Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling

Resumo

A sinalização de quimiocinas provoca alterações marcantes na morfologia celular e algumas redistribuições importantes de proteínas intracelulares. Aqui, um protocolo rápido e detalhado é fornecido para estudar esses eventos.

Resumo

As células respondem a quimioquinas estimulação por perder a sua forma redonda num processo chamado de polarização, e alterando a localização subcelular de muitas proteínas. Técnicas de imagem clássicos têm sido usados ​​para estudar esses fenômenos. No entanto, eles requerida a aquisição Manual de muitas células seguido de quantificação demorado da morfologia e a co-localização da coloração de dezenas de células. Aqui, um método rápido e eficaz é descrito para estudar estes fenómenos em amostras que consistem em vários milhares de células, utilizando um fluxo de imagens de citometria tecnologia que combina as vantagens de um microscópio com as de um citómetro. Usando os linfócitos T estimulados com CCL19 e coloração para moléculas de MHC de Classe I e a actina filamentosa, uma estratégia de propagação é apresentada para medir simultaneamente o grau de alterações de forma e a dimensão da co-localização de marcadores que são afectadas pela sinalização CCL19. Além disso, esta estratégia gating nos permitiu observoe a segregação de actina filamentosa (na frente) e fosforilada proteínas Ezrin-radixina-moesin (fosfo-ERM) (na parte traseira) em células T polarizadas após a estimulação CXCL12. Esta técnica também foi útil para observar o efeito de bloqueio em polarização de dois elementos diferentes: a inibição da polimerização da actina por um inibidor farmacológico e expressão de mutantes do Par6 / atípica via de sinalização PKC. Assim, a prova é mostrado que esta técnica é útil para analisar as duas alterações morfológicas e redistribuições de proteína.

Introdução

As quimiocinas são proteínas solúveis pequenos que atraem as células para locais especializados ^1. Portanto, eles participam do posicionamento correto de células em tecidos, uma função crucial no desenvolvimento e fisiologia. O sistema imunológico não é excepção a esta regra, uma vez que conta com a ação de muitos tipos diferentes de células que agem em conjunto para montar uma resposta imune eficaz. Ao controlar o local específico de um tipo de célula imune em um determinado estado, as quimiocinas são pré-requerida antes de antigénios estranhos pode ser detectada e neutralizada.

Para os linfócitos T, em particular, as quimioci....

Protocolo

1. Preparação de Linfócitos T

1. Prepare primário do rato ou células T humanas, como descrito ^10,11.
2. Cultivar células T humanas em meio RPMI completo com 10% de soro humano AB a uma densidade de 2 - 3 x 10 ⁶ células / ml.
   NOTA: A utilização de soro fetal de vitelo (FCS) em vez de soro humano podem induzir a polarização espontânea de uma grande fracção de células T humanas em cultura. Manter essas células em cultura por 4-5 dias, e outro processo-los a qualquer momento durante esse período.
3. Manter as células T de rato em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS a uma densidade celular semelhante. Utilizar i....

Resultados

O primeiro exemplo aqui escolhido se refere à utilização de linfócitos T primárias humanas estimuladas com CCL19. No entanto, a mesma estratégia pode ser usada com células T de rato primário, linhas de células T ou qualquer outro tipo de células responsivas à estimulação da quimiocina. A estratégia de gating aqui apresentado inclui uma série de janelas que selecionam os eventos temáticos, em seguida, as células individuais. Finalmente, o intervalo de intensidade de fluorescência é seguido aqui como um exemplo de dois ma.......

Discussão

Usando uma tecnologia recente de citometria de fluxo de imagem, uma estratégia de propagação rápida e informativo para analisar eventos celulares e moleculares induzidos por estimulação de quimiocina é apresentado. A partir de uma única experiência, pode obter-se dois tipos principais de informação: as alterações na morfologia celular induzida por estimulação de quimiocina e a distribuição subcelular de proteínas diferentes durante o processo de polarização. Curiosamente, os dados também é fornecida para a possibilidade.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI	Gibco	61870-010
Soro humano AB	PAA	C11-021	Pré-aqueça para inativar o complemento.
Soro fetal de bezerro	PAN Biotech	P30-3300	Pré-aqueça para inativar o complemento.
Kit de nucleofator de células T humanas	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	As alíquotas são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células.
humanas CCL19	Peprotech	300-29B	são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células.
humanas CXCL12	Peprotech	300-28A	são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células. Esta quimiocina também pode ser usada em células T de camundongo.
Ciências de Microscopia Eletrônica	PFA	157-8-100	Esta é uma solução de PFA a 8% em água. Misture volume a volume com 2x PBS para obter uma solução de PFA a 4% em PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponina	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 faloidina	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC anticorpo	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM anticorpo	Tecnologia de sinalização celular	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis

As alíquotas As alíquotas