Name: Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a preparar lipossomas ativáveis para imageamento óptico in vivo de inflamação com alta sensibilidade usando filmes lipídicos e corantes near-infrared encapsulados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelas subvenções Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 e RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen maio para assistência técnica excelente ea empresa DYOMICS GmbH, Jena por seu apoio tipo.

NOTA: Todos os procedimentos são aprovados pelo comitê de animais regional e de acordo com as diretrizes internacionais sobre o uso ético de animais. 1. Elaboração de Materiais e Instrumentos <ol><li> Preparação da dispersão vesicular formam-se espontaneamente (SFV) <ol><li> Dissolve-se e preparar-se soluções de reserva dos seguintes fosfolípidos: 214 mg / mL de fosfatidilcolina de ovo (EPC), 134 mg / ml de colesterol e 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio) (mPEG 2000 -DSPE) e 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 il) (sal de amônio) (NBD-DOPE) em clorofórmio e armazenar em frascos de vidro. </li><li> Fornecer cerca de 3 ml de clorofórmio, num balão de fundo redondo e transferir o volume apropriado de solução de estoque de fosfolípido para o balão de fundo redondo para preparar lipossomas compostos de EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE a uma razão molar de 6,5: 3: 0,5. Para a rotulagem de fluorescência dupla de lipossomas adicionar 0,3 mol% NBD-DOPE à solução lipídica. </li><li> Evapora-se o clorofórmio a partir da solução de fosfolípido orgânica sob pressão reduzida (300 mbar) a 55 ° C utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Depois de uma película homogénea fosfolípido é formado, reduzir a pressão para 10 mbar durante 1-2 h para remover o depósito de clorofórmio residual. </li><li> Enquanto o clorofórmio é evaporação, dissolve-se DY-676-COOH (6.181 uM) em tampão Tris 10 mM pH 7,4 e encher um recipiente Dewar com azoto líquido. Ligar um banho de ultra-sons e é ajustado a 50 ° C. </li><li> Transferir um volume adequado (0,5-1 ml) de solução para o balão de fundo redondo para hidratar o filme de fosfolípido seco e vortex vigorosamente até que a vesícula formada espontaneamente (SFV) formas de dispersão DY-676-COOH (6.181 uM). Certifique-se de que todos os fosfolipídios são dispersas para evitar a perda de lipídios. </li><li> Cuidadosamente transfer o balão de fundo redondo contendo a dispersão de SFV em azoto líquido e congelar a dispersão durante 3-5 min. Colocar o balão de fundo redondo em um banho de ultra-sons a 50 ° C para descongelar a dispersão, em seguida, a dispersão vortex vigorosamente durante 1-2 min. Repetir este processo seis vezes, perfazendo um total de sete ciclos de congelamento e descongelamento. </li></ol></li><li> Extrusão de SFV para formar vesículas de lipossomas homogéneos <ol><li> Transferir a solução de SFV em uma seringa de 1 ml (uma seringa) e expulse a dispersão através de uma membrana de policarbonato de 100 nm, utilizando uma extrusora LiposoFast-básico em seringa-b. </li><li> Expulse a dispersão de seringa-b, de volta para a seringa-a, em seguida, repita o ciclo de dez vezes. Devido ao processo de extrusão, a solução em que as alterações de seringa de um aspecto turvo a uma dispersão límpida com o tempo. Depois de dez ciclos (vinte passos individuais de extrusão) remover seringa-b a partir do dispositivo de extrusão da dispersão e pela última vez a partir de uma seringa directamente para uma estéril1,5 ml dos tubos de reacção. </li></ol></li><li> A purificação do encapsulado em liposomas DY-676-COOH a partir de corante livre <ol><li> Prepara-se uma coluna de cromatografia em gel, utilizando G25 grânulos embebidos em 10 mM Tris pH 7,4 (coluna de comprimento 28 cm, diâmetro de 0,8 centímetros). </li><li> Transferir 0,5 ml de dispersão vesicular extrudido sobre a camada de gel e deixar o ralo amostra na matriz de gel. </li><li> Elui-se os lipossomas com tampão Tris 10 mM pH 7,4 (Figura 1A) e lava-se a coluna até os drenos de corantes completamente livres para fora da coluna. Se necessário, recolher e reciclar o corante livre por dessalinização e desidratação de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Concentra-se os lipossomas eluídas por ultracentrifugação (200.000 x g, 2 horas a 8 ° C), em seguida, dispersá-los em volume adequado de solução estéril de 10 mM de Tris, pH, 7,4. </li></ol></li><li> Quantificação da concentração encapsulada DY-676-COOH <ol><li> Prepare uma curva de calibração, dissolvendo DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) em tampão Tris 10 mM, pH 7,4 contendo 0,1% de Triton X100. </li><li> Dissolve-se 2 ul (100 nmol de lípido final de 50 mmol / L de estoque) dos lipossomas durante 5 min à temperatura ambiente em tampão 100 ul de Tris contendo 1% de Triton X-100 para destruir as vesículas e libertar o corante encapsulado. Depois dilui-se as amostras com tampão Tris 10 mM, pH 7,4 para uma concentração final de Triton-X100 a 0,1% (v / v) fazendo um volume total de 1 ml. Preparar todas as amostras em duplicado. </li><li> Medir a absorção e emissão de todas as amostras (livre DY-676-COOH e Triton-X100 tratada lipossomas) a uma excitação λ = 645 nm e uma emissão λ = 700 nm. Estabelecer e utilizar uma curva de calibração do corante livre para determinar a concentração de corante encapsulado. </li></ol></li><li> Caracterização Liposome <ol><li> Determine o tamanho e potencial zeta de lipossomas por espalhamento dinâmico de luz. Diluir as amostras de lipossomas com filtro esterilizados (0,2 um) de tampão Tris 10 mM, pH 7,4 a aconcentration de 100-300 uM (lípido). Transferem-se as amostras diluídas numa cuvete descartável