Introduction
Liposomen wurden intensiv untersucht und als eine der biokompatiblen biomedizinischen Arzneimittelabgabesysteme für klinische Anwendungen 1,2. Sie werden hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterin, die beide biokompatible Verbindungen nachahmen Teile Natur Zellmembranen besteht. Erwägung, hydrophilen Substanzen können in dem wässrigen Innenraum eingeschlossen werden können lipophile Wirkstoffe in der Liposomen-Phospholipid-Doppelschicht 3 eingebracht werden. Einkapselung von Stoffen in wässrigen Inneren von Liposomen gewährt Schutz gegen Abbau in vivo und verhindert auch das Host-System von toxischen Wirkungen von Zytostatika für die Therapie von Krankheiten verwendet werden, zum Beispiel Chemotherapeutika auf die Zerstörung von Tumorzellen gerichtet. Die Modifikation der liposomalen Oberfläche mit Polymeren, wie Polyethylenglycol (PEGylierung) erweitert die liposomale Blutzirkulationszeit in vivo aufgrund sterischer Stabilisierung 4. MoreovER, Liposomen können hohe Konzentrationen von mehreren Substanzen, wie Proteine 5,6, hydrophilen Substanzen 7,8 und Enzyme 9 sequestrieren. Sie dienen somit als zuverlässige klinische therapeutische und diagnostische Instrumente, die ihre Zustimmung für die Lieferung von Zytostatika verdienen wie Doxorubicin für die Krebstherapie 4. Aufgrund ihrer Flexibilität können Liposomen auch mit Fluorochromen für diagnostische und bildgeführte chirurgische Zwecke geladen werden.
Fluoreszenz-Bildgebung liefert eine kostengünstige und nicht-invasive in vivo-Diagnosewerkzeug, erfordert jedoch einige grundlegende Anforderungen. Es konnte gezeigt werden, dass Fluoreszenzfarbstoffe, die am besten für die in-vivo-Bildgebung angepasst haben charakteristische Absorptions- und Emissionsmaxima im Bereich, wo Lichtverteilung und Streuung sowie Gewebeautofluoreszenz aus dem Wasser stamm und Hämoglobin ist gering. So haben solche Sonden ihre abs / em Maxima zwischen 650 und 900 nm 10. Außerdem ist die Stabilität von Farbstoffen in vitro und in vivo kritisch, Opsonisierung und schnellen Clearance kann stark ihre Anwendung für die in vivo-Bildgebung 11 begrenzen. Andere Effekte, wie geringe Stabilität und eine geringe Empfindlichkeit oder zytotoxische Wirkung auf Zielorgane wie Indocyaningrün (ICG) 12-16 zu sehen ist, sind unerwünscht und müssen berücksichtigt werden, wenn Sonden für die in-vivo-Bildgebung genommen werden. Diese Beobachtungen haben zur Entwicklung von aktiven verschiedenen präklinischen NIR Fluorochrome, Nanopartikel sowie neue Techniken für die in vivo-Abbildung von Entzündungsprozessen, Krebs und für die bildgeführte Chirurgie 17-20 geführt. Trotz der Stabilität der meisten präklinischen NIRF (Nah-Infrarot-Fluoreszenz) Farbstoffe in vitro, deren rasche Perfusion und Clearance durch die Leber und Nieren, behindern den Einsatz in der in-vivo-optischen Bildgebungs von Erkrankungen und entzündlichen Prozessen.
ntent "> Wir haben daher für die Einkapselung von Farbstoffen stellen ein Protokoll wie das gut charakterisiert Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff DY-676-COOH, das für seine Tendenz bei relativ hohen Konzentrationen 21 in Liposomen bekanntlich Selbst Quench. Bei hohen Konzentrationen H- Dimerbildung und / oder pi-Stapelwechselwirkungen zwischen Fluorophor-Moleküle innerhalb Förster-Radius Ergebnis des jeweils anderen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen den Fluorochrommoleküle entfernt. Bei niedrigen Konzentration in den Raum zwischen den Fluorophor-Moleküle zu, wodurch pi-Stacking-Interaktion zu verhindern, und H-Dimerbildung und dadurch hohe Fluoreszenzemission. Der Wechsel zwischen hoher und niedriger Konzentration und dem begleitenden Fluoreszenzlöschung und die Aktivierung ist eine vielversprechende Strategie, die zur optischen Abbildung 22 ausgenutzt werden kann. In dieser Hinsicht, Verkapselung von hohen Konzentrationen an NIRF-Farbstoff DY-676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen ist fastigen für die in vivo-Bildgebung ist als der freie Farbstoff. Die Aufgabe des Verfahrens liegt vor allem in der richtigen Verkapselung und zweitens bei der Validierung der Vorteile aus Einkapseln hohen Konzentrationen des Farbstoffs resultiert. Vergleich der Abbildungseigenschaften des abgeschreckten Liposomen mit der des freien Farbstoffes und auch mit einem nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit geringer Konzentration des Farbstoffs ist unverzichtbar. Wir zeigen durch eine einfache, aber sehr effektive Filmflüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll in Verbindung mit alternativen Frost-Tau-Zyklen, die Verkapselung von Abschrecken Konzentrationen von DY-676-COOH in Liposomen möglich ist. Andere Methoden, um Liposomen herzustellen, wie die Umkehrphasenverdampfungsverfahren 23 sowie der Ethanol-Injektionsmethode 24 ermöglichen Liposomzubereitung mit hoher Einschlusseffizienz für viele hydrophile Substanzen. Allerdings ist die Art der zu verkapselnden Substanz können die Einkapselungseffizienz beeinflussen. TatsächlichDas hier vorgestellte Film Flüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll ergeben, die höchste Effizienz für die Verkapselung von DY-676-COOH. Um die Vorteile der liposomalen Verkapselung von DY-676-COOH, einem Zymosan-induzierte Ödem-Modell, das die Untersuchung von Entzündungsprozessen innerhalb von einigen Stunden erlaubt illustrieren, wurde verwendet. Hier wird gezeigt, daß Liposomen mit einer hohen Konzentration des eingekapselten DY-676-COOH in vivo optische Bildgebung von Entzündungsprozessen als der freie Farbstoff oder das nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit niedriger Farbstoffkonzentrationen besser geeignet für den ganzen Körper. So ist die zugrunde liegende Protokoll bietet eine einfache und schnelle Methode, um abgeschreckt fluoreszierende Liposomen und die Validierung ihrer Aktivierung und Bildgebung Potenzial sowohl in vitro als auch in vivo zu produzieren.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Alle Vorgänge werden von der regionalen Tierausschuss und im Einklang mit internationalen Leitlinien für die ethische Nutzung von Tieren zugelassen.
