In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

Resumo

Dois métodos baseados em citometria de fluxo - um ensaio de priming de células T in vitro e coloração de citocinas intracelulares foram utilizados para medir a capacidade de apresentação de antígenos de células dendríticas e respostas de células T específicas do antígeno a uma infecção mutante pelo vírus do Nilo Ocidental em camundongos.

Resumo

Um vírus atenuado do Nilo Ocidental (WNV), um não-estrutural (NS) 4B-P38G mutante, citocina induzida maior inata e respostas de células T do que o de tipo selvagem em ratinhos WNV. Recentemente, factor de diferenciação mielóide 88 (MyD88) de sinalização foi mostrado ser importante para o escorvamento inicial das células T e o desenvolvimento de células T de memória durante a infecção mutante WNV NS4B-P38G. Neste estudo, dois fluir métodos baseados em citometria - in vitro de células T e um ensaio de priming citocina coloração intracelular (ICS) - foram utilizados para avaliar as células dendríticas (DC) e funções de células T. Na célula T priming ensaio, a proliferação celular foi analisada por citometria de fluxo após a co-cultura de DC a partir de ambos os grupos de ratinhos com éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) - rotulados células T CD4 ⁺ de ratinhos transgénicos OTII. Esta abordagem proporcionou uma determinação exacta da percentagem de proliferação de células T CD4 ⁺ com melhorou significativamente a sensibilidade global do que a tradiçãoai ensaia com reagentes radioactivos. Um sistema de tubo de microcentrifugadora foi utilizado em ambos os procedimentos de cultura de células e de coloração de citocinas do protocolo ICS. Comparado com o tradicional sistema baseado em placa de cultura de tecido, este procedimento modificado foi mais fácil para se apresentar no nível de biossegurança (BL) 3 instalações. Além disso, as células infectadas foram tratadas com WNV- paraformaldeído em ambos os ensaios, o que permitiu uma análise mais aprofundada fora das unidades de BL3. Em geral, estes ensaios imunológicos in vitro pode ser utilizado para avaliar a eficiência mediada por respostas imunes celulares durante infecção WNV.

Introdução

Vírus do Nilo Ocidental (WNV), um neurotrópico, plus-sensoriamento flavivírus, é uma ameaça emergente de saúde pública. Actualmente, não há vacinas foram aprovados para uso humano ^1. Uma estirpe atenuada WNV, o qual possui uma substituição no P38G não estrutural (NS) da proteína 4B, é conhecida por induzir sem letalidade em ratinhos mas citocinas maior inatas e respostas de células T em ratinhos de tipo selvagem do que o WNV NY99 estirpe ^2. Os ratinhos imunizados com o mutante NS4B-P38G foram todos protegidos a partir de um desafio letal com secundária de tipo selvagem WNV. Isto sugere que o mutante de NS4B-P38G tem características apropriadas para um candidato a vacina ideal. Os mecanismos pelos quais o mutante NS4B-P38G induz a imunidade adaptativa protetor de alta não são claramente entendidos ainda. Receptores do tipo Toll (TLRs) que reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogénicos, desempenham um papel essencial na iniciação da imunidade inata de infecção viral. A via de sinalização TLR núcleo utiliza mielóide resposta diferenciação primária gene 88 (MyD88) como o adaptador primário ^3,4. Em um estudo recente, a sinalização MyD88 foi mostrado desempenhar um papel importante no desenvolvimento da imunidade mediada por células durante a infecção mutante WNV NS4B- P38G em ratinhos ^5. As células dendríticas (CDs) são uma das células apresentadoras de antigénio que apresentam mais importantes a capacidade única para iniciar respostas de células T primárias durante a infecção viral ^6,7. As células T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ ambos contribuem para a imunidade protetora de longa duração e são importantes para a sobrevivência de acolhimento na sequência de tipo selvagem infecção WNV ^8,9. Dois ensaios imunológicos foram utilizados neste estudo para avaliar as funções destas células nos mutantes de camundongos infectados com NS4B-P38G.