de baixo volume e medir a amostra de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Caracterizar os lipossomas por microscopia electrónica para substanciar o tamanho, a integridade e a homogeneidade de vesículas lipossomais de acordo com os protocolos normalizados. </li></ol></li></ol> 2. Validação de Fluorescência-têmpera e Ativação de lipossomas preparados <ol><li> Análise físico-química de extinção da fluorescência e ativação <ol><li> Preparar dois tubos de 1,5 ml para o Lip-Q e 2 tubos para a livre DY-676-COOH. Transferir 100 nmol lípidos totais (2,38 ul de uma solução de estoque / L Lip-Q 42 mmol, contendo 138 ug / ml do encapsulado DY-676-COOH) para os tubos correspondentes. Transferência livre equivalente DY-676-COOH ao teor de corante de Lip-Q (0,38 mg o que resulta, por exemplo, a partir de 138 mg / l 1.000 x 2,38 ul Lip-Q usado). Incubar uma banheirae de cada sonda, a 4 ° C e congelar o segundo tubo a -80 ° C durante a noite (16 h). </li><li> Aquece-se um bloco de aquecimento a 30 ° C. Encha uma caixa de arrefecimento com gelo moído e equilibrar-se uma alíquota de tampão 10 mM Tris pH 7,4 à temperatura ambiente. </li><li> Remover sondas de 4 ° C e equilibrar à temperatura ambiente (envolvido em folha de alumínio para proteger da luz) e descongelar rapidamente as sondas de -80 ° C a 30 ° C durante 5 min. Relaxar as sondas descongeladas em gelo durante 1 min antes de os transferir para a temperatura ambiente (também envolvido em folha de alumínio para proteger da luz). </li><li> Adicionar tampão Tris 10 mM (pH 7,4) a cada uma das sondas ao volume final de 100 uL e equilibrar todas as sondas à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Pipeta 80 mL de cada sonda em um volume baixo tina de vidro e medir a absorção de cada sonda 400-900 nm em um espectrômetro. Retorne a sonda para seus tubos correspondentes. </li><li> Transferir 80 mL de cada sonda em uma tina de vidro adequadoe medir a emissão de fluorescência em um espectrofluorómetro por excitantes as sondas a 674 nm, e medir a fluorescência de 694-800 nm. </li></ol></li><li> A absorção celular e a activação de fluorescência <ol><li> Obter e cultura as seguintes linhas de células no seu meio de cultura correspondente de acordo com condições padrão (37 ° C, 5% CO 2 e 95% de atmosfera humidificada). Aqui, o uso J774A.1 linha celular de macrófagos de murino (meio Dulbecco modificado de Eagle suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo), a linha celular de glioblastoma humano, L-118 mg (MEM contendo vitaminas essenciais e 10% (v / v) de soro fetal de bezerro) e a linha de células de fibrossarcoma humano, HT-1080 (RPMI com 5% de FCS). </li><li> Casaco-8 bem lâminas de câmaras com poli-L-lisina (adicionar 100 ul 0,001% poli-L-lisina a cada poço e incubar a 37 ° C durante 10 min. Aspirar solução e deixar que as lâminas de câmara para secar-se durante pelo menos 4 h à temperatura ambiente sobre uma bancada de trabalho estéril. Lavar as lâminas de câmara 3vezes com solução salina 200 mL de Hank, em seguida, feche-os com parafina e folha de alumínio e armazenar a 4 ° C até necessário. </li><li> Enquanto as lâminas de câmara estão secando, filtro de esterilizar os lipossomas e solução de corante e armazenar a 4 ° C até necessário. </li><li> Para a análise de absorção da sonda com todo o corpo in vivo NIR sistema de imagiologia por fluorescência, preparar 5 pequenos frascos de cultura de cada uma das três linhas de células de ensaio (frascos de 15 no total). Semente de 2 x 10 6 J774A.1, L-118 mg e células HT-1080 por frasco de cultura com 5 mL do respectivo meio de cultura (em quíntuplos) e crescer durante 16-24 horas. Paralelas aos frascos de cultura, 30.000 células sementes de cada linha celular (J774A.1 e HT-1080) ou 20.000 células (L-118 mg) de 2 poços da corrediça câmara, respectivamente, e crescer em 500 ul de meio de cultura durante 16-24 hr . </li><li> No dia seguinte, adicionar 100 nmol (montante final lipídica) de Lip-Q para 2 frascos por linha celular e para um bem de cada linha celular no slide câmara.Transferir imediatamente um balão por linha de células a 4 ° C e o segundo frasco de volta para a incubadora. NOTA: O volume das sondas adicionado aos frascos e as lâminas de câmara são o mesmo, tornando a concentração em lâminas de câmara de 10 vezes maior (5 ml é de 500 ul de meio de cultura). Isto é necessário porque a detecção microscópica é menos sensível do que o sistema de imagiologia NIR de fluorescência em que os grânulos de células a partir de balões são gravadas. </li><li> Adicionar o livre DY-676-COOH em uma concentração equivalente ao conteúdo de corante Lip-Q para as células em 2 frascos por linha de células e a um poço de cada linha de células na câmara de corrediça, em seguida, imediatamente transferir um balão por linha de células a 4 ° C (depleção de energia) e o outro balão em conjunto com a lâmina de câmara de novo na incubadora. Incubar todas as células durante 24 horas nas condições correspondentes. As células no frasco sem sonda servir como controlo não tratado. </li></ol></li><li> Imagiologia NIRF e análise semi-quantitativa <ol><li> Após 24 h de incubação duração, colher as células em frascos por lavagem as células 2 vezes com solução salina tamponada de Hanks (HBSS), em seguida, raspar células em 500 ul de HBSS e pelete por centrifugação (5 min a 200 xg) em 500 ul tubos. </li><li> Colocar os tubos com os sedimentos celulares (e HBSS) em um imager NIRF e de imagem usando filtros para excitação (615-665 nm) e emissão (corte em&gt; 700 nm). </li><li> Deduzir autofluorescência e avaliar a intensidade do alvo contra autofluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Isso dará aos níveis semi-quantitativas de intensidade de fluorescência como sinal médio (contagem escalados / s), o que representa níveis de contagem após a escala de tempo de exposição, o ganho de câmera, binning e profundidade de bits, de modo que as medições são comparáveis ​​entre si. </li></ol></li><li> Análise microscópica confocal <ol><li> Após 24 h de incubação, a colheita das células sobre lâminas de câmara por lavagem duas vezes com 500 uL de HBSS. </li><li> Fixar o cells com 200 ul de HBSS contendo 3,7% (v / v) de formaldeído, durante 30 min à TA. </li><li> Enquanto fixação está acontecendo, diluir a mancha DNA, Hoechst-33258 1:50 com solução de montagem. </li><li> Após a fixação, lavar as células duas vezes com HBSS, em seguida, separar as câmaras de lâminas de vidro. Adicionar a solução de montagem 50 ul contendo o ADN-mancha em cada mancha correspondente ao das cavidades das lâminas de câmara. Cubra as células com lamelas de vidro, selar bordas com transparente unha polonês e por 10 min de ar seco à temperatura ambiente (escuro). </li><li> Células imagem em um microscópio de fluorescência adequado ou microscópio confocal. Use as seguintes configurações de excitação e emissão para a visualização dos componentes correspondentes: núcleos (Hoechst-33258: excitação 405 nm, emissão 420-480 nm). NBD-DOPE (lipídico lipossómico: excitação 488 nm, emissão 530 nm). DY-676-COOH (corante fluorescente NIR: excitação 633-645 nm, emissão de 650-700 nm). NOTA: Certifique-se de que o microscópio de fluorescência umvailable está equipado com filtros adequados que permitam a excitação e emissão de comprimentos de onda superior a 630 nm. </li></ol></li></ol> 3. Liposome baseada-In Vivo imagens de fluorescência de Inflamação <ol><li> Preparação dos animais e dos materiais <ol><li> Casa de 8-12 semanas de idade, ratinhos NMRI machos, pesando aproximadamente 36 g, em condições normalizadas, com alimentos e água ad libitum. </li><li> Sete dias antes do início das experiências, todos os ratinhos dar uma dieta baixa feoforbida a fim de reduzir a autofluorescência de tecidos. </li><li> Vinte e quatro horas antes do início de cada experiência, os ratos barbear na área desejada (por exemplo, toda a área de volta se a imagiologia do edema da perna posterior é desejado). </li><li> Pese os animais e calcular a quantidade de sonda a ser injetado por rato (Lip-Q e Lip-dQ a 10 nmol (concentração de lipídios) por kg de peso e livre DY-676-COOH (equivalente a tingir o conteúdo de Lip-Q usado) . </li><li> Imagem dos animais emum corpo inteiro NIR gerador de imagens de fluorescência com os mesmos parâmetros utilizados para as pelotas celulares. Esta medição fornece autofluorescência dos animais. </li><li> Dissolvem-se 10 mg de zimosan-A em 1 ml de solução salina isotónica e armazenar durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> A indução da inflamação in vivo e NIRF imagiologia <ol><li> Prepare 3 seringas por rato que contenham as seguintes soluções. Encher uma seringa com 50 ul zimosan-se uma solução (10 mg / mL) e a segunda seringa com 50 mL de solução salina isotónica. Encha a terceira seringa com as sondas, sendo que Lip-Q e Lip-DQ (10 mmol / kg de peso (lípidos)) são designados para animais de teste e livre DY-676-COOH (concentração como em Lip-Q) para animais de controle. Certifique-se que as sondas são diluídas com HBSS estéril a 150 volume final ul. </li><li> Aplique o creme de olho nos olhos dos animais para evitar a secura e anestesiar animais com 2% de isoflurano até que eles estão dormindo profundamente e não reagem quando tocado nas patas (isto leva de cerca de 2 min). </li><li> Posicione o mouse sobre um tapete quente (ainda sob anestesia) e injetar o zymosan-A via subcutânea solução na perna traseira direita e a solução salina sobre a perna esquerda. Injectar imediatamente a sonda intravenosa e imagem do animal, posteriormente, em seguida, tempo recorde de injeção / medição (como t = 0 h). Salve as imagens resultantes como cubos de imagem e repita os passos acima para todos os outros animais e respectivas sondas. </li><li> Imagem os animais todos os 2 hr para 10 horas após injecção e às 24 horas após a injecção, assegurando-se que a fase da câmara de medição está quente (por exemplo, pela colocação de uma esteira quente por baixo), a fim de evitar a hipotermia. Após cada medição, colocar os animais numa gaiola com comida e água ad libitum e colocar a gaiola numa câmara de animais temperado. Eutanásia os animais por primeira anestesia com isoflurano a 2%, até os animais já não reagem ao toque, então sacrificá com dióxido de carbono para 5-10 min, fazendoCertifique-se de que os animais parar de respirar completamente e rigor mortis ocorre. </li><li> Dissecar os ratos de acordo com protocolos padrão que podem ser avaliadas em linha (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) e imagem dos órgãos. </li><li> Avaliar os resultados da medição de acordo com as instruções do fabricante pela primeira dedução da fluorescência geral dos animais (desmistura), em seguida, as regiões atribuição de interesse para autofluorescência (esquerda perna com soro fisiológico) e alvo de fluorescência da área inflamada (pata traseira direita com zymosan-A). </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Uma vez que os lipossomas também podem servir como sistemas de entrega de corantes fluorescentes, que permitem imagiologia de doenças alvo. A encapsulação de concentrações elevadas de corantes fluorescentes, tais como o corante NIRF, DY676-COOH usado aqui, leva a um elevado nível de extinção de fluorescência do corante aprisionado. Extinção da fluorescência, um fenómeno observado com diversos fluoróforos em concentração elevada pode ser explorada em diversas aplicações em imagiologia in vivo, em que um...