1. Herstellung der Materialien und Instrumente
- Vorbereitung der spontan gebildeten Vesikeldispersion (SFV)
- Auflösen und die Stammlösungen der folgenden Phospholipide: 214 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (EPC), 134 mg / ml Cholesterin, 122 mg / ml 1,2-Distearoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Methoxy (Polyethylen Glykol) -2000] (Ammoniumsalz) (mPEG 2000 -DSPE) und 2 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (Ammoniumsalz) (NBD-DOPE) in Chloroform und lagern in Glasfläschchen.
- Einrichten ca. 3 ml Chloroform in einem Rundkolben, und übertragen Sie die entsprechende Volumen von Phospholipid-Stammlösung in den Rundkolben zu Liposomen EP, Haft-C: Chol: mPEG 2000 -DSPE in einem Molverhältnis von 6,5: 3: 0,5. Für Doppelfluoreszenzmarkierung von Liposomen hinzufügen 0,3 mol% NBD-DOPE in die Lipid-Lösung.
- Nach Abdampfen des Chloroforms aus der organischen Phospholipid-Lösung unter vermindertem Druck (300 mbar) bei 55 ° C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers.
- Nachdem eine homogene Phospholipid-Film gebildet wird, verringern den Druck auf 10 mbar für 1-2 Stunden, um restliche Chloroform Anzahlung zu entfernen.
- Während das Chloroform verdampft, aufzulösen DY-676-COOH (6,181 uM) in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 und füllen ein Dewar-Gefäß mit flüssigem Stickstoff. Schalten Sie ein Ultraschallbad und bei 50 ° C eingestellt.
- Bringen Sie ein geeignetes Volumen (0,5-1 ml) der DY-676-COOH (6,181 uM) Lösung für das Rundkolben, um das trockene Phospholipidfilm und kräftig vortexen, bis ein spontan gebildeten Vesikel (SFV) Dispersion Formen hydratisieren. Sicherstellen, dass alle Phospholipide dispergiert werden, um Lipidverlust zu vermeiden.
- Sorgfältig transfer den Rundkolben mit dem SFV Dispersion in flüssigem Stickstoff einfrieren und die Dispersion für 3-5 min. Setzen Sie den Rundkolben in einem Ultraschallbad bei 50 ° C, um die Dispersion auftauen vortexen die Dispersion kräftig 1-2 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal, also insgesamt sieben Frost-Tau-Zyklen.
- Extrusion von SFV homogene Liposomvesikel bilden
- Übertragen der SFV Dispersion in eine 1 ml Spritze (Spritze-a) und Extrudieren der Dispersion durch ein 100 nm Polycarbonat-Membran mit einem LiposoFast Basis-Extruder in spritzen b.
- Extrudieren der Dispersion von der Spritze-b, zurück in die Spritze-a, dann zehnmal wiederholen Sie den Zyklus. Aufgrund der Extrusion der Lösung in der Spritze sich von einem trübes Aussehen auf eine klare Dispersion mit der Zeit. Nach zehn Zyklen (zwanzig Einzelextrusionsschritten) zu entfernen Spritze-b aus dem Gerät und extrudieren die Dispersion für das letzte Mal von der Spritze-a direkt in eine sterile1,5 ml Reaktionsgefäß.
- Die Reinigung des liposomal verkapselten DY-676-COOH aus freien Farbstoff
- Vorbereiten einer Gelchromatographiesäule mit G25 Kügelchen in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 (Säulenlänge 28 cm, Durchmesser 0,8 cm) eingeweicht.
- Übertragen Sie 0,5 ml extrudierte Vesikel-Dispersion auf das Gelbett und lassen Sie die Beispielablauf in die Gelmatrix.
- Eluieren die Liposomen mit 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 (Figur 1A) und wäscht die Säule bis die freien Farbstoff restlos aus der Säule. Wenn es sein muss, sammeln und verwerten die freie Farbstoff durch Entsalzung und Austrocknung nach den Anweisungen des Herstellers.
- Konzentrieren der eluierten Liposomen durch Ultrazentrifugation (200.000 x g, 2 Stunden bei 8 ° C) und dann zu dispergieren sie in ausreichenden Volumen an sterilem 10 mM Tris-Puffer pH 7,4.
- Die Quantifizierung der gekapselten DY-676-COOH-Konzentration
- Eine Eichkurve, die durch Auflösen von DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1% Triton X100.
- Löse 2 ul (100 nmol Lipidendkonzentration einer 50 mmol / L stock) der Liposomen für 5 min bei Raumtemperatur in 100 ul Tris-Puffer, der 1% Triton X100, um die Bläschen zu zerstören und Freigabe des eingekapselten Farbstoffes. Dann verdünnte Proben mit 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4 auf eine endgültige Triton-X100-Konzentration von 0,1% (v / v) was ein Gesamtvolumen von 1 ml. Bereiten Sie alle Proben in Doppelbestimmung.
- Messung der Absorption und Emission von allen Proben (freie DY-676-COOH und Triton-X100 behandelten Liposomen) bei einer Anregung λ = 645 nm und einer Emissions λ = 700 nm. Herzustellen und verwenden eine Eichkurve des freien Farbstoffs, um die Konzentration des eingekapselten Farbstoffes zu bestimmen.
- Liposomen-Charakterisierung
- Bestimmen Sie die Größe und Zetapotential der Liposomen durch dynamische Lichtstreuung. Verdünne die liposomalen Proben sterilfiltriert (0,2 um) 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 bis aconzentration von 100-300 & mgr; M (Lipid). Übertragen Sie die verdünnten Proben in geringer Lautstärke Einwegküvette und messen Sie die Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Charakterisierung der Liposomen durch Elektronenmikroskopie, um die Größe, die Integrität und Homogenität der liposomalen Vesikel nach Standardprotokollen zu untermauern.
2. Validierung des Fluoreszenz-Abschrecken und Aktivierung der hergestellten Liposomen
- Physikalisch-chemische Analyse der Fluoreszenzlöschung und Aktivierung
- Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen für die Lip-Q und 2 Röhren für den freien DY-676-COOH. Über 100 nmol Gesamtlipide (2,38 ul einer 42 mmol / l Lip-Q-Stammlösung, enthält 138 ug / ml des verkapselten DY-676-COOH) in die entsprechenden Röhrchen. Ablösefrei DY-676-COOH entspricht der Farbstoffgehalt von Lip-Q (0,38 & mgr; g, die zum Beispiel von 138 g / 1.000 ul x 2,38 ul Lip-Q verwendet, ergibt). Inkubieren einer Wannee jeder Sonde bei 4 ° C und gefrier das zweite Rohr bei -80 ° C über Nacht (16 h).
- Heizen Sie einen Heizblock auf 30 ° C. Füllen Sie eine Kühlbox mit Crushed Ice und Gleichgewicht ein Aliquot von 10 mM Tris-Puffer pH 7,4, auf Raumtemperatur.
