Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling

Resumo

A sinalização de quimiocinas provoca alterações marcantes na morfologia celular e algumas redistribuições importantes de proteínas intracelulares. Aqui, um protocolo rápido e detalhado é fornecido para estudar esses eventos.

Resumo

As células respondem a quimioquinas estimulação por perder a sua forma redonda num processo chamado de polarização, e alterando a localização subcelular de muitas proteínas. Técnicas de imagem clássicos têm sido usados ​​para estudar esses fenômenos. No entanto, eles requerida a aquisição Manual de muitas células seguido de quantificação demorado da morfologia e a co-localização da coloração de dezenas de células. Aqui, um método rápido e eficaz é descrito para estudar estes fenómenos em amostras que consistem em vários milhares de células, utilizando um fluxo de imagens de citometria tecnologia que combina as vantagens de um microscópio com as de um citómetro. Usando os linfócitos T estimulados com CCL19 e coloração para moléculas de MHC de Classe I e a actina filamentosa, uma estratégia de propagação é apresentada para medir simultaneamente o grau de alterações de forma e a dimensão da co-localização de marcadores que são afectadas pela sinalização CCL19. Além disso, esta estratégia gating nos permitiu observoe a segregação de actina filamentosa (na frente) e fosforilada proteínas Ezrin-radixina-moesin (fosfo-ERM) (na parte traseira) em células T polarizadas após a estimulação CXCL12. Esta técnica também foi útil para observar o efeito de bloqueio em polarização de dois elementos diferentes: a inibição da polimerização da actina por um inibidor farmacológico e expressão de mutantes do Par6 / atípica via de sinalização PKC. Assim, a prova é mostrado que esta técnica é útil para analisar as duas alterações morfológicas e redistribuições de proteína.

Introdução

As quimiocinas são proteínas solúveis pequenos que atraem as células para locais especializados ^1. Portanto, eles participam do posicionamento correto de células em tecidos, uma função crucial no desenvolvimento e fisiologia. O sistema imunológico não é excepção a esta regra, uma vez que conta com a ação de muitos tipos diferentes de células que agem em conjunto para montar uma resposta imune eficaz. Ao controlar o local específico de um tipo de célula imune em um determinado estado, as quimiocinas são pré-requerida antes de antigénios estranhos pode ser detectada e neutralizada.

Para os linfócitos T, em particular, as quimiocinas se ligam a receptores específicos da superfície que, mediante acoplamento, provocam diversos sinais intracelulares (subida de cálcio, de fosforilação de ERK, activação as Rho GTPases, aumento da afinidade e integrinas alterações do citoesqueleto), que favorecem a motilidade de células T ^2,3. Ao nível celular, pode-se observar alterações morfológicas induzidas por estimulação de quimiocinas.Essas mudanças nas formas celulares são especialmente dramática nas células T: células T em repouso têm uma morfologia Conta redonda semelhante ao viajar na corrente sanguínea. No entanto, a detecção da presença de quimiocinas em locais inflamatórios ou na proximidade dos órgãos linfóides vai alterar a forma das células T, que agora adoptar um típico "mão-espelho" morfologia que consiste de uma forma bipolar: um bordo de ataque na frente e um bordo de fuga, ou uropod, na parte de trás ^4. Além disso, os componentes intracelulares pode separar em duas regiões opostas de uma célula T polarizada para sustentar a migração. Por exemplo, aumentos de filamentos de actina mediante polimerização de quimiocina estimulação ⁵ actina polimerizada e acumula-se na parte da frente de uma célula T polarizada ^2. Por outro lado, diversas proteínas, tais como proteínas fosforiladas da família Ezrin-radixina-moesina (ERM) que ligam a membrana plasmática para o citoesqueleto de actina F cortical, re-localizar no uropod de polarizadaAs células T ^6. Curiosamente, e outros mostraram que este processo de polarização é necessária para a migração de células T. Com efeito, qualquer tratamento que interfere com polarização irá inibir a motilidade celular. Por exemplo, a inibição da actividade dos membros da proteína atípica quinases C (PKC) da família, e PKCζ PKCι blocos t polarização celular e seu processo de digitalização migratório das células dendríticas ^7. T polarização celular também é regulada por GTPases Rho. Mostrámos que a modulação da actividade da proteína RhoA por Fam65b recentemente descrito interfere com mudanças na morfologia das células T e a sua capacidade para migrar em um ensaio Transwell ^6. Como polarização é um passo de pré-requisito para a motilidade celular, é, portanto, essencial para ser capaz de quantificar, como um visor principal de respostas de quimiocina. Alterações forma da célula foram previamente avaliados manualmente ^8. No entanto, este tipo de quantificação é muito demorado, de modo que normalmente apenas algunsdezenas de células são tomadas em consideração.