Os lipossomas têm sido intensivamente investigados e servir como um dos sistemas de fornecimento de drogas biomédicas mais biocompatíveis para aplicações clínicas 1,2. Eles são compostos principalmente de fosfolípidos e colesterol, ambos os quais são compostos que imitam biocompatíveis partes de membranas celulares naturais. Considerando que as substâncias hidrofílicas podem ser encapsulados no interior aquoso, agentes lipofilicos podem ser incorporados no interior da bicamada fosfolipídica lipossomal 3. A encapsulação de substâncias no interior aquoso dos lipossomas concede protecção contra a degradação in vivo e também evita que o sistema hospedeiro contra os efeitos tóxicos de fármacos citotóxicos utilizados para a terapia de doenças como, por exemplo, agentes quimioterapêuticos destinados a destruir as células tumorais. A modificação da superfície de lipossomas com polímeros como o polietilenoglicol (PEGuilação) estende-se ainda mais o tempo de circulação no sangue de lipossomas in vivo devido à estabilização estérico 4. Moreover, os lipossomas podem sequestrar concentrações elevadas de várias substâncias, tais como proteínas, substâncias hidrófilas 5,6 7,8 9 e enzimas. Eles, portanto, servir de instrumentos terapêuticos e diagnósticos clínicos como confiáveis ​​que merecem a sua aprovação para a entrega de medicamentos citotóxicos, como a doxorrubicina para terapia de câncer 4. Devido à sua flexibilidade, os lipossomas podem também ser carregadas com fluorocromos para fins cirúrgicos de diagnóstico e guiada por imagem. Imagens de fluorescência fornece uma relação custo-benefício e não-invasivo em ferramenta de diagnóstico vivo que, no entanto, exige alguns requisitos básicos. Pode ser demonstrado que fluorocromos que se adequar melhor para a imagem in vivo têm absorção característica e máximos de emissão na faixa onde a dispersão de luz e espalhando bem como autofluorescência de tecidos de origem a partir da água e hemoglobina é baixo. Assim, tais sondas têm a sua maxima abs / em entre 650 e 900 nm 10.<html> Além disso, a estabilidade de fluorocromos tanto in vitro como in vivo é crítico, como a opsonização rápida depuração e pode limitar muito a sua aplicação para a imagem in vivo 11. Outros efeitos como a má estabilidade e baixa sensibilidade ou efeitos citotóxicos em órgãos-alvo, como visto com indocianina verde (ICG) 12-16, não são desejadas e devem ser levados em consideração na concepção de sondas para a imagem in vivo. Estas observações conduziram ao desenvolvimento activo de vários fluorocromos NIR pré-clínicos, nanopartículas assim como novas técnicas de imagiologia in vivo de processos inflamatórios, cancro e para cirurgia guiada por imagens 17-20. Apesar de a estabilidade de mais (de fluorescência no infravermelho próximo) NIRF pré corantes in vitro, a sua perfusão rápida depuração e através do fígado e do rim impedir a sua utilização na imagiologia óptica in vivo de doenças e processos inflamatórios. ntent &quot;&gt; Por isso, apresentam um protocolo para a encapsulação de fluorocromos tais como o bem caracterizado no infravermelho próximo corante fluorescente DY-676-COOH, conhecida pela sua tendência para a auto-arrefecimento rápido em concentrações relativamente elevadas 21 em lipossomas. A altas concentrações de H- a formação de dímeros e / ou interações entre as moléculas de fluoróforo localizados dentro resultado do outro raio Förster em Förster transferência de energia de ressonância (FRET) entre as moléculas de fluorocromo. Em baixas concentrações no espaço entre as moléculas de fluoróforo aumenta, impedindo assim a interacção de empilhamento de pi-empilhamento pi formação e resultando na emissão de fluorescência elevada H-dímero. O interruptor de entre alta e baixa concentração e a extinção da fluorescência de acompanhamento e de activação é uma estratégia promissora, que pode ser explorada para a imagiologia óptica 22. A este respeito, a encapsulação de concentrações elevadas de corante NIRF DY-676-COOH no interior aquosa de lipossomas é mais fafavorá- para geração de imagens in vivo do que o corante livre. O desafio do método situa-se em primeiro lugar no encapsulamento correcta e em segundo lugar, na validação dos benefícios resultantes de elevadas concentrações de encapsulação do corante. Comparando as propriedades de imagem de lipossomas desactivada com o do corante livre e também com uma formulação de lipossomas não-temperada com baixas concentrações do corante é indispensável. Mostramos por um protocolo de hidratação do filme e extrusão simples, mas altamente eficaz combinado com congelamento e descongelamento ciclos alternados que o encapsulamento das concentrações de extinção de DY-676-COOH em lipossomas é viável. Outros métodos utilizados para preparar lipossomas, tais como o método de evaporação de fase inversa 23 bem como o método de injecção de etanol 24 permitir a preparação dos lipossomas com elevadas eficiências de encapsulação para muitas substâncias hidrófilas. No entanto, a natureza da substância a ser encapsulada pode influenciar a eficiência de encapsulação. Com efeito,o protocolo de hidratação do filme e extrusão aqui apresentados revelaram a maior eficiência para o encapsulamento de DY-676-COOH. Para ilustrar os benefícios de encapsulamento lipossomal de DY-676-COOH, um modelo de edema induzido pelo zimosano, que permite o estudo de processos inflamatórios no interior de algumas horas, foi usado. Aqui, demonstra-se que os lipossomas com concentrações elevadas do encapsulado DY-676-COOH são mais adequados para o corpo inteiro em imagiologia óptica vivo de processos inflamatórios do que a do corante livre ou a formulação lipossomal não-temperada com baixas concentrações de corantes. Assim, o protocolo subjacente proporciona um método simples e rápido para a produção de lipossomas fluorescentes temperados e a validação da sua activação e imagiologia potencial tanto in vitro como in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiais e equipamentos para preparação de lipossomas</forte></td></tr><tr><td>ovo fospahtidilcolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051P</td><td>Dissolver em clorofórmio e armazenar em frascos de vidro (214 mg/ml)</td></tr><tr><td>colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Dissolver em clorofórmio e armazenar em frascos de vidro (134 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>Dissolver em clorofórmio e armazenar em frascos de vidro (122 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amônio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>Dissolver em clorofórmio e armazenar em frascos de vidro (2 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)</td><td>Sartorius AG</td><td>Research RC 210 P</td><td>usado para pesar os fosfolipídios</td></tr><tr><td>Rotavapor</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>usado para hidratação de filme fosfolipídico</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>usado para hidratação de filme fosfolipídico</td></tr><tr><td>Controlador de Vácuo</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>usado para hidratação do filme fosfolipídico</td></tr><tr><td>Vacobox</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>usado para hidratação de filme fosfolipídico</td></tr><tr><td>Resfriador de circulação</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>usado para hidratação de filme fosfolipídico</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>Dissolva em 10 mM Tris e armazene o estoque a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Tris-(Hidroximetil)-aminometano</td><td>Tampão Applichem</td><td>A1086</td><td>10 mM, pH 7,4</td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>usado para preparação de lipossomas</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>usado para preparação de lipossomas</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>usado para preparação de lipossomas</td></tr><tr><td>Sephadex G25 medium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>usado para purificação de lipossomas</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>usado para destruir lipossomas&nbsp; para quantificação de corantes</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>usado para a extrusão de lipossomas</td></tr><tr><td>Membrana de filtro de policarbonato, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0,1 U)</td><td>VWR</td><td></td><td>usado para a extrusão de lipossomas via LiposoFast-Basic</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>usado para quantificação de corantes</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>usado para a determinação do tamanho do lipossoma e zetapotencial</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>utilizado para concentração das amostras</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>utilizado para concentração das amostras</td></tr><tr><td colspan="4">Materiais e equipamentos para avaliação de lipossomas e imagens ópticas</td></tr><tr><td>Zymosan-A de Saccharomyces cereviciae</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>utilizado para indução de inflamação</td></tr><tr><td>Solução salina isotônica (0,9%)</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>usado para a diluição do vaporizador de isoflurano Zymosan-A</td></tr><tr><td></td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>usado para anestesiar animais</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Actavis GmbH&nbsp;</td><td>PZN-7253744</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>usado para manter os animais aquecidos durante a anestesia</td></tr><tr><td>Omnican-F (injeção de 1 ml)&nbsp;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>usado para aplicação subcutânea e intravenosa de sondas</td></tr><tr><td>Pantenol creme para os olhos</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>usado para prevenir o ressecamento dos olhos dos animais durante a anestesia</td></tr><tr><td>Hanks tamponado solução salina</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>sem Mg2+, Ca2+ e vermelho de fenol. Para diluição de sondas e para lavagem de células</td></tr><tr><td>Lâminas de câmara de 8 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>usadas para cultura de células seguida de microscopia&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de células</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro&nbsp;</td><td>Solução de</td> Poli-L-Lisina Invitrogen <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,01%, 50&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>usado para revestir lâminas de câmara de cultura de células</td></tr><tr><td>Mountant Permafluor</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>S21022-3</td><td>Solução de montagem para microscopia</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>AppliChem</td><td></td><td>Mancha de DNA para microscopia</td></tr><tr><td>Bancada de trabalho estéril</td><td>Hera-Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td> usada para cultura de células</tr><tr><td>Célula HERA</td> Incubadora de <td>instrumentos</td><td></td> Heraeus <td>usada para cultura de células</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td><td></td><td>usada para microscopia</td></tr> <tr><td>confocalSistema de imagem de fluorescência in vivo Maestro-TM</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>usado para imagens de fluorescência de corpo inteiro de pequenos animais</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro (Ultrospec 4300 pro UV)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>usado para medição de absorção</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro (Jasco FP-6200)</td><td>Jasco</td><td></td><td>usado para medição de emissão</td></tr><tr> de fluorescência<td colspan="4">Animals</td></tr><tr><td>Camundongos NMRI (8-12 semanas de idade, machos)</td><td>Elevage Janvier, França</td><td></td><td>usado para ensaios de inflamação</td></tr></tbody></table>

