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Artigo de método

Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de Wnt5a Faz com cistos no peixe-zebra Rins

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DOI:

10.3791/52156

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2 de dezembro de 2014

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1Department of Medicine, Eastern Virginia Medical School, 2Department of Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Pediatrics, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método de geração de um possível modelo de peixe-zebra de doença renal policística. Usamos peixes Tg(wt1b:GFP) para visualizar a estrutura renal. O knockdown de wnt5a foi por injeção de morfolino. A formação de cistos pronéfricos após o knockdown de wnt5a foi observada neste peixe-zebra transgênico GFP.

Resumo

A doença renal policística (PKD) é uma das causas mais comuns de doença renal terminal, uma doença devastadora para a qual não há cura. Os mecanismos moleculares que levam à formação de cistos na PKD permanecem um tanto obscuros, mas acredita-se que muitos genes estejam envolvidos. Wnt5a é uma glicoproteína não canônica que regula uma ampla gama de processos de desenvolvimento. Wnt5a funciona através da via de polaridade celular planar (PCP) que regula a divisão celular orientada durante o alongamento das células tubulares renais. Descobriu-se que defeitos da via PCP causam a formação de cistos renais. Nosso artigo descreve um método para desenvolver um modelo de doença renal cística de peixe-zebra por knockdown do gene wnt5a com oligonucleotídeos wnt5a antisense morfolino (MO). O peixe-zebra transgênico Tg(wt1b:GFP) foi usado para visualizar a estrutura renal e os cistos renais após o knockdown de wnt5a. Dois MOs antisense distintos (AUG - e splice-site) foram usados e ambos resultaram em fenótipo de cauda encaracolada e formação de cistos após o knockdown de wnt5a. A injeção de mRNA Wnt5a de camundongo, resistente aos MOs devido a uma diferença na estrutura do par de bases primárias, resgatou o fenótipo anormal, demonstrando que o fenótipo não foi devido a efeitos "fora do alvo" do morfolino. Este trabalho apóia a validade do uso de um modelo de peixe-zebra para estudar a função wnt5a no rim.

Introdução

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos 1 larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval 2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente simples quando comparado com os metanefros de mamífero, o terceiro e último rim para desenvolver em mamíferos. O néfron é a unidade de trabalho do rim, com cada rim humano que contenham entre 500,000-1,000,000 néfrons 3,4 e cada rim do rato tendo aproximadamente 13.000 néfrons 5, o que torna difícil observar a estrutura de néfrons único in rins humanos ou do mouse. O peixe-zebra tem apenas dois nefrónios, cada nefrónio peixe-zebra e contém todos os componentes principais encontrados nos glomérulos e túbulos de ratos e seres humanos 6 e tipos de células renais especializadas semelhantes. Comparado a outros modelos de vertebrados, como Xenopus, o néfron zebrafish mais se assemelha a de néfrons mamíferos porque tem um sistema fechado 7.

Nos últimos anos, o genoma do peixe-zebra foi sequenciado, permitindo a ampla introdução de ferramentas genéticas, amplos recursos mutantes, e coleções de linhas repórter transgênicos em modelos de peixe-zebra. Os peixes-zebra pronephros formas entre 12-72 h pós fertilização (hpf) e podem ser facilmente visualizados em embriões transparentes. Proteína tumor do Wilm WT1 é um fator essencial para o desenvolvimento do rim. Linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostram GFP expression especificamente localizados em regiões pronephric em embriões de peixe-zebra, a partir de 17 hpf 8. Nephronophthisis (NPHP), uma doença do rim autossómica recessiva cística, é causada por mutações de genes NPHP 9. NPHP4 knockdown por morfolino causou a formação de cistos na Tg (wt1b: GFP). Fish 10 Portanto, este peixe transgênico é um modelo adequado para a observação de estruturas renais e formação de cistos durante o desenvolvimento do rim. Importante, a influência de moduladores de desenvolvimento do rim pode ser estudada usando esta estirpe em um tempo de trabalho e modo eficiente.