Aqui, um novo método é apresentado para quantificar rapidamente o grau de alterações de forma dos linfócitos T expostos ao estímulo de quimiocina. Um fluxo de citometria de tecnologia de imagem (ver Tabela de Reagentes Específico / Equipamento) é utilizada, a qual combina as vantagens de um citómetro de fluxo e um microscópio ⁹ para quantificar eficazmente a quantidade de células polarizadas em diferentes condições de estimulação de quimiocina. Para além da quantificação das alterações morfológicas que se pode medir de forma robusta com esta tecnologia, é também possível avaliar as alterações na localização subcelular de algumas proteínas mediante a sinalização da quimiocina.

Protocolo

1. Preparação de Linfócitos T

1. Prepare primário do rato ou células T humanas, como descrito ^10,11.
2. Cultivar células T humanas em meio RPMI completo com 10% de soro humano AB a uma densidade de 2 - 3 x 10 ⁶ células / ml.
   NOTA: A utilização de soro fetal de vitelo (FCS) em vez de soro humano podem induzir a polarização espontânea de uma grande fracção de células T humanas em cultura. Manter essas células em cultura por 4-5 dias, e outro processo-los a qualquer momento durante esse período.
3. Manter as células T de rato em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS a uma densidade celular semelhante. Utilizar imediatamente ou no dia seguinte, depois de uma cultura D / N a 37 ° C na presença de 10 ng / ml IL7.
4. Cultivar a linha de células T humanas CEM em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS.

2. Chemokine Estimulação

1. Lave 5 x 10 ⁵ células por condição experimental em meio morno HBSS suplementado com 10 mM Hepes. Para algumas experiências, a co-transfecção de células T humanas primárias no dia anterior com 2 ug pmaxGFP e 8 ug pcDNA3.1 ⁺ (vector vazio, o controlo), PKCζ cinase morta, ou plasmídeos Par6 N-terminais.
2. Ressuspender o sedimento de células em meio HBSS morno-Hepes (0,3 ml usar x número de condições experimentais).
3. Distribuir as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Portanto, um tubo que corresponde a uma condição experimental único irá conter 5 x 10 ⁵ células em 0,3 mL de meio HBSS-Hepes. Para algumas experiências, adicionar 500 nM Latrunculin A ou veículo (DMSO) e incubar as células durante 30 minutos antes da estimulação de quimiocina.
4. Adiciona-se 10 a 500 ng / ml ou CCL19 quimiocina CXCL12 em cada tubo.
   NOTA: Normalmente, usamos 10-200 quimocina ng / ml para células T humanas. As células CEM não expressam o receptor CCR7 que se liga CCL19. Portanto, células CEM apenas será capaz de responder a um estímulo CXCL12. Além disso, usar concentrações mais elevadas de quimiocinas (300-500 ng / ml) para polarizar as células T do mouse.
5. Virar os tubos várias vezes e incubar num banho de água a 37 C para 8 ° ou 10 min para as células T primárias ou CEM, respectivamente.
6. Parar o processo de polarização através da adição a cada tubo 0,3 ml de uma solução quente contendo 2% de paraformaldeído (PFA) e Hepes 10 mM em PBS. Virar os tubos e incubá-las a 37 ° C durante 5 min.

