Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.
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Artigo de método
Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay
Neste artigo
Resumo
Resumo
Discos grandes (Dlg) são um membro conservado da família da guanilato quinase associada à membrana e servem como uma importante proteína de andaime na junção neuromuscular larval (NMJ) em Drosophila. Estudos anteriores mostraram que a distribuição pós-sináptica de Dlg na larva NMJ se sobrepõe à de Hu-li tai shao (Hts), um homólogo das aducinas de mamíferos. Além disso, observa-se que Dlg e Hts formam um complexo entre si com base em experimentos de co-imunoprecipitação envolvendo lisados de moscas adultas inteiras. Devido à natureza desses experimentos, no entanto, não se sabia se esse complexo existe especificamente no NMJ durante o desenvolvimento larval.
O Ensaio de Ligação de Proximidade (PLA) é uma técnica recentemente desenvolvida usada principalmente em cultura de células e tecidos que pode detectar interações proteína-proteína in situ. Neste ensaio, as amostras são incubadas com anticorpos primários contra as duas proteínas de interesse usando procedimentos imuno-histoquímicos padrão. Os anticorpos primários são então detectados com um par especialmente projetado de anticorpos secundários conjugados com oligonucleotídeos, denominados sondas PLA, que podem ser usados para gerar um sinal somente quando as duas sondas se ligam próximas uma da outra. Assim, as proteínas que estão em um complexo podem ser visualizadas. Aqui, é demonstrado como o PLA pode ser usado para detectar interações proteína-proteína in situ na larva de Drosophila NMJ. A técnica é realizada em preparações musculares da parede corporal larval para mostrar que um complexo entre Dlg e Hts realmente existe na região pós-sináptica das JNMs.
Introdução
Discos de Drosophila grande (Dlg) é um membro conservada da guanilato-quinase associada à membrana da família de proteínas de andaimes que ajudam a orquestrar a montagem de grandes complexos de proteínas em sítios específicos da membrana plasmática. Originalmente identificado como uma proteína supressora de tumor, Dlg serve como um importante determinante da epitelial 1,2,3 apicobasal polaridade. Dlg também serve como um importante módulo de andaime na junção neuromuscular (JNM) dos neurônios motores glutamatérgicos durante o desenvolvimento larval 4. Dlg desempenha diversos papéis na JNM larval, e a sua pleiotropismo depende da sua capacidade de se associar com várias proteínas de 5,6. Uma dessas proteínas é Hu-li tai Shao (HTS), um homólogo às adducins mamíferos que foram descritos principalmente no que diz respeito às suas funções na regulação da actina-spectrin citoesqueleto 7. Foi previamente mostrado que Dlg e Hts pode formar um complexo com os outros com base em testes in vitro experimentos co-imunoprecipitação envolvendo toda mosca adulta lisados 8. Uma desvantagem destes resultados, no entanto, é que elas não indicam onde este formas complexas. Com a utilização de imuno-histoquímica, as distribuições de Dlg e Hts são observados a sobrepor-se na membrana pós-sináptica da NMJs larvas, mas são eles em um complexo na região 8? Como mostrado recentemente e detalhado mais aqui, Proximity Ligation Assay (PLA) é usado para procurar um em associação situ entre Dlg e Hts especificamente no larval NMJ 27.
PLA é uma técnica relativamente nova usado principalmente em cultura de células e de tecidos que podem detectar interacções proteína-proteína in situ 9. Neste ensaio, os anticorpos primários contra as duas proteínas de interesse são detectados com um par de anticorpos secundários específicos da espécie, denominados sondas de PLA, que são conjugados com oligonucleótidos (Figura 1A, B). Se as duas proteínass estão em estreita proximidade uns dos outros (isto é, dentro de poucas dezenas de nanómetros), a distância entre as sondas de PLA podem ser ligados em ponte através de hibridação de dois oligonucleótidos de conectores adicionais (Figura 1C). Neste conformação, as extremidades livres dos oligonucleótidos do conector está perto o suficiente para entrar em contacto uns com os outros, e uma molécula de ADN circular, fechada pode ser formada a partir de ligadura situ (Figura 1D). A molécula de ADN circular, serve como molde para a amplificação in situ círculo rolante, o qual é preparado por um dos oligonucleótidos conjugados com as sondas de PLA (Figura 1E). Sequências dentro do amplificado, produto de ADN concatemeric resultante pode então ser visualizado com marcada com fluorescência, as sondas de oligonucleótidos complementares (Figura 1F). Uma vez que o ADN amplificado permanece ligado a uma das sondas de PLA, a localização subcelular da interacção proteína-proteína withind tecido pode ser facilmente determinada.
Vários métodos são comumente usados para detectar interacções proteína-proteína, incluindo técnicas in vitro tais como a co-imunoprecipitação, ensaios de pull-down e levedura de rastreio de dois híbridos, e em técnicas in vivo, tais como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) e Bimolecular Complementação de fluorescência ( BiFC). Um problema das técnicas in vitro é que eles não identificam onde a interacção ocorre endogenamente, enquanto o acima mencionados nas técnicas in vivo envolvem a expressão artificial de proteínas de fusão que pode não reflectir o comportamento nativo dos seus homólogos endógenos. Uma grande vantagem de PLA é que ele é capaz de determinar dentro de um tecido a localização subcelular de proteínas de interactores endógenos que estão em estreita proximidade uns dos outros e provável que formam um complexo, com o grau de proximidade necessária para gerar um sinal a ser comparáveis aos FRET e BiFC. PLA podem detectar interacções com elevada especificidade e sensibilidade devido ao acoplamento de reconhecimento do anticorpo e a amplificação de ADN. Assim, o ensaio pode gerar sinais luminosos discretas, em forma de pontos lacrimais que indicam a posição exacta da interacção. Além disso, os antigénios dificilmente visíveis pode ser detectada. Finalmente, PLA é uma técnica relativamente simples de executar, e já não tem do que um procedimento padrão imuno-histoquímico para ser concluído. Portanto, PLA fornece uma vantagem técnica sobre outros ensaios de interação proteína-proteína que muitas vezes são atormentados com tempos de preparação longa e extensa solução de problemas.
Este protocolo demonstra como PLA pode ser aplicado para a Drosophila larval JNM para a finalidade de detecção de interacções proteína-proteína endógenos, in situ. Aqui, PLA é realizada em preparações de músculos da parede do corpo larval onde Dlg e Hts são mostrados para realmente existem em um complexo na região pós-sináptica da NMJs. PLA não tenha sido previamente utilizado para estudar a NMJ larval, e existem, actualmente, apenas um punhado de artigos publicados que utilizaram este ensaio no tecido Drosophila. Espera-se que uma maior exposição do PLA para a comunidade Drosophila resultará em aumento da sua utilização como uma ferramenta adicional para complementar outras, mais comumente utilizados ensaios de interação proteína-proteína.
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Protocolo
1. Corpo de parede Preparação
NOTA: Preparação do terceiro estádio larvar paredes do corpo (para estudo de NMJs que enervam os músculos da parede corporal) foi realizada como previamente descrito em Brent et al 10, ou Ramachandran e Budnik 11,12, mas com algumas modificações..
- Dissecação
- Elevar existências mosca e cruzes, a 25 ° C durante cinco a seis dias, utilizando 13 procedimentos standard.
- Escolha rastejando larvas de terceiro instar de frascos ou garrafas usando uma pinça fina.
- Lavar as larvas numa pequena placa de Petri contendo tampão de fosfato salino (PBS) para remover quaisquer partículas de alimento.
- Coloque uma única larva em um disco Sylgard e mergulhá-lo em algumas gotas de PBS gelado. Usando PBS gelado vai ajudar atordoar o larva tornando mais fácil de manipular. Ao longo do esvaziamento, assegurar que a preparação está sempre submersa em PBS para evitar que sequem.
