Descrevemos um protocolo para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de fatores reprogramadas e caracterizadas baseadas em lentivirais e conversão em condições putativas de grau clínico.
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Artigo de método
Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau
Neste artigo
Resumo
Resumo
Humanos induzida células estaminais pluripotentes (hiPSCs) pode ser gerado com metodologias de reprogramação à base de lentivírus. No entanto, os traços de genes potencialmente oncogénicos restantes em regiões activamente transcritas do genoma, limitar o seu potencial para a utilização em aplicações terapêuticas humanas 1. Além disso, os antigénios não-humanos derivados de reprogramação ou a diferenciação de células estaminais em derivados terapeuticamente relevantes impede as referidas hiPSCs de ser usado num contexto clínico humano 2. Neste vídeo, apresentamos um procedimento para a reprogramação e analisar hiPSCs livre de fator livres de transgenes exógenos. Estes hiPSCs então pode ser analisado para anormalidades da expressão do gene específico do intrão contendo a lentivírus. Esta análise pode ser realizada utilizando reacção em cadeia da polimerase sensível quantitativa (PCR), que tem uma vantagem sobre as técnicas menos sensíveis anteriormente utilizada para detectar diferenças de expressão do gene 3. Conversão completa emboas práticas de fabrico clínico-grade (BPF) condições, permite relevância clínica humana. Nosso protocolo oferece um outro que os critérios de admissibilidade atuais irão se expandir e incluir caracterizados derivados baseados em hiPSC livre de fatores para aplicações terapêuticas para-humanos decorrentes hiPSCs GMP-grade, o que deverá eliminar qualquer risco de imunogenicidade devido aos antígenos não-humanos-forneceu metodologia. Este protocolo é amplamente aplicável a lentivirais reprogramado células de qualquer tipo e não fornece um método reprodutível para a conversão de células reprogramadas em condições GMP-grau.
Introdução
As células humanas adultas demonstraram ser capazes de sofrer remodelação e reprogramação epigenética, como resultado da expressão baseada em lentivírus de quatro fatores-chave de transcrição4,5. Um avanço importante no campo da reprogramação foi o uso de um único de células-tronco lentivirais excisáveis (STEMCCA), que abrigava todos os quatro fatores de transcrição de reprogramação que permitiam uma proporção estequiométrica precisa da expressão da proteína6. Além disso, quando transduzido em uma multiplicidade específica de faixas de infecção, o STEMCCA pode levar a eventos de integração genômica predominantemente únicos durante o processo de r....
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Protocolo
NOTA: Este método foi utilizado na pesquisa, publicada no incrédulo et al 10..
1. Reprogramação Adulto Human dérmica fibroblastos com STEMCCA
- Fibroblastos dérmicos humanos (adultos Descongelar HUFS), passagem 4 ou inferior, num banho de água a 37 C ° durante 2 min, tomando cuidado para não mergulhar a parte superior do frasco com água.
- Colocar a suspensão de 1 ml de fibroblastos humanos para um frasco cónico de 15 ml e colocar-se lentamente 4 ml de meio de florins padrão, pré-aquecido a 37 ° C, de uma forma gota a gota, para diluir a sulfóxido de dimetilo (DMSO) e suspender novamente as células.
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Resultados
Apresenta-se um protocolo para derivar hiPSCs livre de factor de grau clínico usando a abordagem baseada reprogramação por lentivírus STEMCCA. A Figura 1A mostra uma imagem representativa de três linhas de pré-excisada hiPSC diferentes, depois de reprogramação com a abordagem STEMCCA sobre uma camada de MEFs. A principal vantagem da abordagem de reprogramação STEMCCA reside no sucesso reprogramação consistente conseguida por vários cientistas, em diferentes grupos de pesquisa e locais. A Figura .......
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Discussão
Nós descrevemos uma metodologia de derivar hiPSCs livre de fatores e de fazê-los clinicamente relevante, convertendo essas células em condições GMP grau de diferenciação celular downstream em futuras terapêuticas humanas. Embora este protocolo é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células, optou-se por reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, devido à facilidade de extracção a partir do paciente e a sua aplicabilidade terapêutica humana personalizados. Uma vez que as limitações forem corrigidas, tanto qua.......
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Divulgações
James A. Byrne (JAB) e Agustin Vega-Crespo recebem financiamento de pesquisa da Fibrocell Science, Inc. JAB é consultor científico da Fibrocell Science, Inc. Nenhum outro autor tem interesses conflitantes a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Patrick C. Lee, Cyril Ramathal e Saravanan Karumbayaram (SK) por sua assistência na realização dos experimentos de derivação e caracterização do iPSC; Aaron Cooper pela realização dos experimentos de análise iPSC; Vittorio Sebastiano e Renee A. Reijo Pera por dirigir os esforços iniciais de reprogramação; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack e Donald B. Kohn por dirigir o estabelecimento das instalações de GMP da UCLA permitindo a conversão e caracterização de iPSCs de grau clínico; Gustavo Mostoslavsky por nos fornecer o vetor de reprogramação policistrônica STECCA. Este trabalho é baseado em uma colaboração de pesquisa com a Fibrocell Scie....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meios e reagentes | |||
| DMEM/F12 (meio basal) | Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) | 11330057 | |
| Soro bovino fetal | Invitrogen | 16000044 | |
| Meio essencial mínimo (MEM) aminoácidos não essenciais (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Descongelar a 4 &graus; C, alíquota e armazenar em − 20 ° C |
| Knockout substituição do soro | Invitrogen | 10828028 | Descongelar a 4 &graus; C, alíquota e armazenar em − 20 ° C |
| Tripsina/EDTA, 0,5% | Invitrogen | 15400-054 | Diluir o estoque até 0,05% em 1x PBS |
| Fator básico de crescimento de fibroblastos | GlobalStem (Rockville, MD, EUA) | GSR-2001 | Reconstituir para 10 µ g/ml de estoque em 0,1% de albumina de soro bovino dissolvido em 1x PBS e armazenar em − 80 &graus; C |
| β-mercaptoetanol | Millipore (Billerica, MA, EUA) | ES-007-E | |
| Matrigel (matriz de membrana basal) | BD Biosciences (San Jose, CA, EUA) | 356231 | Dilua o frasco de Matrigel com 10 ml de DMEM/F12 enquanto estiver em gelo para uma diluição de 1:2. Alíquota e loja em − 20 °C. |
| CELLstart (Substrato Sintético) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, EUA) | 04-0012-02 | |
| Puromicina | Invitrogen | A1113802 | |
| Sondas LightCycler 480 Master | Roche (Basileia, Suíça) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Médio/meio de congelamento | Lonza (Basileia, Suíça) | 12-769E | |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EUA) | 161-3101 | |
| Gelatina, de pele suína | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Faça estoque a 0,2% em PBS, autoclave e armazene em temperatura ambiente. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canadá) | 5850 | Combine o suplemento 5x com o meio básico, alíquota e armazene a 4 ° C por até 2 semanas. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Meio de Cultura | Stemgent | 05-100-1A | Descongelar a 4 &graus; C O / N, alíquota e armazenar em 4 ° C por até 2 semanas. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, EUA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Reagente de Dissociação) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EUA) | 703-546-155 | |
| Agente de polibreno/transfecção | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware 12 | |||
| poços | VWR (West Chester, PA, EUA) | 29442-038 | |
| Placas de 6 poços | VWR | 29442-042 | |
| Placas de 10 cm | de calibre 18 | Sigma-Aldrich | |
| Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA) | 148265D | ||
| Agulha de calibre 21 | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tóquio, Japão) | ||
| BD FACSDiva Versão 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, EUA) | KK2601 | |
| Kit de isolamento de RNA de alta pureza | Roche | 11828665001 | |
| Transcritor Kit de síntese de cDNA de primeira fita | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack | Kit Sialix (Newton, MA, EUA) | Pacote básico | |
| Media | |||
| Mídia combinada 1 | StemCell Technologies e Stemgent | Consiste em partes iguais de mTeSR1 e Nutristem | |
| Meios combinados 2 | StemCell Technologies e Stemgent | Consiste em partes iguais de TeSR2 e Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco' s Águia modificada' s meio/F12 [DMEM/F12] suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1x aminoácidos não essenciais, 1x Glutamax e 1x Primocin | ||
| Meio de células-tronco | DMEM/F12 suplementado com 20% de reposição de soro knockout, 1x Glutamax, 1x aminoácidos não essenciais, 1x Primocin, 1x β-mercaptoetanol e 10 ng/ml de fator básico de crescimento de fibroblastos. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco' s Águia modificada' s médio/F12; PBS, solução salina tamponada com fosfato. |
Referências
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al.
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Reimpressões e permissões
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