3. colorações

1. Transferem-se as células a partir dos tubos de microcentrífuga para tubos de citometria de fluxo.
2. Encher os tubos com uma solução completamente RT contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), EDTA 0,5 mM e Hepes 10 mM em PBS.
3. Centrifugar os tubos a 460 xg por 4 min.
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 ul de uma solução contendo RT 5% de FCS em PBS.
5. Adicionar 5 uL de FITC-anti-HLA-ABC, em cada tubo, eles vórtice, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, longe da luz.
6. Lave as células uma vez com PBS contendo 5% de FCS, umnd uma vez com apenas PBS.
7. À RT: adicionar 500 uL de 1% de PFA, incubar durante 10 min, em seguida, lavar as células com uma solução contendo 1% de BSA, EDTA 0,5 mM e HEPES 10 mM em PBS.
8. Rejeitar o sobrenadante, preencher completamente os tubos com uma solução de PBS contendo 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM e Hepes 10 mM (tampão de permeabilização).
9. Lavar as células duas vezes neste meio.
10. Virar os tubos para remover o meio e vortex-los para dissociar o sedimento celular.
11. Adicionar 0,25 g / ml TRITC-faloidina e / ou uma diluição 1: 100 de anticorpo anti-P-MTC a cada tubo, eles vórtice e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
12. Lavar as células com o tampão de permeabilização. Incubar com anticorpo secundário fluorescente, se necessário.
13. Ressuspender as células em 200 ul de PBS e transferi-las para tubos de microcentrífuga.
    NOTA: As células estão prontos para a aquisição. Alternativamente, ao mesmo tempo mantendo um volume máximo total de 200 ul por tubo, adicionar PFA concentrada para um final de 1%concentração, a fim de preservar as colorações se as células não estão a ser usados ​​no mesmo dia para processamento adicional.

4. Imagens de Aquisição e Análise

1. Ligue o aparelho (ver Tabela de Specific Reagentes / Equipment) e deixá-lo calibrar-se de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: O software INSPIRE foi usado com uma objetiva de 40X (0,75 NA). O software IDEIAS 3.0 foi utilizado para todas as quantificações relatados.
2. Preparar uma série de janelas de aquisição que podem ser salvos em um modelo para futuras experiências. Empate histogramas que quantifiquem os valores de gradiente RMS. Da população "In Focus", selecionado no RMS histograma degradê, delimitar a população "célula Single" em um histograma da Area. Uma vez que o tubo de microcentrifugadora foi inserido na máquina, ajustar a potência do laser, portão em células individuais e adquirir 5.000 linfócitos T.
3. Nos Idéias suavesware, abra o arquivo de aquisição e criar um histograma que irá mostrar o valor do valor RMS gradiente de campo para imagens brilhantes (Canal 1) obtidos para cada célula individual. Desenhe um portão no histograma gradiente RMS que considera células exibindo RMS valor inclinação acima de 57.
   NOTA: O gradiente RMS permite ter em conta na análise apenas os linfócitos T que se encontram no plano focal. Determinou-se empiricamente que as células individuais que exibem um valor de gradiente de RMS são superiores a 57 no plano focal, e pode ser considerado com precisão.
4. No menu Análise / Máscaras, criar uma nova máscara, chamado Erode (M01,2) da máscara de morfologia nas imagens brightfield M01, erodidas de 2 pixels. Em seguida, na Análise / menu Recursos, crie um novo recurso do Espaço, calculado sobre a máscara Erode (M01,2). A partir das células selecionadas na porta anterior, abra um histograma mostrando a área de células usando essa máscara recém-criado.
   Máscaras a morfologia que estão disponíveis por: NOTAdefault são muito maiores do que o tamanho real da célula. Assim, é mais preciso que a corroer-se a 2 pixels.
5. Desenhe um portão nas células T individuais, excluindo as contas de calibração e detritos (pequena área) e as dobletos (grande área). Ajuste este portão em cada aquisição.
   NOTA: As variações no tamanho das células irá afectar a posição da porta. Como células T de rato são menores do que as células T humanas que são eles próprios menores que as células CEM, a área de cada tipo de célula será proporcional ao seu tamanho.
6. Considerando-se as células, em foco individuais que foram fechados com os passos anteriores, abrir um gráfico de pontos que consiste em bruto o pixel máximo na coloração de HLA-ABC (canal 2, o eixo x) em função do pixel em bruto Max a faloidina coloração (Channel 4, o eixo y). Criar um portão para excluir os eventos fluorescentes não coradas ou saturadas. Abra duas histogramas mostram a Raw Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) e phalloidin (Channel 4) colorações.
7. Na Análise / menu de Máscaras, createA nova máscara, chamado Erode (M02,2) da máscara morfologia das células HLA-ABC coradas (Canal 2), erodidas de 2 pixels. Em seguida, na Análise / menu Funções, criar uma nova característica que consiste no parâmetro circularidade, calculado sobre o Corrmoa (M02,2).
   NOTA: Este parâmetro mede o desvio da forma da célula a partir de um círculo. Portanto, uma célula T perfeitamente redonda terá um valor alto circularidade enquanto que as células polarizadas alongadas irá apresentar um baixo índice de circularidade.
8. Subsequentemente, criar um outro histograma que irá reportar os valores da característica circularidade das células previamente fechadas. Utilizar esta histograma para traçar directamente a distribuição de um indivíduo, a população de células em foco de acordo com o valor da circularidade para cada célula individual.
9. Olhando para o formato do histograma para células não estimuladas, para desenhar um portão células polarizadas, começando no valor circularidade mais baixo até ao valor limite circularidade onde a maioria das células não estimuladassão traçados. Olhe para a exibição de estatísticas para a percentagem de células polarizadas entre a população fechado (% fechado).
   NOTA: Criámos esta porta para valores de índice Circularidade abaixo 13.
10. De forma a olhar para a polarização da coloração de actina nas células, para traçar um histograma do detalhe brilhante valor Similaridade R3, comparando a coloração de HLA-ABC (canal 2) e a coloração com faloidina (Canal 4).
    NOTA: Quanto maior o valor desse recurso, o mais sobrepor as duas colorações são.
11. Utilizando a mesma estratégia gating como antes, traçar uma porta em que as células não-estimuladas para a coloração segregada que mostra a percentagem de células com coloração de actina polarizada.
12. Quando concluída, a percentagem de células que manifestam uma segregação na distribuição do MHC de Classe I e colorações faloidina, a percentagem de células polarizadas em conjunto com os valores médios dos índices Circularidade e similaridade de todas as células ± desvio padrão são mostrados na correspEstatísticas onding painéis.

