Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

Resumo

Descrevemos um protocolo para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de fatores reprogramadas e caracterizadas baseadas em lentivirais e conversão em condições putativas de grau clínico.

Resumo

Humanos induzida células estaminais pluripotentes (hiPSCs) pode ser gerado com metodologias de reprogramação à base de lentivírus. No entanto, os traços de genes potencialmente oncogénicos restantes em regiões activamente transcritas do genoma, limitar o seu potencial para a utilização em aplicações terapêuticas humanas ^1. Além disso, os antigénios não-humanos derivados de reprogramação ou a diferenciação de células estaminais em derivados terapeuticamente relevantes impede as referidas hiPSCs de ser usado num contexto clínico humano ^2. Neste vídeo, apresentamos um procedimento para a reprogramação e analisar hiPSCs livre de fator livres de transgenes exógenos. Estes hiPSCs então pode ser analisado para anormalidades da expressão do gene específico do intrão contendo a lentivírus. Esta análise pode ser realizada utilizando reacção em cadeia da polimerase sensível quantitativa (PCR), que tem uma vantagem sobre as técnicas menos sensíveis anteriormente utilizada para detectar diferenças de expressão do gene ^3. Conversão completa emboas práticas de fabrico clínico-grade (BPF) condições, permite relevância clínica humana. Nosso protocolo oferece um outro que os critérios de admissibilidade atuais irão se expandir e incluir caracterizados derivados baseados em hiPSC livre de fatores para aplicações terapêuticas para-humanos decorrentes hiPSCs GMP-grade, o que deverá eliminar qualquer risco de imunogenicidade devido aos antígenos não-humanos-forneceu metodologia. Este protocolo é amplamente aplicável a lentivirais reprogramado células de qualquer tipo e não fornece um método reprodutível para a conversão de células reprogramadas em condições GMP-grau.

Introdução

As células humanas adultas demonstraram ser capazes de sofrer remodelação e reprogramação epigenética, como resultado da expressão baseada em lentivírus de quatro fatores-chave de transcrição^4,5. Um avanço importante no campo da reprogramação foi o uso de um único de células-tronco lentivirais excisáveis (STEMCCA), que abrigava todos os quatro fatores de transcrição de reprogramação que permitiam uma proporção estequiométrica precisa da expressão da proteína⁶. Além disso, quando transduzido em uma multiplicidade específica de faixas de infecção, o STEMCCA pode levar a eventos de integração genômica predominantemente únicos durante o processo de reprogramação⁷. A introdução de uma versão excisável do STEMCCA, que utiliza a tecnologia Cre / loxP seguida pela excisão do vetor de reprogramação após a derivação da linhagem de células-tronco, permitiu que linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) livres de fatores fossem derivadas⁸. Além disso, a fim de melhorar as aplicações terapêuticas de hiPSCs, uma metodologia nova, rápida e prontamente aplicável para a conversão de linhagens celulares de grau de boas práticas de fabricação (GMP), de condições contendo xeno para condições livres de xeno, precisava ser implementada. Aqui, discutimos uma metodologia relevante que avalia com mais precisão as diferenças de expressão gênica integrada, especificamente quando integradas a um íntron, e a conversão celular de grau clínico em condições putativas de GMP.

Pesquisas anteriores usaram apenas análises transcricionais de microarray relativamente insensíveis para analisar as diferenças de expressão gênica em genes integrados após a transdução de STEMCCA^3,9. Aqui, apresentamos a metodologia de análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa sensível, para examinar melhor as diferenças de expressão gênica integrada. É importante ressaltar que os critérios atuais de porto seguro descartam hiPSCs que possuem genes com integrações virais, limitando assim a aplicabilidade dessas células para terapêutica celular humana a jusante⁹. Propomos que o status quo pode mudar com o uso de hiPSCs intronicamente reprogramados totalmente caracterizados e livres de transgenes. Além disso, introduzimos um protocolo robusto de conversão celular de grau GMP que pode ser prontamente aplicado a uma variedade de tipos de células diferentes, que foram originalmente derivadas em condições contendo xeno¹⁰. Isso oferece oportunidades significativas para o desenvolvimento de futuros experimentos de reprogramação celular, que requerem condições de nível clínico para manter a relevância terapêutica humana.