- Sonden entfernen von 4 ° C und bei Raumtemperatur äquilibrieren von -80 ° C auf 30 ° C für 5 min (in Aluminiumfolie eingewickelt, um vor Licht zu schützen), und schnell auftauen Sonden. Kühlen Sie die aufgetauten Proben auf Eis für 1 Minute vor der Übertragung auf Raumtemperatur (auch in Aluminiumfolie eingewickelt, um den Inhalt vor Licht zu schützen).
- Zugabe von 10 mM Tris-Puffer (pH 7,4) zu jeder der Sonden auf 100 ul Endvolumen und äquilibrieren alle Sonden bei RT für 10 min.
- Pipette 80 ul jeder Sonde in geringer Lautstärke Glasküvette und Messung der Absorption von jeder Sonde 400 bis 900 nm mit einem Spektrometer. Bringen Sie die Sonde in die entsprechenden Röhrchen.
- Übertragen wurden 80 ul jeder Probe in einen geeigneten Glasküvetteund Messung der Fluoreszenzemission auf einem Spektrofluorometer von spannenden Sonden bei 674 nm und Messung der Fluoreszenz von 694 bis 800 nm.
- Die zelluläre Aufnahme und Fluoreszenz-Aktivierung
- Holen Sie sich und Kultur die folgenden Zelllinien in den entsprechenden Nährmedien nach Standardbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 und 95% befeuchteten Atmosphäre). Hier verwenden Sie die Maus-Makrophagen-Zelllinie J774A.1 (Dulbecco mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt), dem menschlichen Glioblastom-Zelllinie U-118 mg (MEM mit essentiellen Vitaminen und 10% (v / v) fötales Kälberserum) und dem menschlichen Fibrosarkom-Zelllinie, HT-1080 (RPMI mit 5% FCS).
- Mantel 8-Well-Kammerobjektträger mit Poly-L-Lysin (Add 100 ul 0,001% Poly-L-Lysin in jede Vertiefung und bei 37 ° C für 10 min. Aspirieren Lösung und ließ die Kammer-Objektträgern zu trocknen für mindestens 4 h bei RT auf einem sterilen Werkbank. die Kammer-Objektträgern Spülen 3mal mit 200 ul Hanks Salzlösung versiegeln sie mit Paraffin und Aluminiumfolie und bei 4 ° C bis benötigt.
- Während die Kammer-Objektträgern versiegen, Filter-Sterilisation der Liposomen und Farbstofflösung und bei 4 ° C bis benötigt.
- Zur Sondenaufnahme Analyse mit dem ganzen Körper in vivo NIR Fluoreszenz-Bildgebungssystem, herzustellen 5 kleine Kulturflaschen für jede der 3-Test-Zellinien (15 Kolben insgesamt). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg und HT-1080-Zellen pro Kulturflasche mit 5 ml des jeweiligen Kulturmediums (in verfünffacht) und wachsen 16-24 Std. Parallel zu den Kulturflaschen, Samen 30.000 Zellen jeder Zelllinie (J774A.1 und HT-1080-) oder 20.000 Zellen (U-118 mg) und 2 Vertiefungen der Schieberkammer jeweils und wachsen in 500 ul Kulturmedium für 16-24 Std .
- Am nächsten Tag wird mit 100 nmol (endgültige Lipidmenge) Lip-Q zu 2 Flaschen pro Zelllinie und einer gut jeder Zelllinie an der Kammerobjektträger.Sofortüberweisung 1 Flasche pro Zelllinie bis 4 ° C, und der zweite Kolben zurück in den Inkubator.
ANMERKUNG: Das Volumen der Sonden in die Kolben gegeben, und die Kammer-Objektträgern die gleichen sind, wodurch die Konzentration auf Kammer-Objektträgern 10-fach höher (5 ml ist, um 500 & mgr; l Kulturmedium). Dies ist notwendig, weil mikroskopischen Nachweis ist weniger empfindlich als die NIR Fluoreszenz-Bildgebungssystem, in dem die Zellpellets aus den Kolben abgebildet werden. - Fügen Sie den kostenlosen DY-676-COOH in einer Konzentration entspricht dem Farbstoffgehalt von Lip-Q an die Zellen in 2 Flaschen pro Zelllinie und einer gut jeder Zelllinie an der Kammer Rutsche, dann sofort übertragen 1 Flasche pro Zelllinie auf 4 ° C (Energieverlust) und der andere Kolben zusammen mit der Kammerobjekt zurück zum Inkubator. Alle Zellen einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei den entsprechenden Bedingungen. Die Zellen in der Flasche ohne Fühler dienen als unbehandelten Kontrolle.
- NIRF Bildgebung und semi-quantitative Analyse
- Nach 24 Stunden Inkubationsdauer, Ernte der Zellen in Kolben durch Waschen der Zellen 2 mal mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) schaben Zellen in 500 & mgr; l HBSS und Pellet durch Zentrifugation (5 min bei 200 · g) in 500 & mgr; l Röhrchen.
- Die Röhrchen mit den Zellpellets (und HBSS) in einer NIRF-Imager und Bild mit Hilfe von Filtern für die Anregung (615-665 nm) und Emissions (Schnitt in> 700 nm).
- Abzüglich Autofluoreszenz und bewerten die Intensität der Ziel gegen Autofluoreszenz nach Herstelleranweisungen. Dadurch werden die semi-quantitative Niveaus der Fluoreszenzintensität als Durchschnittssignal (skaliert Zählimpulse / s), der Zählerwerte nach Skalierung für Belichtungszeit Kameraverstärkung, Klassifizierung und Farbtiefe darstellt, so dass die Messwerte untereinander vergleichbar zu ergeben.
- Die konfokale mikroskopische Analyse
- Nach 24 Stunden Inkubation Ernte der Zellen auf Kammer-Objektträgern durch Auswaschen 2 mal mit 500 ul HBSS.
- Befestigen Sie die cells mit 200 ul HBSS, enthaltend 3,7% (v / v) Formaldehyd 30 min bei RT.
- Während Fixierung los ist, verdünnen Sie die DNA-Färbung, Hoechst-33258 1:50 mit Montagelösung.
- Nach der Fixierung, Waschen Sie die Zellen 2 mal mit HBSS dann trennen die Kammern von den Glasobjektträger. Dann werden 50 ul Befestigungslösung, enthaltend die DNA-Fleck auf jedem Fleck entsprechend den Vertiefungen der Kammer gleitet. Decken Sie die Zellen mit Deckgläsern, versiegeln Kanten mit transparentem Nagellack und der Luft trocknen für 10 min bei RT (dunkel).