fluorescência-têmpera de um fluoróforo encapsulado em lipossomas near-infrared como ferramenta para in vivo imageamento óptico

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

A imagem óptica oferece uma ampla gama de modalidades de diagnóstico e tem atraído muito interesse como ferramenta para imagens biomédicas. Apesar do enorme número de técnicas de imagem atualmente disponíveis e do progresso na instrumentação, ainda há necessidade de sondas altamente sensíveis que sejam adequadas para imagens in vivo. Um problema típico das sondas fluorescentes pré-clínicas disponíveis é sua rápida depuração in vivo, o que reduz sua sensibilidade de imagem. Para contornar a depuração rápida, aumentar o número de moléculas de corante no local alvo e, assim, reduzir a autofluorescência de fundo, foi feito o encapsulamento do corante fluorescente infravermelho próximo, DY-676-COOH em lipossomas e a verificação de seu potencial para imagens in vivo da inflamação. O DY-676 é conhecido por sua capacidade de se auto-extinguir em altas concentrações. Primeiro determinamos a concentração adequada para auto-têmpera e, em seguida, encapsulamos essa concentração de têmpera no interior aquoso dos lipossomas PEGilados. Para comprovar o potencial de extinção e ativação dos lipossomas, usamos um método de congelamento severo que leva a danos nas membranas lipossomais sem afetar o corante encapsulado. Os lipossomas caracterizados por um alto nível de extinção de fluorescência foram denominados Lip-Q. Mostramos por meio de experimentos com diferentes linhagens celulares que a captação de Lip-Q é predominantemente por fagocitose, o que por sua vez permitiu a caracterização de seu potencial como ferramenta para imagens in vivo da inflamação em modelos de camundongos. Além disso, usamos um modelo de edema induzido por zimosana em camundongos para comprovar o potencial de Lip-Q em imagens ópticas de inflamação in vivo. Considerando a possível absorção devido ao efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR) induzido pela inflamação, uma formulação de lipossomas sempre ativa com baixa concentração não extinta de DY-676-COOH (denominada Lip-dQ) e o DY-676-COOH livre foram comparados com Lip-Q em testes em animais.

A encapsulação de concentrações elevadas de corantes fluorescentes, tais como o corante NIRF DY676-COOH utilizado aqui no interior aquoso dos lipossomas leva a um elevado nível de extinção de fluorescência. Supressão de fluorescência, um fenômeno visto com muitos fluorophores em alta concentração, pode ser explorada em vários em aplicações de imagem in vivo, onde a alta sensibilidade e detecção confiável da área-alvo são exigidas. O uso de lipossomas também fornece protecção do corante que é indispensá...