Essas metodologias fornecem uma base sobre a qual os critérios atuais de porto seguro podem ser expandidos para incluir linhas hiPSC reprogramadas por STEMCCA caracterizadas que mantêm um perfil de expressão gênica normal após a excisão de STEMCCA do íntron integrado. Além disso, a conversão completa em condições de grau clínico, livres de antígenos animais não humanos, ajudará a incorporar muitos outros tipos de células, que foram previamente reprogramadas e caracterizadas apenas em condições contendo xeno. Essas metodologias, combinadas, são motivos persuasivos para a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA considerar a expansão de sua aprovação limitada de terapias baseadas em células-tronco embrionárias humanas (ESC) para terapias baseadas em hiPSC¹¹.

Recentemente, detalhamos a derivação de uma linha hiPSC livre de fator que foi totalmente caracterizada e convertida em condições putativas de grau clínico¹⁰. Aqui, detalhamos o protocolo para derivação de hiPSC utilizando o lentivírus STESCCA. Essas células-tronco passam por um processo de excisão seguido pela caracterização da expressão gênica. Finalmente, os hiPSCs são convertidos em condições de grau GMP por uma metodologia de conversão lenta.

Protocolo

NOTA: Este método foi utilizado na pesquisa, publicada no incrédulo et al ^10..

1. Reprogramação Adulto Human dérmica fibroblastos com STEMCCA

1. Fibroblastos dérmicos humanos (adultos Descongelar HUFS), passagem 4 ou inferior, num banho de água a 37 C ° durante 2 min, tomando cuidado para não mergulhar a parte superior do frasco com água.
2. Colocar a suspensão de 1 ml de fibroblastos humanos para um frasco cónico de 15 ml e colocar-se lentamente 4 ml de meio de florins padrão, pré-aquecido a 37 ° C, de uma forma gota a gota, para diluir a sulfóxido de dimetilo (DMSO) e suspender novamente as células.
3. Centrifuga-se o frasco a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células num volume adequado de meios para criar uma suspensão de 100.000 células / ml e, em seguida, adicionar 2 ml para um poço de uma placa de seis poços, pré-revestidos durante 20 min com 0,2% de gelatina.
   NOTA: A irmã bem com igual número de células por linha e condição precisa ser semeado for a contagem de células / multiplicidade de infecção de cálculo (MOI).
4. Rocha lado da placa para o lado e para trás e para distribuir uniformemente as células. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO _2, num incubador humidificado.
5. No dia da transdução, obter a contagem de células (s) a partir da irmã poço (s) de aproximadamente 24 h após o plaqueamento inicial florins.
6. Descongelar 2 x 10 ⁸ TU, ou, concentrado lentivírus equivalente (STEMCCA) e diluir a 1 x 10 ⁸ TU / ml em meio HUF.
7. Transduzir células em uma relação de 10-MOI em meios de florins suplementado com 8 ug / ml de agente de transfecção. Misturar uniformemente poços transduzidos e incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO _2, num incubador humidificado.
8. Cerca de 24 horas após a transdução de lentivírus, alterar a mídia HUF a célula-tronco pluripotentes humanas (PSC) médio padrão.
9. Nos dias 2 a 6, mudar media diária com meio PSC humano.
10. No dia 6, dois placa 0,2% placas revestidas com gelatina de 10 cm de1,5-1,75 x 10 ⁶ MEFs derivadas de ratinhos CF1 em media ¹² florins.
11. No dia 7, tendo o cuidado de não mais do que a centrifugação de 100 x g, temperatura ambiente utilização de tripsina para retirar os fibroblastos reprogramadas dia 7 de um poço da placa de seis poços e passagem a uma razão 1:16, por plaqueamento de todas as células uniformemente entre duas placas de 10 cm, com a mídia PSC humano fresco, que foram semeadas com MEFs no dia anterior. Distribuir os agregados de células num movimento em espiral no sentido horário e no lugar de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO ₂ humidificado incubadora durante a noite.
12. Cerca de 48 horas após a semeadura das células reprogramadas para MEFs e todos os dias a partir daí, mudar para fora da mídia PSC humanos gastos com meios frescos.
13. Após 3 a 4 semanas, escolher colónias individuais com morfologia típica CES como com uma agulha de calibre 21 e subclonar-se em um prato de 24 poços colocando aproximadamente 8 a 10 partes individuais de colónias específicas em poços individuais de uma solução a 0,2% de gelatina-revestido placa de 24 poços de pré-lançamentoed com MEFs derivadas de ratinhos CF1 em meio PSC humano.
    NOTA: Após a expansão das colônias escolhidas, as colônias têm de ser caracterizado como pluripotentes por formação de corpo embryoid e análise de marcadores de pluripotência expressão ao nível da proteína.