- Posicione a larva com o seu lado dorsal voltada para cima, de modo que as duas vias de traqueais são visíveis sob um microscópio de dissecção (Figura 2A). Usando a pinça para agarrar um pino minutien, fixar a larva para baixo na extremidade posterior, perto das spiracles (Figura 2B). Com um outro pino, furar através da cutícula na extremidade anterior perto dos ganchos na boca. Delicadamente, esticar a larva no sentido longitudinal, em seguida, fixá-lo para baixo (Figura 2B).
- Com uma tesoura microdissecção, aperte a extremidade posterior perto do pino para criar uma pequena abertura. A incisão deve ser superficial apenas o suficiente para passar através da cutícula.
- Colocar a ponta da lâmina inferior das tesouras na incisão, cortado ao longo de todo o comprimento da linha média dorsal entre as duas vias de traqueal (Figura 2C). Aponte as lâminas da tesoura ligeiramente para cima quando o corte para evitar danificar os músculos da parede ventral do corpo.
- Faça uma pequena incisão horizontal ligeiramente anterior para o cargoeriorly pino colocado (Figura 2C). Fazer uma outra incisão semelhante ligeiramente posterior ao pino colocado anteriormente (Figura 2C). As incisões deve apenas passar através da cutícula.
NOTA: As três incisões de passos 1.1.7 e 1.1.8 combinados deve assemelhar-se um "
"Quando concluído, ou seja, uma aba esquerda e da direita à mão no lado dorsal do corpo larval deve ser produzido. - Limpe cuidadosamente os órgãos internos com a pinça. Adicionando algumas gotas contundentes de PBS vai ajudar a substituir os órgãos fora do corpo larval, tornando assim mais fácil para removê-los. Evite cutucando o corpo larval como ele irá causar danos aos músculos da parede do corpo.
- Desfraldar o corpo larval aberto e fixam os cantos para baixo (Figura 2D). Quando fixando, esticar a parede do corpo, tanto horizontal como verticalmente para formar um rectângulo uniformemente-tensionada (SEe Figura 2G para a forma), tomando cuidado para não rasgar os músculos da parede do corpo no processo.
- Terminar de remover qualquer restantes órgãos internos (Figura 2E).
- Fixação e permeabilização
- Mergulhe as paredes do corpo preso em várias gotas de solução de Bouin. Incubar por 15 min no gelo. Alternativamente, usar 4% de paraformaldeído (PFA) como um fixador alternativo; incube durante 30 min.
- Lavar três vezes com tampão fosfato salina com Triton (PBT).
- Usando uma pinça fina, retire cuidadosamente os pinos e transferir as paredes do corpo por seus cantos em um siliconized 0,65 ml tubo de microcentrífuga.
- Armazenar as paredes do corpo em PBT a 4 ° C até estar pronto para o PLA. Para melhores resultados, comece imunocolora�o as paredes do corpo dentro de um ou dois dias de dissecção.
NOTA: Para economizar nos reagentes e para assegurar que todas as paredes do corpo são tratados da mesma forma durante o ensaio, diferentes genótipos podem ser colocados em uma únicatubo. Os genótipos podem ser distinguidos através do corte dos cantos das paredes do corpo de forma diferente (ver Figura 2F para exemplos).
2. A imuno-histoquímica
NOTA: A imunocoloração de terceiro estádio larvar paredes do corpo foi realizada como previamente descrito em Brent et al 14 e Ramachandran e Budnik 11, mas com algumas modificações 11,14..
NOTA: Execute todas as etapas à temperatura ambiente e com agitação suave, salvo indicação contrária.
- Bloqueio
- Lavam-se as paredes do corpo com PBT três vezes durante 10 minutos cada.
- Bloquear com 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) durante 1 h.