- Bildzellen auf einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop oder konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- und Emissions Einstellungen für die Visualisierung der entsprechenden Komponenten: Kerne (Hoechst-33258: Anregung 405 nm, Emission 420 bis 480 nm). NBD-DOPE (liposomale Lipid: Anregung 488 nm, Emission 530 nm). DY-676-COOH (NIR Fluoreszenzfarbstoff: Anregung 633-645 nm, Emission 650 bis 700 nm).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzmikroskop einvailable mit geeigneten Filtern, die Anregungs- und Emissionswellenlängen von mehr als 630 nm zu ermöglichen ausgestattet.
3. Liposomen-basierte In-vivo-Fluoreszenz-Imaging von Entzündungen
- Vorbereitung der Tiere und Materialien
- Haus 8-12 Wochen alte männliche NMRI-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 36 g unter Standardbedingungen mit Futter und Wasser ad libitum.
- Sieben Tage vor dem Start der Experimente geben allen Mäusen eine geringe Pheophorbid Diät, um Gewebeautofluoreszenz zu verringern.
- Vierundzwanzig Stunden vor dem Beginn eines jeden Versuchs, rasieren Mäusen in den gewünschten Bereich (zB gesamte Rückenbereich, wenn der Bildhinterbeinödeme gewünscht).
- Wiegen Sie die Tiere und die Berechnung der Höhe der Sonde pro Maus (Lip-Q und Lip-dQ bei 10 & mgr; Mol (Lipidkonzentration pro kg Gewicht und frei DY-676-COOH (entspricht injiziert werden) zum Inhalt des Lip-Q verwendet Farbstoff) .
- Bild die Tiere ineine Ganzkörper-NIR Fluoreszenz-Imager mit den gleichen Einstellungen für den Zellpellets verwendet. Diese Messung liefert die Autofluoreszenz der Tiere.
- Man löst 10 mg Zymosan-A in 1 ml isotonischer Kochsalzlösung und über Nacht lagern bei 4 ° C.
- Induktion der Entzündung und in vivo Bildgebung NIRF
- Bereiten Sie drei Spritzen pro Maus die folgenden Lösungen mit. Füllen Sie eine Spritze mit 50 ul Zymosan-A-Lösung (10 mg / ml) und die zweite Spritze mit 50 ul isotonische Kochsalzlösung. Füllen Sie die dritte Spritze mit den Sonden, wobei Lip-Q und Lip-dQ (10 mmol / kg Körpergewicht (Lipid)) für Versuchstiere und frei DY-676-COOH (Konzentration wie in Lip-Q) bezeichnet für die Kontrolltiere. Achten Sie darauf, die Sonden mit sterilem HBSS zu 150 ul Endvolumen verdünnt.
- Bewerben Augencreme auf die Augen der Tiere bis zur Trockenheit zu vermeiden und zu betäuben Tiere mit 2% Isofluran, bis sie tief eingeschlafen sind und wenn an den Pfoten berührt nicht reagieren (Dies dauert etwa 2 min).
- Platzieren Sie die Maus auf eine warme Matte (noch unter Narkose) und injizieren Sie die Zymosan-A-Lösung subkutan am rechten Hinterbein und die Salzlösung auf der linken Hinterbein. Injizieren Sie sich sofort die Sonde intravenös und Bild das Tier danach dann der Rekordzeit von Injektion / Messung (als t = 0 h). Speichern Sie die Bilder als Bildwürfel und wiederholen Sie die Schritte für alle anderen Tiere und jeweiligen Sonden.
- Bild die Tiere alle 2 Stunden für 10 Stunden nach der Injektion und dann nach 24 Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Phase der Messkammer ist warm (zum Beispiel, indem Sie eine warme Matte unten), um Unterkühlung zu vermeiden. Nach jeder Messung wird, legen Sie die Tiere in einem Käfig mit Futter und Wasser ad libitum und platzieren Sie den Käfig in einem gemäßigten Tierkammer. Euthanize die Tiere durch erste Betäubung mit 2% Isofluran, bis die Tiere nicht mehr auf Berührung reagieren, dann einschläfern mit Kohlendioxid für 5-10 Minuten, so dasssicher sein, dass die Tiere aufhören zu atmen vollständig und Totenstarre eintritt.
- Sezieren die Mäuse nach Standardprotokollen, die Online beurteilt werden kann (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) und Bild Organe.
- Auswerten der Messergebnisse nach den Anweisungen des Herstellers durch erste Abzug der Gesamtfluoreszenz der Tiere (Entmischung) dann Zuweisen Regionen von Interesse für die Autofluoreszenz (linke Hinterbein mit Kochsalzlösung) und Ziel Fluoreszenz entzündeten Bereich (rechte Hinterbein mit Zymosan-A).
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Representative Results
Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff DY676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen verwendet hier führt zu einem hohen Niveau der Fluoreszenzlöschung. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren in hoher Konzentration zu sehen ist, kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, wo eine hohe Empfindlichkeit und eine zuverlässige Detektion des Zielgebiets gefordert werden ausgenutzt werden. Die Verwendung von Liposomen bietet auch Schutz des Farbstoffs, der für in vivo Anwendungen unabdingbar ist. Eine sorgfältige Charakterisierung der Liposomen erforderlich ist und umfasst mehrere Faktoren, wie der Höhe der Farbstoff eingekapselt, der Stabilität und Größe der Liposomen, die Fluoreszenzlöschung und Aktivität der eingekapselten Farbstoff in vitro als auch die Anwendbarkeit für in vivo Bildgebung. Ein Vergleich des freien Farbstoffs, DY-676-COOH und abgeschreckt Liposomen (Lip-Q) als auch ein nicht-abgeschreckt Liposom (Lip-dQ) mit sehr geringer concentRation des eingekapselten Farbstoffes ist deshalb besonders für die in vivo Charakterisierung kritisch.
