FlowJo | Tree Star | FACS | |
| Citômetro de fluxo | BD | FACScan, FACSCalibur e FACSVantage foram usados em nosso laboratório |
Referências
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notc....
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Reimpressões e permissões