Nosso trabalho descreve o uso de Tg (wt1b: GFP) de peixe como um modelo para visualizar a formação de cistos nos rins depois de modulação gene. Usamos partida e emenda local anti-sense MOs derrubar o gene Wnt5a no peixe-zebra. Wnt5a é uma glicoproteína segregada não canónicas da família Wnt, que desempenha um papel importante no desenvolvimento de vários órgãos e pós-natal celularfunção 11. Wnt5a funciona através de vias de Wnt não canónicas, incluindo a via de polaridade celular planar (PCP), que tem sido encontrado para desempenhar um papel na divisão celular orientada durante o alongamento tubular renal. Wnt5a regula a via Wnt / PCP, formando um complexo com o receptor de tirosina cinase semelhante (Ryk), que transduz mais Wnt5a sinalização através da formação de um complexo com a proteína da polaridade celular planar VANGL 2 (Vangl2), promovendo assim a estabilidade Vangl2 12. Os defeitos na via de PCP pode resultar na divisão celular aleatória e causar a formação de quistos renais. Utilizou-se o Tg (wt1b: GFP) linha peixe-zebra para observar a formação de cistos nos rins seguinte Wnt5a knockdown. A Tg (wt1b: GFP) modelo de peixe-zebra permite imagens ao vivo e observação oportuna da estrutura renal. Após Wnt5a knockdown, formação de cistos nos rins foi encontrado com início às 24 hpf; a 72 hpf, os cistos podem ser encontrados nos glomérulos e dos túbulos proximais. Este método também poderia ser usado para screen outros genes que podem causar a formação de cistos nos rins.

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Protocolo

Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School.

1. Preparação Morpholino

  1. Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1.
    NOTA: MOs são enviados como ações liofilizada em garrafas de vidro.
  2. Adicionar alto grau de água estéril para os frascos de vidro para re-suspender OMs para uma concentração final de 25 ug / uL. Certifique-se de que o oligonucleótido esteja completamente dissolvido. Se alguns restos sólidas, aquecer o frasco contendo a solução de estoque de oligonucleótido a 65 ° C durante 5 a 10 min e agitar com vortex brevemente.
  3. Guardar a solução estoque MO na RT. Não armazená-los a 4 ° C ou -20 ° C; C, porque temperaturas mais baixas, pode causar o oligonucleótido MO para se ligarem à parede do recipiente. Medir a concentração da solução-mãe usando um espectrofotómetro (consulte a tabela 1) cada vez que uma nova solução de estoque MO é feita.
  4. Preparar a solução de trabalho de MO no dia da injecção por diluição da solução de reserva com alto grau de água esterilizada para a dose desejada. Adicionar 0,5% de vermelho de fenol para atingir uma concentração de 0,05%. Por exemplo, para fazer a solução de trabalho 5 ul com uma concentração de 15 ng / nL, adicionar solução de estoque 3 ul MO e 0,5 ul de 0,5% de vermelho de fenol para 1,5 ul de água.
    NOTA: Com esta concentração de trabalho, cada gota (500 pl) de injeção contém 7,5 ng de MO e duas gotas conter 15 ng de MO.

2. Preparação do aparelho de injecção

  1. Vidro Compra agulhas pré-puxou (por favor, consulte a Tabela 1 para obter informações detalhadas). Como alternativa, puxe a agulha wi injeção de vidroth um puxador de agulha.
  2. Ligue o compressor de ar e ajuste a configuração para 50 psi de pressão. Ligue a fonte de luz microscópio de dissecação e Pico bomba de micro-injecção e ajustar as configurações da seguinte forma: segurar a pressão de 20 psi, ejetar 10 psi de pressão, valor do período de 2,5 e 100 ms gama de gating.
  3. Carregar o vidro pré-agulha puxada com 5 ul de solução de injecção e colocar a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Espere até que toda a solução atingir a ponta da agulha sem bolhas de ar visíveis. Inserir o suporte de agulha numa posição adequada ao lado do microscópio e inserir a agulha no suporte de vidro. Ajustar o ângulo de injecção de 45 graus.
  4. Traga a ponta da agulha em vista ao microscópio, de alta para fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Quebre a ponta da agulha com uma pinça de ponta fina.
  5. Coloque uma régua e um tubo capilar com diâmetro interno de 0,15 mm de lado a lado, sob o microscópio;injectar a solução em uma extremidade do tubo capilar para fazer uma coluna de líquido. Ajustar o tempo de ejecção para chegar a cada 17 gotas por 1 milímetro de comprimento da coluna de líquido, então o volume de cada gota nl é 1 (volume da gota π = raio x 2 x comprimento (coluna de líquido) / contagem (de gotas).
    NOTA: Uma gota com um diâmetro de 0,1 mm dá um volume de injecção de cerca de 500 pl (volume da gota = 4/3 x π raio x 3).