2. Vector Integração Análise Site e STEMCCA Excisão

1. Analisar o local de integração STEMCCA por amplificação linear não restritiva de PCR tal como descrito ^10.
2. Depois de ensaiar a assegurar uma integração numa área desejada do genoma, consumo STEMCCA fora, aspirando o meio de ESC humano de idade. Em seguida, combinar 45 ul de concentrado de vírus adeno-Cre-PuroR com 8 ug / ml de agente de transfecção em 3 ml de meio de PSC padrão durante 24 horas.
3. Após o período de incubação de 24 horas, aspirar o sobrenadante virai misto e lavar as células duas vezes com meio de PSC humanos. Coloque frescos media PSC humanos, juntamente com 2 mg / ml �puromicina por um período de 5 dias, mudando a mídia sagacidade diáriah meios frescos e antibiótico.
4. Após 5 dias, subclone restantes colónias com uma agulha de calibre 21 para 0,2% de poços revestidos com gelatina, em uma placa de 12 poços pré-revestidos com MEFs derivados de CF1mice e expandir conforme detalhado acima.
   NOTA: Depois de expansão suficiente para se obter uma massa congelada, a conversão em condições isentas de alimentação é necessária. Espere pelo menos 95% de morte colônia de células-tronco, como a maioria das células não vai ser transduzidas com sucesso e vai sucumbir ao antibiótico durante o período de cinco dias de incubação. Embora adeno-Cre-PuroR integra a uma eficiência de 0,001-1% em cromossomas hospedeiros de células infectadas, reexposing uma amostra livre de colónias do factor-a puromicina para garantir 100% de morte celular não irá confirmar a integração ocorreu ^13.
5. Descongelar uma ampola de matriz de membrana basal pré-aliquotado em gelo, ao longo de um período de aproximadamente 2 horas (as recomendações do fabricante), até que a matriz é um líquido e diluir para uma concentração final de 1:30 em meio basal frio. Cono número desejado de poços numa placa de seis poços com 1 ml por poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 1 hora.
6. -Cross hatch (utilizando uma agulha de calibre 18, ou um vidro ou plástico "ponta"), pelo menos, 20 a 30 colónias a partir de um poço revestido previamente com MEFs. Tenha o cuidado de reduzir MEF edificante e transferir de placa.
   1. Gerar o dispositivo de tracejado cruzado através de um número de diferentes abordagens, a partir do aquecimento mais complicados, que puxa, e acabamento de uma pipeta de Pasteur de vidro para uma chama, para o simples uso de uma ponta de pipeta de plástico estéril ou, como no nosso caso, 21- e / ou 18 de bitola agulhas.
7. Aspirar a matriz do poço após incubação revestido.
8. Remover pedaços de colônias por raspagem suave da placa de idade, com uma pipeta de 200 mL e coloque cuidadosamente em 3 ml de mídia combinadas frescos 1 na placa revestida com matriz. Incubar durante a noite em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2 humidificada. Troca de mídia 48 horas após passaging.
9. Extrai-se o ADN genómico a partir de pós-hiPSCs excisada e sem alimentação convertidos, em mais de 80% da confluência, utilizando kits de extracção de DNA comercial.
10. Analisar por excisão adequada com primers específicos para integrações exógenos do lentivírus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Reconstituir primers liofilizados com água PCR-grade para uma solução estoque de 10 mM.
11. Executar uma RCP com o protocolo de cinco passos que se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de cada um dos seguintes: desnaturação a 98 ° C durante 20 seg, emparelhamento de iniciador a 62 ° C durante 15 segundos, e extensão a 72 ° C durante 15 seg; seguido por um único ciclo de extensão final a 72 ° C durante 3 min.
12. Adicione um gel de agarose a 3% em peso a 1,5 gramas de agarose e colocando-o em 50 ml de tampão 1x Tris-acetato-EDTA. Micro-ondas até agarose é dissolvido e coloque em mancha gel DNA em pdiluição roper, misturar e dispensar volume adequado em cassete gel para solidificar durante 1 hora à temperatura ambiente.
13. Carga 12 uL de produto de PCR misturado com 3 ul de corante de carga em gel de agarose a 3%. Submeter o gel durante 30 min a 80 V.
14. Visualizar com luz ultravioleta para a ausência de uma banda que indica a excisão correcta.