O uso de fluoróforos para imagens in vivo pode ser bastante limitado por opsonização, depuração rápida, baixa sensibilidade de detecção e efeitos citotóxicos no hospedeiro. O encapsulamento de fluoróforos em lipossomas por hidratação e extrusão de filme leva à extinção e proteção de fluorescência, o que permite imagens in vivo com alta sensibilidade de detecção.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar um lipossomo activat que permita imagens in vivo da inflamação com alta sensibilidade. Isso é feito preparando primeiro um filme lipídico composto de fosfolipídios na segunda etapa. As vesículas espontâneas são formadas pela hidratação do filme fosfolipídico com uma solução de concentração extinta de um corante fluorescente infravermelho próximo.As vesículas formadas espontaneamente ou SFV são extrudadas para garantir a homogeneidade das vesículas lipossomais e, em seguida, os lipossomas são purificados a partir das moléculas residuais de corante não encapsuladas. Em última análise, medições espectrométricas de absorbância e emissão de fluorescência são usadas para mostrar o estado de têmpera do corante encapsulado enquanto in vivo. A imagem de fluorescência no infravermelho próximo é usada para demonstrar o potencial dos lipossomas para a imagem de processos inflamatórios.A principal vantagem dessa tecnologia sobre outras existentes é que podemos determinar o sinal diretamente após a internalização do agente de contraste nas células. Isso significa que eles são ativados na célula para que o sinal detectado venha exclusivamente das células. A implicação dessa técnica se estende ao diagnóstico e terapia do câncer.Uma vez que os fagócitos, como os macrófagos associados ao tumor, podem absorver e degradar os lipossomas, liberando drogas terapêuticas ou sondas de imagem dentro dos tumores. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a eficiência do encapsulamento é influenciada pelas propriedades do uso do DAI e pela eficácia do processo de hidratação Para iniciar a dispersão vesical formada espontaneamente, comece adicionando aproximadamente três mililitros de clorofórmio a um frasco de fundo redondo, seguido pelo volume apropriado de soluções de caule fosfolipídico recém-preparadas em uma proporção molar de 6,5 a três a 0,5 para marcação fluorescente dupla dos lipossomas. Em seguida, adicione 0,3% molar N-B-D-D-O-P-E à solução lipídica.Em seguida, use um evaporador rotativo para evaporar o clorofórmio da solução de fosfolipídio orgânico sob pressão reduzida a 300 milibares e 55 graus Celsius. Depois que um filme fosfolipídico homogêneo for formado, reduza a pressão para 10 milibar por uma a duas horas para remover qualquer depósito residual de clorofórmio enquanto o clorofórmio está evaporando. Dissolva o tampão de interesse do ácido carboxílico do corante fluorescente e encha um recipiente de alimentação com nitrogênio líquido.Em seguida, ligue um banho ultrassônico ajustado a 50 graus Celsius. Agora transfira um volume apropriado do ácido carboxílico corante para o frasco de fundo redondo para hidratar o filme fosfolipídico seco e o vórtice para o frasco vigorosamente até formar uma dispersão de vesícula formada espontaneamente, certificando-se de que todos os fosfolipídios sejam dispersos para evitar a perda de lipídios. Em seguida, congelar cuidadosamente o balão de fundo redondo que contém a dispersão SFV em azoto líquido.E depois de três a cinco minutos, coloque o frasco no banho ultrassônico para descongelar a dispersão e agitar o frasco vigorosamente por mais um a dois minutos. Em seguida, para facilitar a formação de vesículas homogêneas, aspire a dispersão de SFV em uma seringa de um mililitro e, em seguida, use uma extrusora básica de sofás lipo para passá-la através de uma membrana de policarbonato de 100 nanômetros em uma segunda seringa de um mililitro. Extrusão da dispersão de volta para a primeira seringa, repetindo a transferência 10 vezes.A solução deve passar de uma aparência nebulosa para uma dispersão clara. Após o 10º ciclo de extrusão, remova a segunda seringa e extrude a dispersão pela última vez diretamente em um tubo de reação estéril de 1,5 mililitro. Agora transfira 0,5 mililitros da dispersão da vesícula extrudada para o leito de gel de uma coluna de cromatografia em gel de 28 centímetros carregada com grânulos G 25 embebidos em tampão tris e deixe a amostra escorrer para a matriz de gel.Eluir os lipossomas com tampão tris e recolher a fracção lipossoma até que o lipossoma seja completamente drenado. Em seguida, concentre os lipossomas iludidos por ultracentrifugação e disperse-os em um volume adequado de micrografias eletrônicas estéreis de tampão tris dos lipossomas devem revelar uma morfologia predominantemente unal das vesículas lipossomais para analisar as habilidades de extinção e ativação de fluorescência dos lipossomas. Em seguida, transfira 100 nanomolares totais dos lipídios apropriados para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, transfira um ácido di carboxílico livre equivalente ao teor de corante do lábio Q em outro tubo de 1,5 mililitro e incube um tubo de cada sonda a quatro graus Celsius e o segundo a 80 graus Celsius negativos. Na manhã seguinte, defina o bloco de aquecimento para 30 graus Celsius. Encher uma caixa de refrigeração com gelo picado e equilibrar uma alíquota de tampão tris à temperatura ambiente.Em seguida, descongele rapidamente as sondas do armazenamento de 80 graus Celsius negativos a 30 graus Celsius por cinco minutos, enquanto equilibra as sondas de quatro graus Celsius à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, resfrie todas as sondas no gelo por um minuto antes de transferi-las de volta à temperatura ambiente. Agora adicione o tampão tris a cada uma das sondas para um volume final de 100 microlitros.E então, após mais 10 minutos de incubação em temperatura ambiente, pipete 80 microlitros de cada sonda em um veterinário de vidro de baixo volume e meça a absorção de 400 a 900 nanômetros em um espectrômetro. Retorne as sondas aos tubos correspondentes e, em seguida, transfira 80 microlitros de cada uma para cubetas de vidro adequadas. Medir as emissões de fluorescência em um fluorímetro espectral, excitando as sondas a 674 nanômetros e medindo a fluorescência de 694 a 800 nanômetros.Para avaliar as propriedades de detecção de inflamação dos lipossomas, encha uma seringa com 50 microlitros de solução salina xina a, uma com 50 microlitros de solução salina isotônica e uma com a solução experimental da sonda, todas diluídas em HBSS até um volume final de 150 microlitros. Depois de confirmar a sedação por pinça do dedo do pé, aplique creme para os olhos no animal experimental e coloque o mouse em um tapete quente. Injete a solução xon a por via subcutânea na pata traseira direita do animal e a solução salina na perna traseira esquerda.Em seguida, injete imediatamente a sonda por via intravenosa e faça uma imagem do animal em seguida. Por fim, salve as imagens resultantes como cubos de imagem. Imagem dos animais a cada duas horas por 10 horas após a injeção e novamente em 24 horas.As sondas lipossomais revelam uma captação fagocítica predominante que é inibida pela depleção de energia, como pode ser visto através da captação de Q labial por linhagens celulares de micrófagos espelhados altamente fagocíticos e linhagens celulares de glioblastoma humano mofagocítico. Consistente com a captação fagocítica observada em linhagens celulares cultivadas, a injeção intravenosa de LIP Q leva a um aumento dependente do tempo na intensidade de fluorescência do edema em modelos de camundongos com fluorescência de fundo muito baixa e com uma intensidade máxima de fluorescência detectada oito a 10 horas após a injeção. Em contraste, uma fluorescência relativamente forte no infravermelho próximo de todo o animal é observada após a aplicação do ácido carboxílico livre ou do lábio desqualificado sempre ativo em comparação com o lábio Q. A rápida perfusão e depuração do ácido carboxílico livre, observada de zero a quatro horas após a injeção, interfere na imagem, tornando impossível a detecção confiável do edema.Além disso, o lipossomo não extinto labial DQ revela uma fluorescência máxima de edema dentro de duas a quatro horas após a injeção, que permanece quase constante até oito horas e depois diminui gradualmente de maneira semelhante ao lábio temperado. A imagem de fluorescência de edema baseada em Q dos órgãos de camundongos sacrificados 24 horas após a administração da sonda revela uma leve fluorescência ex vivo do fígado, vesícula biliar e rins, e uma fluorescência muito baixa ou nenhuma do baço, pulmões e coração, servindo como evidência para a eliminação das sondas pela via patobiliar. Ao participar deste procedimento, é importante lembrar de usar uma alta concentração do corante de têmpera do sentido da gripe e dispersar os fosfolipídios adequadamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar lipossomas activat para imagens in vivo de inflamação com alta sensibilidade. Okey? Não se esqueça de que, para a utilização de animais em pesquisa, você deve seguir as diretrizes internacionais, e isso significa que você deve solicitar a utilização de animais em experimentos. Você precisa da aprovação do comitê de ética local.