3. Preparação de Fertilized embriões Zebrafish e injeção com Morpholinos

  1. Configure Tg (wt1b: GFP) casais reprodutores de peixes-zebra transgénicos acordo com protocolos publicados para criação de peixe-zebra padrão e manutenção. Coletar embriões após desova natural, e mantê-los em uma placa de Petri 10 centímetros cheia de água E3 (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Comece injeção MO imediatamente 13. Monitorar morfologia do embrião sob o microscópio e certifique-se de injeção MO está no um-estágio de célula, ou o mais tardar no estágio de quatro células.
    1. Transferir os embriões para a placa de Petri 10 centímetros com cunha em forma de agar calhas. Aspirar a água E3 extra e pressione suavemente os embriões nas calhas.
    2. Manipular os embriões com a micropipeta para visualizar embriões em estágio 1 de células ao microscópio de dissecação. Penetrar no cório e, em seguida, a gema para injectar uma ou duas gotas de MO na gema (1 gota = 500 pl). Transferir os embriões injectados com 10 cm de placa de Petri com água E3 e incubar a 28,5 ° C.
  2. Após as injeções, remover os embriões mortos e registrar o número de embriões injetados. Substitua a água E3 no prato a cada 24-48 horas.

4. Experimentos Fenótipo de resgate

  1. Selecione uma orthologue de outra espécie que tem uma estrutura de pares de bases principal diferente (geralmente 3-7 descasamentos de pares de bases) e é, portanto, resistentes à MO, para o salvamento. Por exemplo, neste experimento, escolhemosrato, porque a sequência de ratinho Wnt5a ARNm é diferente da sequência de peixe-zebra.
  2. Conceber um conjunto de iniciadores com o iniciador directo de partida no local da translação e o iniciador reverso de perto para o fim da região de codificação do ARNm. Adicionar uma sequência do promotor de T7 na extremidade 5 'da sequência iniciadora para a frente. Neste experimento, foram utilizadas as seguintes as seqüências de primers; para a frente: 5'- taa tac GAC TCA tag cta gga cta tga tgc tgc tga AGC tga a- 3 'e inverter: 5'- TCA ctt gca GAC gta ctg gtc- 3'.
  3. Executar um 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) com o conjunto de iniciadores (0,5 uM de cada iniciador) concebido de cima e de 0,1 ug de ADN molde contendo a sequência de rato Wnt5a ADNc com o seguinte programa de PCR: 1 ciclo a 95 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 95 ° C (30 s), 58,5 ° C (30 segundos), 72 ° C (1 min); e passo de extensão final a 72 ° C durante 7 min.
  4. Depois de terminar tele de bicicleta, correr 2 l do produto da PCR em gel de agarose 1% para garantir que a banda é o tamanho certo. Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Verifique concentração de DNA com um espectrofotômetro. Armazenar o produto de PCR purificado a -20 ° C ou se utilizar directamente na tampado transcrição de ARN no passo seguinte.
  5. Sintetizar in vitro de mRNA tampado com um kit de síntese de ARN tampado acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se o ARNm em 20 ul de ARNase isenta de água e determinar a concentração. Alíquota da RNA e armazenar a -80 ° C.
  6. No dia da injecção, preparar uma solução de trabalho do mRNA com água estéril livre de RNase. Note-se que 40 pg é geralmente a dose mais elevada de ARN em que os efeitos não específicos ou tóxicos do ARN não ocorrem. Manter a solução de trabalho em gelo. Injectar o embrião com MO e, em seguida, o mRNA de resgate, ou co-injectar os dois juntos. Por exemplo, se a concentração da prepar ARNmed no passo 4.5 é de 0,6 mg / mL, adicionar 0,67 mL de ARNm (0,4 ug) de 4,33 ul de ARNase isenta de água para fazer uma concentração final de 0,08 mg / mL, seguida de uma gota (500 pl) de cada injecção contém 40 pg do ARNm. Prepare MO como descrito na etapa 3.

