Descrevemos um método de geração de um possível modelo de peixe-zebra de doença renal policística. Usamos peixes Tg(wt1b:GFP) para visualizar a estrutura renal. O knockdown de wnt5a foi por injeção de morfolino. A formação de cistos pronéfricos após o knockdown de wnt5a foi observada neste peixe-zebra transgênico GFP.
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Artigo de método
Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de Wnt5a Faz com cistos no peixe-zebra Rins
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença renal policística (PKD) é uma das causas mais comuns de doença renal terminal, uma doença devastadora para a qual não há cura. Os mecanismos moleculares que levam à formação de cistos na PKD permanecem um tanto obscuros, mas acredita-se que muitos genes estejam envolvidos. Wnt5a é uma glicoproteína não canônica que regula uma ampla gama de processos de desenvolvimento. Wnt5a funciona através da via de polaridade celular planar (PCP) que regula a divisão celular orientada durante o alongamento das células tubulares renais. Descobriu-se que defeitos da via PCP causam a formação de cistos renais. Nosso artigo descreve um método para desenvolver um modelo de doença renal cística de peixe-zebra por knockdown do gene wnt5a com oligonucleotídeos wnt5a antisense morfolino (MO). O peixe-zebra transgênico Tg(wt1b:GFP) foi usado para visualizar a estrutura renal e os cistos renais após o knockdown de wnt5a. Dois MOs antisense distintos (AUG - e splice-site) foram usados e ambos resultaram em fenótipo de cauda encaracolada e formação de cistos após o knockdown de wnt5a. A injeção de mRNA Wnt5a de camundongo, resistente aos MOs devido a uma diferença na estrutura do par de bases primárias, resgatou o fenótipo anormal, demonstrando que o fenótipo não foi devido a efeitos "fora do alvo" do morfolino. Este trabalho apóia a validade do uso de um modelo de peixe-zebra para estudar a função wnt5a no rim.
Introdução
Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos 1 larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval 2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente sim....
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Protocolo
Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School.
1. Preparação Morpholino
- Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1.
NOTA: MOs são enviados como ações liofilizada em garrafas de vidro. - Adicionar alto grau de água estéril para os frascos de vidro para re-suspen....
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Resultados
Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múltiplos, incluind.......
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Discussão
Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo 14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas que se encontram.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH (DK093625 ao LH, e DK069909 e DK047757 para JHL) eo VA (Prémio de Mérito I01BX000820 para JHL). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Pack e Dr. Jie Ele, na Universidade da Pensilvânia Zebrafish Núcleo de prestação de apoio essencial.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5% Fenol-Vermelho | Sigma | P0290 | Indicador de cor para injeção |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (personalizado) | Personalizado projetado para o gene de interesse |
| Agulha pré-puxada | Tritech Research | MINJ-PP | Se for necessária uma grande quantidade de agulha, você também pode comprar um extrator de agulha e preparar a agulha no laboratório |
| Kit T7 mMessage | Ambion | 1344 | Para transcrição in vitro para fazer mRNA tampado para experimento de resgate |
| N-Feniltioureia | Sigma | P7629 | Para prevenção de melanização |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Também chamado de etil 3-aminobenzoato, para anestesia de peixe-zebra |
| Metilcelulose | Sigma | M-0387 | Para posição de peixe-zebra |
| Kit de Purificação PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | Para purificação de produto de PCR para síntese de RNA cap. |
| Mistura Promega | U1511 | do dNTP para a | |
| polimerase | Invitrogen | 10342-053 | para |
| o espectrofotômetro | Thermo Scientific | ND-1000 | NanoDrop para o morpholino da medida e a concentração do RNA |
| Compressor de ar | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Fonte de ar para injeção |
| Bomba de microinjeção Pico | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Outros tipos de sistema de microinjeção podem ser usados. |
| Micro-fabricante | World Precision Instruments Inc | MMJR | Destro (MMJL para canhotos) |
| Suporte de agulha | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | Para segurar agulha para micromanipulação |
| Dumont Pinças | Cirúrgicas Finas | Ferramentas 11253-20 | Para quebrar a ponta da agulha |
| Microscópio de dissecação | Leica M205C | Para observação e imagem de embriões de peixe-zebra | |
| Microscópio de fluorescência | Zeiss Axio Obserer D1m | Para imagens de peixe-zebra pronephros | |
| Tubo capilar (ID 0,15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | Para medir o volume de cada gota injetada |
Referências
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn
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Reimpressões e permissões