Em primeiro lugar, um ensaio in vitro priming células T foi utilizado para comparar a capacidade apresentadora de antigénio de DCs infectadas com WNV de tipo selvagem e MyD88 ^{- / -} ratos. Para aumentar a sensibilidade do ensaio, naïve CD4 ^{+ células T foram isoladas a partir de ratinhos transgénicos, que expressam OTII um específico Vα2 / Vβ5 TCR para a ovalbumina de galinha (OVA), péptido 323 - 339. DCs de camundongos infectados WNV foram purificados, e co-cultivados com carboxifluoresceína succinimidil páscoa (CFSE marcado com células) na presença de OVA péptido T CD4 +. Após 5 dias de co-cultura, as células foram recolhidas e fixadas com paraformaldeído (PFA) e analisadas por citometria de fluxo. Os ensaios de proliferação foram tradicionalmente realizada através da incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) ou timina deoxyriboside tritiada (3HTdR) 10. No entanto, estes ensaios são ou radioativo e / ou que necessitam de equipamentos especiais a nível de biossegurança (BL) 3 instalações, onde os estudos são conduzidos WNV. A análise de citometria de fluxo da proliferação de linfócitos por redução a metade de série da intensidade de fluorescência do corante vital CFSE tornou-se mais comumente utilizado em ensaios imunológicos, como o corante é mais estavelmentee uniformemente incorporado nas células, detectado facilmente por citometria de fluxo, e é não radioactiva 11. O ensaio também tem a capacidade de avaliar o número de divisões celulares. Uma grande vantagem da utilização deste teste em estudos WNV é que a fixação das células infectadas com 1-2% PFA poderia inactivar WNV 12, que vai permitir a aquisição de amostras com um citómetro de fluxo em um laboratório BL2.}

Em seguida, um processo de coloração de citocinas intracelulares modificado (ICS) foi usado para estudar o papel da sinalização MyD88 na regulação de respostas de células T WNV específicos em NS4B-P38G ratos infectados com mutantes. Neste ensaio, os esplenócitos isolados de ratinhos infectados foram tratados in vitro com péptidos específicos WNV. Brefeldina A foi adicionada para reter as citocinas no interior da célula. Após 5 horas de incubação, as células foram colhidas, lavadas e coradas para subconjuntos de células T. As células foram depois fixadas em PFA, permeabilizadas e coradas para o interferão (IFN) -γ e analisadas por citometria de fluxo.Como com outro ensaio baseado em citometria de fluxo, uma vez que as células são tratadas com tampão de fixação e permeabilização contendo PFA, amostras infectadas podem ser transferidas para um laboratório BL2 para posterior processamento e análise. Em vários estudos publicados, temos usado ICS para medir T funções efetoras de células em camundongos infectados com WNV ^13,14. Embora esteja bem estabelecida, uma desvantagem principal deste ensaio é que o processo é muito lento e pode ser mais demorado quando realizada dentro das instalações BL3. Aqui, um método de ICS baseado no tubo de micro-centrifugação foi demonstrado ser mais viável, mais fácil proceder e menos demoradas quando realizada dentro de um laboratório BL3.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Texas Medical Branch.

1. Isolamento de DCs de não-infectados e infectados pelo WNV Mice

1. Idade e sexo partida 6-10 semanas de idade, do tipo selvagem C57BL / 6 (B6) e MyD88 ^{- / -} ratos. Inocular por via intraperitoneal (ip) com 500 placas formando unidade (UFP) de WNV NS4B- P38G mutante. No dia 3 de pós-infecção, eutanásia MyD88 B6 e ^{- / -} ratos com CO _2. Use camundongos não infectados de ambos os grupos como controles. Use três murganhos de cada grupo.
2. Pele molhada no lado esquerdo do rato sacrificados com etanol 70% e cortar a pele ao longo do lado esquerdo do mouse, a meio caminho entre as pernas dianteiras e traseiras. Cortar abrir a cavidade do corpo. Remover o baço, utilizando a pinça. Inserir o baço em uma placa de Petri com meio RPMI.
3. Isolar DCs esplénicas utilizando esferas magnéticas anti-CD11c segundoas instruções do fabricante.

2. Purificação e marcação das células T de OTII Transgenic Mice

1. Colheita um baço de um rato OTII ingénuos como descrito no passo 1.2 acima e homogeneizar o baço entre as extremidades foscas de duas lâminas. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml, adicionar meio RPMI até 14 ml. Deixe a suspensão sentar por 5 min e 13 ml de transferir-lo para um novo tubo de 15 ml.
2. Isolar células T CD4 ⁺ de baço utilizando um kit de isolamento de células T CD4 ⁺ de acordo com as instruções do fabricante.
3. Transferência de células para um tubo cónico de 50 ml, lavar duas vezes com PBS. Ressuspender as células em PBS com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) a 1 x 10 ⁶ culas por ml, e adicionar 0,5 umol / ml de CFSE. Incubar a 37 ° C durante 10 minutos, ao abrigo da luz.
4. Adicionar 5 ml de meio completo frio (RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 1/100 volantibióticos / antimicóticos, 1/100 vol de L-glutamina e 1 / 1.000 vol de 1000 x 2-mercaptoetanol).
5. Incubar em gelo durante 5 min. Lave as células uma vez com PBS, corrigir 0,2 x 10 ⁶ células CD4 ⁺ T rotulados em 2% PFA e adquirir em um citômetro de fluxo. Utilize essa amostra para determinar o nível basal de CFSE. Re-suspender o resto de células marcadas em meio completo.