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

Expandindo a fundação e aplicabilidade da fluorescência por Unbound excitação de luminescência (FUEL) através do levantamento os princípios relevantes e demonstrar a sua compatibilidade com uma infinidade de fluoróforos e condições alvo de anticorpos.

A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Estimulação de ultra-som pulsado da baixo-intensidade (U.S.P) é uma modalidade para a estimulação mecânica não-invasiva de células endógenas ou projetadas com alta resolução espacial e temporal. Este artigo descreve como implementar U.S.P para um microscópio de fluorescência-epi e como minimizar a incompatibilidade de impedância acústica ao longo do caminho de ultra-som para evitar artefatos mecânicos indesejáveis.

Multiplexação focada a estimulação de ultra-som com microscopia de fluorescência

O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

Apresentamos um protocolo para o uso de microendoscopia a laser confocal (CLM) para estudar não invasivamente a distribuição espátula-temporal de lipossomos no olho após injeção subconjunta.

Espólio-Temporal Em Vivo Imagem de Sistemas de Entrega de Drogas Oculares usando Microendoscopia a laser confocal de fibra óptica

Este artigo descreve o uso de um novo imageador óptico rápido para a imagem macroscópica da vida útil da fotoluminescência de amostras emissoras de decaimento longo. Os procedimentos de integração, aquisição e análise das imagens são descritos, juntamente com a preparação e caracterização dos materiais sensores para a aquisição de imagens e a aplicação do imageador no estudo de amostras biológicas.

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

O presente protocolo descreve uma operação detalhada de imagem de fluorescência NIR-II em tempo real de um rato usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II.

Uma sonda de fluorescência NIR-II brilhante para imagens vasculares e tumorais

Este artigo descreve a marcação de duas cores de RNAs longos em posições de terminais e sua imobilização de superfície via encapsulamento em vesículas fosfolipídicas para aplicações de microscopia FRET TIRF de molécula única. A combinação dessas técnicas permite a visualização e análise precisas da dinâmica do RNA no nível de uma única molécula.

Marcação final fluorescente e encapsulamento de RNAs longos para microscopia FRET-TIRF de molécula única

Aprenda a preparar lipossomas ativáveis para imageamento óptico in vivo de inflamação com alta sensibilidade usando filmes lipídicos e corantes near-infrared encapsulados.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

Explorar mais vídeos