Liposomen unter Verwendung der Film Hydratation und Extrusionstechnik mit aufeinanderfolgenden Frost-Tau-Zyklen vor der Extrusion hergestellt werden, enthalten restlichen freien Farbstoffmoleküle, die erfolgreich aus den Liposomen aufgrund ihrer längeren Retention im Gelfiltrationsmatrix getrennt werden können, im Vergleich zu den Liposomen, die schneller zu eluieren ( 1B). Je nach dem Grad der Verdünnung nach der Gelfiltration, eine optionale Ultrazentrifugationsschritt ermöglicht die Konzentration der Liposomen wie dargestellt (Abbildung 1C). Basierend auf den Absorptions- und Emissionseigenschaften des verkapselten Farbstoffes, ist die Konzentration des eingekapselten Farbstoffes bestimmt wird, mit Hilfe einer Eichkurve des freien Farbstoffs (1D). Neben der Konzentration des eingekapselten Farbstoffes, ist es wichtig, die Größe und die Homogenität der Liposomen achtern bestimmenäh Vorbereitung. Wie in 1E zu sehen ist, elektronenmikroskopische Aufnahmen von Liposomen durch die zugrunde liegende Methode bereit zeigen eine meist unilamellare Morphologie der liposomalen Vesikel, enthalten intravesikulären DY-676-COOH entweder innerhalb der Löschkonzentrationsbereich (Lip-Q, 606-846 uM DY-676 ) oder bei nicht-abgeschreckt Farbstoffkonzentration (Lip-dQ; 25 uM DY-676). Ferner zeigen sie eine homogene Größenverteilung von etwa 120 nm und Polydispersitätsindizes weit unter 1 (Tabelle 1). Durch Fluoreszenzlöschung, zeigt Lip-Q zwei Absorptionsmaxima in wässriger Puffer, wobei ein Peak ist durch eine Verschiebung in Richtung der blauen Wellenlängen aus. In Übereinstimmung damit ist die Fluoreszenzemission sehr niedrig im Vergleich zu der freien Farbstoffs (2A und B, rechts). Gefrier Beschädigung der Liposomen zur Freisetzung des Farbstoffs, der in der umgebenden Lösung verdünnt wird. Die blauverschoben Absorptionsspitze daher disappears, was in einem einzigen Absorptionspeaks des Lip-Q. Korrespondierend hierzu ist eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität von gefrier beschädigt Lip-Q gesehen, was darauf hinweist, dass die Fluoreszenz Aktivierung freigesetzten Farbstoff-Moleküle statt. Die freien Farbstoffes zeigt nur ein einzelnes Absorptionsmaximum und eine hohe Fluoreszenzintensität, die auf der gleichen Ebene bleiben, unabhängig von Gefrieren (2A und B, links). Dieser Befund legt nahe, dass die Kapselung des Farbstoffs in Liposomen, wie in Lip-Q würde den Farbstoff aus der Umgebung zu schützen, behalten hohe Konzentration und die damit verbundene Fluoreszenzlöschung und wenn nach Ziel Trigger aktiviert würde Erkennung aufgrund der Fluoreszenz erhöhen können.
Liposomale Sonden mit der darunter liegenden Lipidzusammensetzung zu offenbaren eine vorherrschende Phagozytose, die durch Energiemangel gesperrt. Dies kann durch die Aufnahme von Lip-Q von der hoch phagozytischen murine Makrophagenzellinie J774A.1 sehen ist, und diemilde phagozytischen menschliche Glioblastomzelllinie U-118 mg bei 37 ° C und die Hemmung bei 4 ° C (3A und B). Die freien Farbstoff DY-676-COOH offenbart Aufnahme in den phagozytischen Zelllinien sowohl bei 37 ° C und bei 4 ° C, was anzeigt, dass die liposomale Sonde Lip-Q enthält keine restlichen freien Farbstoffs in Lösung und kann nur aktive Aufnahme unterziehen. Konfokalen Laser Scanning Mikroskopbilder weiter zu untermauern die Aufnahme und Aktivierung von Lip-Q in Fresszellen (3C). Ferner fehlt der Fluoreszenz im nichtphagozytischen menschlichen Fibrosarkom-Zelllinie HT-1080 steht, dass die Aufnahme von Lip-Q vorwiegend durch Phagozytose und damit wäre geeignet zur Bildgebung von Entzündungs wo phagozytischen Monozyten / Makrophagen beteiligt sind.
Im Einklang mit der phagozytischen Aufnahme von Liposomen in kultivierten Zelllinien gesehen, und aufgrund Fluoreszenzlöschung intravenöse Injektion von Lip-Q führt zu einem zeitabhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität von Ödemen in Mausmodellen (4A, Lip-Q), mit sehr geringer Hintergrundfluoreszenz. Die maximale Fluoreszenzintensität Ödem festgestellt wird 8-10 Stunden nach der Injektion von Lip-Q. Im Gegensatz dazu, relativ starke NIR-Fluoreszenz der gesamten Maus wird nach dem Aufbringen der freien DY-676-COOH (4A, DY-676-COOH) oder der immer-einge Liposom Lip-dQ (4A, Lip-dQ gesehen ). Im Vergleich zu Lip-Q, schnelle Durchblutung und das Abräumen des freien DY-676-COOH als 0-4 Stunden nach der Injektion zu sehen ist, stört die Bildverarbeitung, so dass eine zuverlässige Erkennung von Ödemen ist nicht möglich (4A, DY-676-COOH ). Weiterhin können die nicht-abgeschreckt Liposom enthüllt Lippen dQ eine maximale Fluoreszenz Ödem innerhalb von 2-4 Stunden nach der Injektion, bis 8 Stunden nahezu konstant bleibt und dann allmählich abnimmt, ähnlich wie bei der abgeschreckten Lip-Q-basierten Ödem Fluoreszenz. Darstellende semi-quantitative anallysen, wobei Bereiche von Interesse (ROI) für Ödem gegen Hintergrund ablaufen soll, kann man Rückschlüsse auf die verschiedenen Ebenen der Nachweis mit verschiedenen Sonden zu machen. Nach halbquantitative Analyse von 5 Tieren pro Gruppe (Sonde) kann Ödeme mehr signifikant (P = 0,001) mit Lip-Q festgestellt ist als mit der freien DY-676-COOH oder dem nicht abgeschreckten, Lip-dQ (Abbildung sein 4B).
Imaging Organe der Mäuse eingeschläfert 24 Stunden nach der Injektion von Sonden zeigen milden ex vivo Fluoreszenz der Leber / Gallenblase und die Nieren und eine sehr geringe oder gar keine Fluoreszenz der Milz, Lunge und Herz (Abbildung 5), die als Nachweis für die Beseitigung dient der Sonden durch den hepatobiliären Weg erfolgen.
Abbildung 1: Herstellung von DY-676-COOH belasteten Liposomens. (AC) Schematische Darstellung der Syntheseschritte. (A) Einstellung des Films Flüssigkeitszufuhr und Extrusion mit der Nah-Infrarot-Farbstoff DY-676-COOH. (B) Bild des selbstgemachte Gelfiltration Setup, die die Interphase zwischen unverkapselte (kostenlos) Farbstoff und Liposomen. Liposome eluiert erste und erscheint blau-grün durch die gekapselte DY-676-COOH (blau) und die eingebaute grüne Phospholipid, NBD-DOPE. (C) Repräsentatives Bild Liposomen-Sediment (Lip-Q) nach Einengen durch Ultrazentrifugation. ( D) Vertreter Eichkurve von DY-676-COOH in 10 mM Tris pH 7,4 (mit 1% Triton X100) zur Quantifizierung der liposomalen Farbstoff verwendet. (E) Cryo-TEM-Aufnahme von Lip-Q. Bitte klicken Sie hier zur Ansicht eine größere Version der Figur.