- Immunostaining
- Incubar as paredes do corpo com anticorpos de ratinho e de coelho primárias contra as duas proteínas de interesse (diluídos em 1% de BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. Neste caso, usar 1:10 rato anti-Dlg e 1: 250 de um coelhonti-HtsM 15,16. Os anticorpos contra os marcadores que não são feitos em rato ou coelho também podem ser incluídos - por exemplo, usar 1: 200 de cabra anti-HRP para delinear as membranas neuronais.
- Lavar três vezes com PBT durante 10 min cada.
- Incubar com anticorpos secundários conjugados com um fluoróforo para detectar os marcadores (diluídos em 1% de BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. Como o sinal de PLA é depois visualizada com um fluoróforo vermelho, outro fluoróforo deve ser usada para detectar o marcador - por exemplo, usar 1: 200 conjugado com FITC anti-cabra para detectar o anticorpo de cabra anti-HRP. Devido ao uso de reagentes sensíveis à luz, manter os tubos no escuro a partir deste ponto.
NOTA: O kit que é usado para PLA permite a ser realizada entre os anticorpos primários desenvolvidos no rato e coelho, com o sinal visualizado no canal vermelho sob microscopia confocal. Se desejado, outros kits disponíveis que permitem o ensaio deve ser feito com primary anticorpos desenvolvidos em outras espécies, e o sinal visualizado em outros canais.
3. Proximidade Ligation Assay
NOTA: Execute todas as etapas à temperatura ambiente e com agitação suave, salvo indicação contrária.
- PLA Sondas
- Lavam-se as paredes do corpo com PBT três vezes durante 10 minutos cada.
- Incubar com sondas PLA (1: 5 de cada diluição em 1% de BSA) durante 2 horas a 37 ° C. Neste caso, usar 40 ul de sonda de PLA anti-ratinho MENOS, 40 ul de sonda de PLA anti-coelho PLUS e 120 ul de BSA a 1% para assegurar a imersão adequada e mistura de 5-10 paredes do corpo. Até uma diluição das sondas PLA 01:25 ainda pode resultar em uma proporção adequada de sinal-para-ruído (isto é, para esta experiência).
- Ligadura
- Lave as paredes do corpo com Wash Buffer A duas vezes por 5 min cada.
- Incubar com solução Ligadura (diluição 1:40 de ligase em tampão de ligação) durante 1 hora umat 37 ° C. Neste caso, utilizar 5 ul de ligase, 40 ul de tampão de 5 ligadura e 155 ul de água de pureza elevada para assegurar a imersão adequada e mistura de 5-10 paredes do corpo.
- Amplificação
- Lave as paredes do corpo com Wash Buffer A duas vezes para 2 min cada.
- Incubar com solução Amplificação (diluição 1:80 em tampão de polimerase da amplificação) durante 2 horas a 37 ° C. Neste caso, usar 2,5 ul de polimerase, 40 ul de tampão de 5 Amplificação e 157,5 uL de água de pureza elevada para assegurar a imersão adequada e mistura de 5-10 paredes do corpo.
- Preparação para criação de imagens
- Lave as paredes do corpo com tampão de lavagem B duas vezes por 10 min cada.
- Lavar com 0.01x Wash Buffer B uma vez para 1 min.
- Equilibrar com algumas gotas de solução de montagem para, pelo menos, 30 min antes da montagem, ou armazenar durante a noite a 4 ° C.
- Usando uma pinça fina, transferir cuidadosamente as paredes do corpo sobre uma lâmina de plataforma wom suas cutículas voltado para baixo. Posicione as paredes do corpo em fileiras e com a mesma orientação dentro de uma gota ou duas de montagem. Coloque uma 22 mm x 40 milímetros lamela sobre a preparação tomando cuidado para não gerar bolhas de ar, em seguida, selar o slide com unhas polonês claro.
- Guarde os slides no escuro a -20 ° C até que esteja pronto para a imagem latente confocal.