3. Co-cultura OTII T células com DCs de infectados pelo WNV Mice

1. Cultura de 2 x 10 ⁵ células purificadas de ratos OTII T CD4 ^+, sozinho ou com as DCs purificadas de tipo selvagem ou MyD88 ^{- / -} murganhos (2 x 10 ⁴⁾ em uma placa de 24 poços com ou sem OVA 323-339 resíduo (1 g / ml) em 1 ml de meio completo por poço.
2. Incubar as células a 37 ° C durante 5 dias. Células colheita, lavar duas vezes em tampão FACS (PBS com 1% FBS) e fixar em 0,25 ml de 2% PFA. Vortex imediatamente.

4. Citometria de Fluxo de Análise In Vitro </ Em> T celular Priming

1. Para aquisição, clique duas vezes no ícone do software de citometria de fluxo. Para uma parcela densidade linear FSC-A vs. linear SSC-A, selecionar canais 0 a 200.000 em FSC-A e 0 a 200.000 em SSC-A. Em seguida, crie um portão em células vivas (P2; ver Figura 1A).
2. Para analisar a intensidade de fluorescência de CFSE, abra o histograma do canal FL1 e adquirir 20.000 eventos sobre a população fechado. Configurar um marcador em amostras de células cultivadas OTII sozinho (Figura 1A).
3. Adquirir amostras de células OTII co-cultivadas com DC do tipo selvagem (Figura 1B) ou MyD88 ^{- / -} DC (Figura 1C) de um modo semelhante.

5. Isolamento e Estimulação de Esplenócitos para Cytokine Ensaios

1. Infect B6 e MyD88 ^{- / -} ratos com mutante WNV NS4B-P38G, utilizando o mesmo procedimento como descrito no step 1.1. No dia 30 pós-infecção, re-desafio sobreviver camundongos com 2.000 UFP do tipo selvagem WNV ip estirpe Nos dias 8 e 21 de infecção WNV pós-primária ou no dia 4 após a infecção secundária, eutanásia ratos com CO ₂ para a coleção de baços .
   NOTA: Nós usamos 2-3 ratos por grupo para cada ponto de tempo.
2. Adicione uma suspensão de células isoladas de esplenócitos como acima descrito no passo 1.2 e passo 2.2. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e re-suspender-los em 10 ml de meio completo.
3. Dilui-se as células com meio completo a 2,5 x 10 ⁶ células / ml. Adicionar 1 ml de esplenócitos em um tubo de micro-centrifugação de 1,5 ml.
4. Para simular as células T CD8 ^+, diluir NS4B e E péptidos específicos de WNV (SSVWNATTA e IALTFLAV) a 1 mg / ml em DMSO. Para a estimulação de células T CD4 ^+, diluir NS3 e E péptidos específicos de WNV (RRWCFDGPRTNTILE e PVGRLVTVNPFVSVA) a 1 mg / ml em DMSO. Adicionar 10 ul de péptidos para as células followed por 1 ml de Brefeldin A solução. Use células sem tratamento como controlos de péptidos. Misturar as células.
5. Faça dois furos com uma agulha 18 G na tampa do tubo. Incubar as células a 37 ° C durante 5 h.