Fig. 2: Physikochemische Bestimmung Fluoreszenzlöschung und Aktivierung in vitro (a) Absorptionsspektren von Lip-Q (rechts) und freie DY-676-COOH (links) in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 gemessen, vor oder nach dem Einfrieren bei - 80 ° C. Beachten Sie die charakteristischen Doppelpeak von Lip-Q im Vergleich zu freien DY-676-COOH und das Verschwinden der Blauverschiebung Spitzen nach Gefriert Schäden Lip-Q. (B) entsprechende Fluoreszenzemissionsspektren von Lip-Q (rechts) und freie DY-676-COOH (links) vor oder nach dem Einfrieren bei -80 ° C in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 gemessen.
Abbildung 3: Die zelluläre Aufnahme und Fluoreszenz Aktivierung der Lippe osomes. Die Abbildungen in (A) wurden durch Fluoreszenz-Bildgebung des NIR Zellen nach der Belichtung zu den entsprechenden Sonden 24 Stunden bei den angegebenen Temperaturen hergestellt. Die HT-1080-Zellen überlebten nicht die 24-Stunden Inkubationszeit bei 4 ° C. Die Balkendiagramme in (B) stellen die semi-quantitativen Niveaus der Fluoreszenzsignale durch Zuordnen ROIs zu den Zellpellets in A. Jeder Balken zeigt die durchschnittlichen Intensitäten der n = 3 Experimenten ± SD erhielt. Bilder in (C) wurden mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie von Zellen an Sonden auf Kulturkammer Folien für 24 Stunden bei 37 ° C ausgesetzt erworben. Beachten Sie, das hohe Niveau der Fluoreszenz in der Hoch phagozytischen murine Makrophagen-Zelllinie J774A.1 und die moderate Fluoreszenz im milden phagozytischen menschlichen Glioblastom-Zelllinie U-118 mg. Die nicht-phagozytische menschlichen Fibrosarkom-Zelllinie HT-1080 keine Fluoreszenz der Sonden. NBD-DOPE: grün fluoreszierenden Phospholipid.Last / 52.136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. In vivo optische Abbildung Zymosan-induzierte Ödeme bei Mäusen. (A) Die Maus Bild links zeigt die Positionen der subkutan angewendet Zymosan-A (500 ug in 50 ul Kochsalzlösung) und die Steuerkochsalzlösung (50 ul) auf der linken Flanke. Die intravenöse Injektion der angegebenen Sonden und der ganze Körper NIR Fluoreszenzabbildung zu den angegebenen Zeitpunkten zeigen schrittweise, aber hohe Zunahme der Fluoreszenz-Signale von Ödemen und geringem Hintergrundsignale der Lip-Q (oben) mit einer maximalen Fluoreszenz bei 8 h nach der Injektion. Die freien Farbstoff zeigt Perfusion und eine zügige Abfertigung innerhalb von 4 Stunden nach der Injektion (mittleren Bereichl), während Lip-dQ zeigt Detektion von Ödemen mit niedrigen Signalintensitäten und einer insgesamt höheren Hintergrundfluoreszenz. Die grafische Darstellung in (B) wiederhole die beobachteten Fluoreszenzsignale von Ödemen mit jeder Sonde nachgewiesen im Vergleich zu der Kontrollregion (Kochsalzlösung) in n = 5 Tiere pro Gruppe. Jede Parzelle die mittlere Fluoreszenzsignale (n = 5) ± SEM. Mit den Diagrammen ist die maximale Fluoreszenzsignal von Ödemen mit jeder Sonde nachgewiesen leicht zu unterscheiden (Lip-Q, 8 h; Lip-dQ 2-4 h und kostenlos DY-676-COOH, 2 Stunden nach der Injektion). Es gibt eine signifikant (P = 0,001) höhere Fluoreszenzintensität von Ödemen mit Lip-Q im Vergleich zu Lip-dQ bei t = 0 bis 24 h und mit Lip-Q gegen Freier DY-676-COOH bei t = 4-24 Std. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: biooptischen ex vivo Bilder von Organen von Mäusen 24 Stunden nach Sonden Anwendung und entsprechenden semi-quantitative Analyse der Fluoreszenzintensitäten der Organe. Jeder Balken stellt den Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten (n = 4) ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
| Liposomenformulierung | Größe [nm] | Polydispersitätsindex (PI) | Zetapotential [mV] |
| Lip-dQ (dequenched) | 123,4 ± 0,6 | 0.055 ± 0.02 | -10,6 ± 0,4 |
| Lip-Q (abgeschreckt) | 118,5 ± 0,7 | 0,04 ± 0,02 | -9 ± 2 |
| Lip-NBD (W / O-DY-676-COOH) | 123,0 ± 1,4 | 0,04 ± 0,03 | -11 ± 1 |
Tabelle 1: Charakterisierung der Liposomen durch dynamische Lichtstreuung.
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Discussion
Da Liposomen kann auch als Trägersysteme für Fluoreszenzfarbstoffe dienen, Abbildung von Zielkrankheiten ermöglichen sie. Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff, DY676-COOH hier verwendet, führt zu einem hohen Maß an Fluoreszenzlöschung des eingeschlossenen Farbstoff. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren zu sehen in einer hohen Konzentration kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, bei denen eine hohe Empfindlichkeit und eine zuverlässige Detektion des Zielgebiets gefordert wird ausgenutzt werden. Die Verwendung von Liposomen bietet auch Schutz des Farbstoffs, der für in vivo Anwendungen unabdingbar ist.
Der Film Hydratation und Extrusionsverfahren ist ein weit verbreitetes Verfahren, die erfolgreiche Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichen Größenbereichen, je nach Bedarf ermöglicht, und ermöglicht Modifikationen wie Einkapseln einer Vielzahl von verschiedenen Substanzen 25. So eignet sich zur Herstellung von Lippen istosomes mit der NIR-Fluoreszenzfarbstoff, DY-676-COOH zur Bildgebung gekapselt. Das Verfahren ergibt Liposomen mit 600-840 uM intravesikulären Farbstoffkonzentrationen, die im abgeschreckten Konzentration des Farbstoffs sind. Die LiposoFast Basis-Handextruder zur Homogenisierung spontan gebildeten Vesikeldispersion verwendet ist für Liposomzubereitung in kleinen Labormaßstab aufgrund der Kompatibilität der Vorrichtung, mit Spritzen auf 1 ml Volumen. Für große Vorbereitungen die Verwendung größerer Hochdruckhomogenisatoren, die in der Lage, Vesikeldispersionen mit einer Kapazität von 1.000 L pro Stunde zu homogenisieren sind empfohlen. Die Gelfiltration (Size Exclusion) Chromatographie ist ein entscheidender Schritt, die eine Trennung des verkapselten Liposomen Farbstoff von nicht-verkapselten (kostenlos) Farbstoffmoleküle 26 gewährleistet. Die Länge der Gelfiltrationssäule ist wichtig für eine effiziente Trennung der Liposomen von freiem Farbstoff. Somit ist es notwendig, eine Spalte von mindestens 28 cm Länge t vorzubereiteno der Liposomen erfolgreich getrennt von der freien DY-676-COOH verwendet. Interessanterweise ist diese Länge zweimal so lang wie die verwendet werden, um Carboxyfluorescein (CF) beladenen Liposomen aus freien Carboxyfluorescein zu reinigen. Der Hauptnachteil der Gelfiltration ist ein fünf- bis sechsfache Verdünnung der gereinigten Proben. Dies kann durch Ultrazentrifugation kompensiert werden, wenn hochkonzentrierte Liposomen erforderlich sind. Während Ultrazentrifugation die Liposomen sedimentieren und der Überstand kann leicht 27 entfernt werden. Andere Möglichkeiten, um Liposomen zu konzentrieren, beispielsweise durch Dialyse 28 sind zeitaufwendiger als Ultrazentrifugation.