3. A determinação quantitativa de Diferenças Gene expressão usando PCR quantitativo de Pré e Pós-hiPSCs excisadas

1. Extrato de RNA total de hiPSCs pós-excisadas e livre-feeder convertidos por meio de kits de extração de RNA comerciais.
2. Reverse-transcrever-se a 1 ug de ARN total, utilizando-se kits comerciais, de acordo com as instruções do fabricante. Use ancorado-oligo (dT) ₁₈ e os iniciadores de hexâmeros aleatórios.
   NOTA: Certifique-se de que o protocolo de PCR é adaptada para transcritos do gene de mais de ou menos de 4 kb. Primers específicos terá de ser feito para i qualquer gene STEMCCA originalmente integradonto.
3. Reconstituir o iniciador de PCR liofilizado com água de grau de uma solução estoque de 20? M.
4. Use de amostra de 5 ng por 20 ul de reacção que consiste de sonda UPL 10 uM, 2x LightCycler 480 Sondas mestre, e 20 uM iniciadores directos e inversos.

4. A conversão em condições GMP-grade

1. No primeiro dia de transição os hiPSCs pós-extirpado durante a condições GMP grau, fazer uma mistura dos meios de comunicação que consiste em PSC humano combinado de mídia (media um combinado 1) e grau clínico boas práticas de fabrico (BPF) de mídia compatível (media combinados 2 ) a uma razão de 80:20.
2. Aspirar fora as velhas mídias combinadas 1 e colocar 3 ml de novos meios de comunicação combinados 1 e 2, pré-aquecido, na proporção 80:20. Mudar meios diariamente durante 3 dias com esta proporção específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
3. No dia 4, fazer a mídia combinado 1 e 2 numa proporção de 50:50. Aspirar fora o velho médio e subste com a mídia pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2, na proporção 50:50. Mudança de mídia durante 3 dias com essa relação específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
4. No dia 7, fazer a media combinado 1 e 2 na proporção 20:80. Aspirar off do meio velho e substitua-o por meio de pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2, na proporção 20:80. Mudança de mídia durante 3 dias com essa relação específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
5. No dia 10, fazer os meios de comunicação combinados 1 e 2 em um 0: relação de 100. Aspirar off do meio velho e substitua-o por meio de pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2 no 0: relação de 100. Mudança de mídia todos os dias na mesma proporção específica. As células estão agora em meio isento de xeno completamente definido. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
   NOTA: Durante todo este processo de conversão, de passagens em rotina com uma agulha de calibre 18 que é necessário para manter o tamanho da colónia e densidade adequada. Plano de passaging células a cada 4 a 5 dias com base no tamanho da colónia, a confluência, e diferenciação.
6. Uma demão poço numa placa de seis poços com um substrato isento de xeno definido como recomendado pelo fabricante.
7. Passagem Mecanicamente confluente bem, já convertido em condições mídia xeno-livre, a partir de uma placa de seis bem com uma agulha de calibre 18. Importante, colocar novos media (mídia combinados 2) sobre as células com 1x inibidor ROCHA, durante 1 hora, antes de passaging a pré-condição da mídia.
8. Aspirar a solução de substrato sintético para fora da nova placa que as células estão a ser transferido para. Remova todas as mídias contendo os aglomerados de células-tronco a partir da placa de idade e transferir para a nova placa.
9. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2 durante 2 dias, com um mínimo de perturbação física (de preferência placas, uma vez dentro da incubadora, não são directamente atingidas de qualquer forma) para permitir a ligação máxima.
   NOTA: As células exigirá mudanças mídia diárias. Passagin Continuadag cada 4 dias, será importante. Usando uma agulha de calibre 21, de passagem apenas as partes de colônias com morfologia ESC-como ótima (relação núcleo alto). Isso irá garantir seleção para colônias hiPSC adequadas que vai crescer bem e, eventualmente, produzir colônias homogêneas. Tempo total de derivação da ESC como colônias é entre 15-20 dias após a mudança de mídia combinado inicial.
10. Congelar para baixo as hiPSCs post extirpado GMP grau pelo primeiro cross-hatch todas as colônias, utilizando uma agulha de calibre 18. Remover todas as partes fora usando uma pipeta de 200 uL e transferir todos os meios contendo as células para um frasco cónico de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
11. Enquanto as células são centrifugação, fazer um meio de congelamento que consiste em volumes iguais de meio frio combinadas 2 e meio de congelação, com uma concentração final de DMSO de 7,5%.
12. Depois de células são sedimentadas, aspirar off meio de idade e gota a gota, re-suspender o pellet com a mídia de congelamento. Imediatamente transfer para frascos de congelamento e colocar em um freezer -80 ° C.