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Resultados
Em selvagens terceiro estádio NMJs larvais, Dlg é predominantemente encontrado na membrana pós-sináptica de tipo I boutons glutamatérgicos, com níveis de imunorreatividade Dlg sendo mais pronunciada na boutons tipo Ib que o tipo é boutons (Figura 3A) 4. Hts está presente em todo o músculo, mas concentra-se na região pós-sináptica com Hts níveis imunorreatividade aparecendo igual em ambos os tipos I boutons, e também é encontrada pré-sináptico (Figura 3A ') 8,17. No...
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Discussão
Este relatório demonstra como PLA pode ser aplicado para a Drosophila larval JNM. O ensaio é realizado em preparações de músculo da parede do corpo de larvas para a finalidade de detecção de interacções proteína-proteína endógenos presentes na NMJ. Com esta técnica, Dlg e Hts mostram-se em estreita proximidade uns dos outros, e assim existir em um complexo, especialmente na região pós-sináptica 27. Em apoio a esse resultado, um estudo anterior tenha apresentado provas de sua associação com os seguint...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Bloomington Drosophila da Center for fornecendo stocks de voar. Agradecemos também a estudos de desenvolvimento Hybridoma Banco e Dr. Lynn Cooley (Yale University) para a prestação de anticorpos. Um agradecimento especial vai para AhHyun Yoo por sua ajuda no manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações de Ciências Naturais e Engenharia Research Council of Canada (Krieger), o William e Ada Fundo Aço Isabelle (Krieger), e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (Harden).
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Materiais
2
Tesoura de Microdissecação de Plataforma Fine Science Tools 15200-00 Cole duas lamínulas de 22 x 22 mm em uma lâmina de microscópio com esmalte transparente, deixando um <
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fórceps (fino #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Misture a base de elastômero e o agente de cura na proporção de 10:1. Defina por 30 min. Despeje em um molde (por exemplo use uma placa de cultura de células de 12 poços). Deixe curar por pelo menos 24 horas. Cole a tampa de uma tampa de placa de Petri de 60 x 15 mm ao dissecar. |
| Pins Minutien (0.0125 mm de diâmetro) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| (ultrafina) | Lâminas | ||
| Folga de 20 mm entre elas para montagem de amostras. | |||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | O estoque foi rebalanceado em um balanceador GFP para que mutantes homozigotos possam ser selecionados com base na ausência de sinal GFP. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7,0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Solução de Bouin | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldeído): 4% PFA em 1x PBS | PFA (Ciência da Anachemia - 66194-300). Consulte doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 para obter instruções sobre como fazer a solução. | ||
| [header] | |||
| 1x PBT (solução salina tamponada com fosfato com Triton): 1x PBS com 0,01% de Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (albumina de soro bovino): 1% BSA em 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Armazene a 4 ° C. | ||
| camundongo anti-Dlg (Discos grandes) | Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma | 4F3 | Use em uma diluição de 1:10 em 1% BSA. |
| coelho anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Fornecido pela Dra. Lynn Cooley (Universidade de Yale). Use em uma diluição de 1:250 em 1% BSA. | ||
| coelho anti-Pak (quinase ativada por p21) | Fornecido pelo Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use em uma diluição de 1:500 em 1% BSA. | ||
| camundongo anti-Wg (sem asas) | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | 4D4 | Use em uma diluição de 1:5 em 1% BSA. |
| anti-Hrp de cabra (peroxidase de rábano) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use em uma diluição de 1:200 em 1% BSA. |
| Burro conjugado com FITC anti-cabra | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use em uma diluição de 1:200 em 1% BSA. |
| Sonda PLA In Situ Duolink anti-mouse MENOS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Sonda PLA Duolink In Situ anti-coelho PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Reagentes de Detecção In Situ Duolink Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Tampão de Lavagem A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Tampão de Lavagem B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Tampão de Lavagem B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7,5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink Meio de Montagem In Situ com DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
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Reimpressões e permissões