5. Preparação de embriões injetados para imagens fluorescentes

  1. Após incubação a 28,5 ° CO / N, adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água para impedir a melanização E3, que afecta a observação da estrutura pronephros utilizando microscopia de fluorescência. No entanto, não adicione PTU antes gastrulação, porque afeta o desenvolvimento embrionário precoce.
  2. Às 48 hpf, dechorionate manualmente os embriões com uma pinça fina. Tire fotos de 48 e 72 embriões HPF sob uma dissecção microscópio de luz.
    NOTA: Estas imagens podem ser tomadas sem anestesia.
  3. Aproximadamente 10 minutos antes da imagiologia sob o microscópio de fluorescência, anestesiar os embriões, colocando-os emuma placa de Petri contendo 10 centímetros de 160 ug / ml tamponado tricaina. Aguarde 5-10 min, e em seguida, toque levemente o peixe-zebra para confirmar que eles não se movem e, portanto, a anestesia está funcionando.
  4. Depois os embriões são anestesiados, montá-los em 3% metil celulose e orientá-los em uma posição propensa sob um microscópio de dissecação (consulte a Tabela 1).
  5. Observe a estrutura pronephros sob um microscópio de fluorescência (consulte a Tabela 1) e tirar fotos em diferentes ampliações (10x e 20x).

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Resultados

Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múltiplos, incluind...

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Discussão

Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo 14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas que se encontram...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH (DK093625 ao LH, e DK069909 e DK047757 para JHL) eo VA (Prémio de Mérito I01BX000820 para JHL). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Pack e Dr. Jie Ele, na Universidade da Pensilvânia Zebrafish Núcleo de prestação de apoio essencial.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5% Fenol-VermelhoSigmaP0290Indicador de cor para injeção
MorpholinoGenn Tools, LLC(personalizado)Personalizado projetado para o gene de interesse
Agulha pré-puxadaTritech ResearchMINJ-PPSe for necessária uma grande quantidade de agulha, você também pode comprar um extrator de agulha e preparar a agulha no laboratório
Kit T7 mMessageAmbion1344Para transcrição in vitro para fazer mRNA tampado para experimento de resgate
N-FeniltioureiaSigmaP7629Para prevenção de melanização
TricaineSigmaA5040Também chamado de etil 3-aminobenzoato, para anestesia de peixe-zebra
MetilceluloseSigmaM-0387Para posição de peixe-zebra 
Kit de Purificação PCR QIAquick Qiagen28104Para purificação de produto de PCR para síntese de RNA cap.
Mistura PromegaU1511do dNTP para a
polimeraseInvitrogen10342-053para
o espectrofotômetroThermo ScientificND-1000NanoDrop para o morpholino da medida e a concentração do RNA
Compressor de arWerther International, Inc.Panther Compact 106Fonte de ar para injeção
Bomba de microinjeção PicoWorld Precision Instruments IncPV830 Pnematic PicoPumpOutros tipos de sistema de microinjeção podem ser usados.
Micro-fabricanteWorld Precision Instruments IncMMJRDestro (MMJL para canhotos)
Suporte de agulhaWorld Precision Instruments Inc5430-ALLPara segurar agulha para micromanipulação
Dumont PinçasCirúrgicas FinasFerramentas 11253-20Para quebrar a ponta da agulha
Microscópio de dissecaçãoLeica M205C Para observação e imagem de embriões de peixe-zebra
Microscópio de fluorescênciaZeiss Axio Obserer D1m  Para imagens de peixe-zebra pronephros
Tubo capilar (ID 0,15 mm)VitroComCV1525Q-100Para medir o volume de cada gota injetada
do ADN da etiqueta do PCR do PCR

Referências

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  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
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