5. hiPSCs Caracterizar GMP-grade Post-excisadas

1. Para assegurar a expressão apropriada de marcadores de pluripotência pós-conversão, uso de QPCR para quantificar a expressão de marcadores de pluripotência chave (SOX2, OCT4, e NANOG) utilizando os iniciadores listados na Tabela 1 com os mesmos passos como mencionado no passo 3. QPCR metodologias a seguir mesmos passos listados na etapa 3.
2. Use a citometria de fluxo para detectar o ácido não-humano siálico Neu5Gc (ácido -glycolylneuraminic N), de acordo com as condições padrão listados no kit como publicado anteriormente ^10.
3. Lavar suavemente as placas de cultura celular com células, utilizando solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
4. Dissociar colónias usando reagente de dissociação 1x durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Durante o tempo de incubação de 5 min do passo 5.4, preparar a solução de bloqueio (fornecida emkit), fazendo um 0,5% Agente de bloqueio em PBS gelado.
6. Rotular o seguinte conjunto de tubos para análise de citometria de fluxo: Unstained; 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) DAPI; Anticorpo de controlo 1: 200; Anticorpo primário 1: 200; Anticorpo secundário 1: 200 de burro anti-IgG de galinha (H + L); MEFs amostra; Células pós-extirpado amostra na matriz; e células em substrato sintético Sample pós-extirpado.
7. Gentilmente desalojar agregados celulares a partir da etapa 5.4, adicionando 2 ml de bloquear conteúdos de solução e de transferência para um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 80 xg durante 5 min a 4 ° C.
8. Lavar as células duas vezes com solução de bloqueio e centrifugar tal como indicado no passo 5.7.
9. Gentilmente re-suspender aproximadamente 1 x 10 ⁶ células em 100 ul de solução de diluição com o volume correspondente de cada anticorpo bloqueador. Incubar, com agitação suave a 4 ° C durante 1 h.
10. Repetir lavagens três vezes como no passo 5.8.
11. Re-suspender o pellet celular em 400 mL de diluente Buffer (do kit) com 1: 100 de DAPI para tubos de 2, 6, 7 e 8, conforme listado na etapa 5.6.
12. Células tensão através de uma peneira de 40 mM e executado através de citometria de fluxo.

Resultados

Apresenta-se um protocolo para derivar hiPSCs livre de factor de grau clínico usando a abordagem baseada reprogramação por lentivírus STEMCCA. A Figura 1A mostra uma imagem representativa de três linhas de pré-excisada hiPSC diferentes, depois de reprogramação com a abordagem STEMCCA sobre uma camada de MEFs. A principal vantagem da abordagem de reprogramação STEMCCA reside no sucesso reprogramação consistente conseguida por vários cientistas, em diferentes grupos de pesquisa e locais. A Figura ...