Neben der Film Hydratation und Extrusionsverfahren, das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren 23 sowie das Ethanol-Injektionsverfahren 24 ermöglichen Liposomzubereitung mit hohen Einkapselungseffizienz für viele hydrophile Substanzen. Jedoch ergeben unsere Untersuchungen den Film Flüssigkeitszufuhr in Kombination mit der Frost-Tau-ZyklusS, um die am besten geeignete Methode für eine ausreichende intraliposomale Verkapselung von DY-676-COOH sein. Eine Erhöhung der für die Film Hydratation verwendete Start DY-676-COOH Konzentration erhöht die Wirksamkeit und die Konzentration des intraliposomale Farbstoff, wenn eine feste Lipidkonzentration von 30 mM verwendet. Trotz dieser die Kapselung Wirkung mit der Frost-Tau-Verfahren ist unter 10% des eingesetzten Ausgangsfarbstoffkonzentration, dafür aber ausreichend für die Kapselung der für die Bildgebung erforderlich löschenden Konzentration ist. Ferner kann die freie Farbstoff von Liposomen durch Gelfiltration durch Entsalzen und Dehydratation nach den Anweisungen des Herstellers, so dass erneute Einkapselung möglich und eine insgesamt minimale Farbstoffverlust wiederverwendet werden. Die Verkapselung des Farbstoffs durch das zugrunde liegende Protokoll, hat keinen Einfluss auf die Größe und Morphologie der Liposomen, wie durch die Polydispersitätsindizes und der elektronenmikroskopischen Aufnahme von Lip-Q ersichtlich.
Mehrere einfache Methoden kann die evaluat werdene die Aktivität bereit Fluoreszenz liposomes.DY-676-COOH hat eine hohe Neigung zur Selbst Abschrecken bei hoher Konzentration in der Regel von 21,29 H-Dimerbildung und pi-Stapelwechselwirkungen zwischen den Farbstoffmolekülen resultieren. Diese Wechselwirkungen, die durch die Nähe des Förster Radien von Farbstoffmolekülen in hoher Konzentration auftreten, durch Verdünnen 30 vernichtet werden. Daher Einkapselung von hohen Konzentrationen von DY-676-COOH nicht nur den Farbstoff zu schützen von Opsonisierung in vivo, sondern auch von der umgebenden Puffer, wodurch seine hohe Konzentration beibehalten und Bindung der Fluoreszenzlöschung, die als blauverschoben Absorption detektiert werden Peak und niedrige Fluoreszenzemission, wie in Fig. 2 ersichtlich ist Einfrieren Liposomen langsam bei -80 ° C führt zur Bildung von Eiskristallen in dem wässrigen Innenraum 31, der Schäden an Liposomenmembran verursacht, wenn voreilig auf 30 ° C aufgetaut. Die Freigabe, Verdünnung und Fluoreszenz activierung des intra-liposomale DY-676-COOH in Puffer nach dem Einfrieren in einer einzigen Absorptionspeak zeigte, und fast das 2,5-fache Erhöhung der Fluoreszenzintensität (Abbildung 2), die anzeigt, dass Lip-Q sequestriert somit eine hohe, Abschrecken Konzentration DY-676-COOH und aktivierbar ist. Andere Verfahren zum liposomalen Lipid-Doppelschicht, wie die Verwendung von Detergens oder organische Lösungsmittel nicht klare Unterschiede zwischen dem freien Farbstoffes und des liposomal verkapselten Farbstoff offenbaren beschädigen, da sie sowohl die spektralen Eigenschaften von vielen Fluoreszenzfarbstoffen 32 beeinflussen. Die langsamen Einfrieren und Auftauen rauen Verfahren hier deshalb berichtet dient als zuverlässiger und vielversprechende Methode, um die hohe Kapselung der Fluorophore in Liposomen und eine konsequente Fluoreszenzlöschung zu bestätigen. Aus der Absorptions- und Emissionsspektren intakter Lip-Q (2), kann ein gewisses Maß an Restfluoreszenz nachgewiesen werden. Dies kann aus nicht abgeschreckt Farbstoff-Monomere in der Lipo führenOmen und auch von elektrostatische Wechselwirkung und der Einfluss der gekapselte Farbstoff durch Phospholipid polaren Kopfgruppen 33.
Wie in Figur 3 zu sehen ist, eine deutliche Akkumulation von Lip-Q in der hoch phagozytischen murine Makrophagen und mildem phagozytischen menschliche Glioblastomzelllinie U-118 mg 34, aber nicht in den nicht-phagozytische menschlichen Fibrosarkom-Zelllinie HT-1080 zeigt dass Lip-Q- basierten Imaging von Entzündungen wäre günstig sein, da Phagozyten sind die Hauptakteure von entzündlichen Prozessen. Die Tatsache, dass Energiemangel hebt Aufnahme von Lip-Q, aber nicht des freien DY-676-COOH Auffassung begründet die Spezifität der Phagozytose von Lip-Q und zeigt, dass Lip-Q bleibt während des Experiments intakt, sonst Freisetzung des Farbstoffes und energieunabhängigen Aufnahme statt führt zu Fluoreszenzdetektion zu nehmen. Einbetten des grün fluoreszierenden Phospholipid, NBD-DOPE in der Liposomendoppelschicht ermöglicht mikroskopische Bildgebung und diskriminierun zwischen nicht abgebaut aus zellulären abgebaut Liposomen vor allem, wenn zeitabhängige Aufnahmeexperimente werden durchgeführt, wie bereits 32 ausgewiesen. Die mikroskopischen Aufnahmen zeigen NIR-Fluoreszenz der DY-676-COOH, die mit den Ebenen der Fluoreszenzintensitäten des Zellpellets korreliert, wie durch semi-quantitative Analyse nach der Inkubation bei 37 ° C bestimmt. In Übereinstimmung damit, die murinen Makrophagen-Zelllinien, die höchste Fluoreszenz, während die menschlichen Glioblastom zeigen geringere Fluoreszenz sowohl DY-676-COOH und NBD-DOPE als die ersteren. Wie erwartet ist die menschliche Fibrosarkom-Zelllinie HT-1080 zeigen keine Fluoreszenz entweder liposomalen Farbstoffe oder freien DY-676-COOH, die die Tatsache, dass Lip-Q-Aufnahme, ist in erster Linie durch Phagozytose stärkt.
Um das Potenzial zu untersuchen Lip-Q-basierten Phagozytose getriebenen in vivo-Abbildung von Entzündungs wurden verschiedene Kontrollen betrachtet. In Anbetracht, dass der freie DY-676-COOH kann durch phagocyt genommen werdenosis, Opsonisierung von Lip-Q kann zu der Farbstoff, der durch Phagozyten genommen werden kann loslassen. Um dies zu vermeiden, wurde Lip-Q mit 5 Mol-% PEGylierung hergestellt. Darüber hinaus ist es notwendig, zwischen Aufnahme durch Entzündungen basierenden EPR-Effekt und aktive Aufnahme und Fluoreszenzaktivierung unterscheiden. Zur Lösung dieses Problems war die Bewertung und den Vergleich von drei verschiedenen Sonden, nämlich die Always-on, Lip-dQ, der abgeschreckt Lip-Q und den freien DY-676-COOH in Mäusen mit Zymosan-induzierte Ödem erforderlich. Zymosan-A, die aus den Zellwänden von Saccharomyces cerevisiae und Candida albicans vorbereitet wird, ist ein natürliches Stimulans der Zytokinsekretion über die Dectin-1 und der Toll-like-Rezeptor 2/6 (TLR 2/6). Zytokine wiederum induzieren die Aktivierung nachgeschalteter Kaskaden, die im Gefäß Leckagen führen und damit Lockerung der intravasation / Extravasation von Monocyten / Makrophagen von einem Milz Reservoir 35 sowie Neutrophile und ihre Migration zu Entzündungsherden(Ödem) 36-39. Das Zymosan-basierte Monozyten / Makrophagen-Extravasation und Migration muss nur 4,5-6 Stunden, die Zymosan ist ein strategisches Werkzeug zur Untersuchung der Entzündungsprozesse 36-39. Aufgrund der Gefäßleckagen, die während einer Entzündung führen, intravenös injiziert Sonden können entweder durch Monozyten / Makrophagen (Fresszellen) während ihrer Migration in die Entzündungsstelle oder extravasieren genommen werden und bis zum Ödem Website (EPR-Effekt) 40 entnommen werden. Die Verwendung des nicht-abgeschreckt Lippen dQ zeigt eine insgesamt stärkeren Hintergrund zu Ödemen Signale als Lip-Q und ein Fluoreszenzanstieg des Ödems, das die Migration von Monozyten und Makrophagen widerspiegelt. In der Tat wird die maximale Fluoreszenz Ödem bereits 2-4 Stunden nach der Anwendung von Lip-dQ gesehen und bleibt bis 8 Stunden nahezu konstant. Zu Lip-dQ und Lip-Q Gegensatz, der freien DY-676-COOH unterliegt einem schnellen Durchblutung nach der Injektion und ist innerhalb von 4 Stunden gelöscht, so dass deutliche Abbildung von Ödem ist nicht möglich. InInteressanterweise die Verwendung von Lippen-Q zu einer bleibenden Anstieg in der Fluoreszenzintensität von Ödemen und sehr niedrige Hintergrundsignale. Diese anhaltende Zunahme der Fluoreszenzintensitäten mit Lip-Q wird zugeordnet, um die Aktivierung der liposomalen freigesetzten Farbstoff-Fluoreszenz. Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass der Beitrag der EPR-Effekt in Lip-Q basierend Bildgebung ist minimal, da Lippen dQ zeigen eine maximale Fluoreszenz (EPR-Effekt und Monozyten-Migration) bei 4 Stunden nach der Injektion. Somit stellt liposomalen Verkapselung Schutz und deutliche Abgabe DY-676-COOH, das wiederum ermöglicht eine in vivo-Bildgebung von Ödemen, die ausschließlich nach Internalisierung und Abbau (Fluoreszenzaktivierung) durch phagozytische Zellen. Bisher ist die Verwendung von Zymosan-induzierte Hinterbein Ödem um die Abbildungseigenschaften des fluoreszierenden Liposomen Validierung neuer. Das Protokoll hierin berichteten sowohl durch Verkapselung von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und durch Abbilden der Wirkung verschiedener Inhibitor Dru erweiterbargs von der Induktion von Entzündungen, und stellt somit ein nützliches Werkzeug für die Herstellung und Charakterisierung von Sonden für biomedizinischen Bildgebung.
Ein weiterer entscheidender Schritt zur Definition geeigneter bildgebende Sonden ist die Überprüfung ihrer pharmakologischen Eigenschaften und die Beseitigung Routen. Die Verteilung der Sonden in Organen, die lebenswichtige Rolle in der Ausscheidung zu spielen, wie zum Beispiel Leber und Nieren sowie ihre kurzen Verweilzeit und geeignete Eliminierung aus diesen Organen ist in der Regel ein Hinweis darauf, dass die Sonden viel zeigen wahrscheinlich keine nachteiligen Auswirkungen auf den Patienten. In Übereinstimmung damit werden die Organe der Mäuse hergestellt 24 h nach der Injektion von Lip-Q oder der freien DY-676-COOH offenbaren nur milde Fluoreszenz der Leber / Gallenblase und der Nieren, die eine bevorzugte Eliminierung der liposomalen Fluorophor durch bedeutet der Leber-Route. Die kurze Aufnahme der Sonden in diesen Organen und deren effiziente Eliminierung von einem 7-fol mauertd höhere Fluoreszenzsignale von Organen vorbereitet 6 Stunden nach der Injektion von Lip-Q oder die freie DY-676-COOH 32. Diese Beobachtungen sind in Übereinstimmung mit der Eliminierung von Liposomen 41 und sichert die Bedeutung der Einbeziehung Biodistributionsstudien bei der Charakterisierung von Proben. Obwohl nachteilige Nebenwirkungen, wie Hautreizungen und Komplementaktivierung 42,43 wurden für liposomale Formulierungen in klinischen Anwendungen verwendet gemeldet wurden solche Effekte nicht mit den darunterliegenden Liposomen festgestellt. Weiterhin Beobachtung immundefizienten Mäusen zwei Wochen nach der Injektion Sonde führte zur Freigabe der Sonden aus den Mäusen Organe abzuschließen (nicht gezeigt).
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft Zuschüsse HALLO-698 / 10-1 und RU-1652 / 1-1 unterstützt. Wir danken Doreen Mai für hervorragende technische Unterstützung und das Unternehmen Dyomics GmbH, Jena für die freundliche Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
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