6. intracelular Cytokine Coloração

1. Transferência de células para um novo tubo de micro-centrífuga. Gire células por 5 min a 300-400 xg e deitar fora o sobrenadante. Adicionar 1 ml de tampão FACS, rotação 5 min a 300-400 xg e suspender novamente as células por pipetagem com 120 ul FACS buffer.
2. Adicionar 2 mL de Fc bloqueador de células e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar 1 mL de tampão de FACS para cada tubo. Rotação 5 min a 300-400 x g.
3. Re-suspender as células em 300 ul FACS tampão e dividi-los em três tubos (cerca de 0,8 x 10 ⁶ células por tubo). Como mostrado na Tabela 1, reservam-se o primeiro tubo de cada condição de cultura para rato IgG-PE de coloração. Para o segundo tubo, adicionar 3 mL de anti-CD4 APC para CD4 células peptídeos-tratados, 3 μl de anti-CD8 FITC às células tratadas com péptidos ou CD8 ambos os anticorpos a células sem tratamento com péptidos. Use o terceiro tubo para a coloração de compensação. Para cada condição de cultura, utilize três tubos de células marcadas com APC conjugada CD4, CD8 conjugado com FITC ou anticorpos marcados pe- CD3 (3 mL por tubo), como controles de compensação para FL1, FL2 e canais FL4.
4. Células Vortex brevemente. Deixar em gelo durante 20 min e proteger da luz. Adicionar 1,4 ml de tampão de FACS. Gire 5 min a 300-400 xg e deitar fora o sobrenadante.
5. Agita-se a pelete de células perturbar (ou brevemente vórtice). Re-suspender pellet celular em 250 ul fixação / permeabilização solutionby pipetagem. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min e proteger da luz.
6. Adicionar 1,2 ml de tampão de FACS. Rotação 5 min a 300-400 xg e ressuspender as células em 300 ul de tampão de FACS.
   NOTA: Neste ponto, as células podem ser transferidas para um laboratório BL2 para processamento adicional ou armazenada num frigorífico e protegida da luz durante up a três dias.
7. Adicionar 500 ul de tampão de FACS. Rotação 5 min a 300-400 xg e ressuspender as células em 500 ul de tampão de permeabilização / lavagem 1x. Rotação 5 min a 300-400 x g.
8. Re-suspender as células em 100 l 1x Perm / Wash, adicionar 3,5 ul anti-IFN-y-PE ao tubo adicionou anteriormente com anticorpos para CD4 e / ou marcadores de células T CD8 em passo 6,3 e 3,5 l rato IgG-PE no tubo reservados para IgG de controlo, durante 25 min em gelo e proteger da luz. Lave as células, adicionando 1,4 ml de tampão de permeabilização / lavagem 1x. Rotação 5 min a 300-400 x g. Repita a etapa de lavagem, adicionando 1,4 ml 1x tampão permeabilização / lavagem.
9. Gire 5 min a 300-400 xg e decantar o sobrenadante. Lavar as células por adição de 1,4 mL de tampão de FACS e re-suspensão em 400 ul de tampão de FACS para aquisição final.

7. Análise de Citometria de Fluxo Coloração de citocinas intracelulares

1. Use as mesmas configurações de aquisição como no passo 4.1. Create um portão em células vivas (P2; ver Figura 2A). Ajustar as tensões utilizando os tubos de compensação para cada grupo.
2. Abertas dois novos gráficos de pontos, uma para visualizar os dados recolhidos para FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), e o outro é para exibir os dados recolhidos para FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Adquirir 50.000 eventos para a população fechado de cada amostra.

Resultados

No ensaio de células T de escorva, as células T CD4 ⁺ foram cultivadas CFSE rotulados com DCs purificadas a partir do tipo selvagem NS4B-P38G infectadas com mutante e MyD88 ^{- / -} ratos na presença ou ausência de péptidos OVA. As células T cultivadas marcadas por si só, com ou sem OVA durante 5 dias, foram utilizadas como controlos negativos. Como mostrado na Figura 1A, as células T totais foram fechado para a análise da intensidade de fluorescência no canal FL1. O marcador foi cria...

Discussão

WNV é um patógeno BL3. Devido às normas de segurança, testes imunológicos com amostras infectadas com WNV muitas vezes são limitadas pela disponibilidade de equipamentos no BL3 instalações ou mais longo e tedioso para executar. Em um recente estudo, foram utilizados dois métodos baseados em citometria de fluxo para estudar as respostas imunes mediadas por células durante a infecção WNV ^5. Em ambos os ensaios, as células infectadas com WNV foram tratados com 1-2% PFA directamente ou com uma solução de fixação ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Invitrogen	11875	aquece a 37 &graus; C
grânulos magnéticos anti-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	seguem o fabricante s instruções
anti-CD4 contas magnéticas	Miltenyi Biotec	130-095-248	siga o fabricante' s instruções
CFSE	Invitrogen	C34554
Resíduo OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptídeos	Proimune	PC0AD-D
Brefeldin A solução	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	conjugado com APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 conjugado com FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Solução de Fixação/Permeabilização	BD-Bioscience	554722
Permeabilização/tampão de lavagem	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Citômetro de fluxo Accuri	BD Biociência