Discussão

Nós descrevemos uma metodologia de derivar hiPSCs livre de fatores e de fazê-los clinicamente relevante, convertendo essas células em condições GMP grau de diferenciação celular downstream em futuras terapêuticas humanas. Embora este protocolo é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células, optou-se por reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, devido à facilidade de extracção a partir do paciente e a sua aplicabilidade terapêutica humana personalizados. Uma vez que as limitações forem corrigidas, tanto qua...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios e reagentes
DMEM/F12 (meio basal)	Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA)	11330057
Soro bovino fetal	Invitrogen	16000044
Meio essencial mínimo (MEM) aminoácidos não essenciais (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100x	Invitrogen	15140-122	Descongelar a 4 &graus; C, alíquota e armazenar em − 20 ° C
Knockout substituição do soro	Invitrogen	10828028	Descongelar a 4 &graus; C, alíquota e armazenar em − 20 ° C
Tripsina/EDTA, 0,5%	Invitrogen	15400-054	Diluir o estoque até 0,05% em 1x PBS
Fator básico de crescimento de fibroblastos	GlobalStem (Rockville, MD, EUA)	GSR-2001	Reconstituir para 10 µ g/ml de estoque em 0,1% de albumina de soro bovino dissolvido em 1x PBS e armazenar em − 80 &graus; C
β-mercaptoetanol	Millipore (Billerica, MA, EUA)	ES-007-E
Matrigel (matriz de membrana basal)	BD Biosciences (San Jose, CA, EUA)	356231	Dilua o frasco de Matrigel com 10 ml de DMEM/F12 enquanto estiver em gelo para uma diluição de 1:2. Alíquota e loja em − 20 °C.
CELLstart (Substrato Sintético)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, EUA)	04-0012-02
Puromicina	Invitrogen	A1113802
Sondas LightCycler 480 Master	Roche (Basileia, Suíça)	4707494001
ProFreeze-CDM Médio/meio de congelamento	Lonza (Basileia, Suíça)	12-769E
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EUA)	161-3101
Gelatina, de pele suína	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Faça estoque a 0,2% em PBS, autoclave e armazene em temperatura ambiente.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canadá)	5850	Combine o suplemento 5x com o meio básico, alíquota e armazene a 4 ° C por até 2 semanas.
Stemedia NutriStem XF/FF Meio de Cultura	Stemgent	05-100-1A	Descongelar a 4 &graus; C O / N, alíquota e armazenar em 4 ° C por até 2 semanas.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, EUA)	ant-pm-1
Accutase (Reagente de Dissociação)	Invitrogen	A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EUA)	703-546-155
Agente de polibreno/transfecção	Millipore	TR-1003-G
Plasticware 12
poços	VWR (West Chester, PA, EUA)	29442-038
Placas de 6 poços	VWR	29442-042
Placas de 10 cm	de calibre 18	Sigma-Aldrich
	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)	148265D
Agulha de calibre 21	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer	KSystem by Nikon (Tóquio, Japão)
BD FACSDiva Versão 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, EUA)	KK2601
Kit de isolamento de RNA de alta pureza	Roche	11828665001
Transcritor Kit de síntese de cDNA de primeira fita	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack	Kit Sialix (Newton, MA, EUA)	Pacote básico
Media
Mídia combinada 1	StemCell Technologies e Stemgent		Consiste em partes iguais de mTeSR1 e Nutristem
Meios combinados 2	StemCell Technologies e Stemgent		Consiste em partes iguais de TeSR2 e Nutristem
HUF Media			Dulbecco' s Águia modificada' s meio/F12 [DMEM/F12] suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1x aminoácidos não essenciais, 1x Glutamax e 1x Primocin
Meio de células-tronco			DMEM/F12 suplementado com 20% de reposição de soro knockout, 1x Glutamax, 1x aminoácidos não essenciais, 1x Primocin, 1x β-mercaptoetanol e 10 ng/ml de fator básico de crescimento de fibroblastos.
DMEM/F12, Dulbecco' s Águia modificada' s médio/F12; PBS, solução salina tamponada com fosfato.