Resultados

O primeiro exemplo aqui escolhido se refere à utilização de linfócitos T primárias humanas estimuladas com CCL19. No entanto, a mesma estratégia pode ser usada com células T de rato primário, linhas de células T ou qualquer outro tipo de células responsivas à estimulação da quimiocina. A estratégia de gating aqui apresentado inclui uma série de janelas que selecionam os eventos temáticos, em seguida, as células individuais. Finalmente, o intervalo de intensidade de fluorescência é seguido aqui como um exemplo de dois ma...

Discussão

Usando uma tecnologia recente de citometria de fluxo de imagem, uma estratégia de propagação rápida e informativo para analisar eventos celulares e moleculares induzidos por estimulação de quimiocina é apresentado. A partir de uma única experiência, pode obter-se dois tipos principais de informação: as alterações na morfologia celular induzida por estimulação de quimiocina e a distribuição subcelular de proteínas diferentes durante o processo de polarização. Curiosamente, os dados também é fornecida para a possibilidade...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI	Gibco	61870-010
Soro humano AB	PAA	C11-021	Pré-aqueça para inativar o complemento.
Soro fetal de bezerro	PAN Biotech	P30-3300	Pré-aqueça para inativar o complemento.
Kit de nucleofator de células T humanas	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	As alíquotas são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células.
humanas CCL19	Peprotech	300-29B	são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células.
humanas CXCL12	Peprotech	300-28A	são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células. Esta quimiocina também pode ser usada em células T de camundongo.
Ciências de Microscopia Eletrônica	PFA	157-8-100	Esta é uma solução de PFA a 8% em água. Misture volume a volume com 2x PBS para obter uma solução de PFA a 4% em PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponina	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 faloidina	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC anticorpo	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM anticorpo	Tecnologia de sinalização celular	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis