Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

Haley M. Peckham; Anita H. Ferner; Lauren Giuffrida; Simon S. Murray; Junhua Xiao

doi:10.3791/52179

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Artigo de método

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

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DOI:

10.3791/52179

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12 de janeiro de 2015

Haley M. Peckham¹ , Anita H. Ferner¹ , Lauren Giuffrida¹ , Simon S. Murray¹^,² , Junhua Xiao¹^,²

¹Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, ²The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Research, The University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Resumo

Mielinização é um processo complexo que envolve ambos os neurónios e as células formadoras de mielina da glia, oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Usamos um ensaio in vitro mielinização, um modelo estabelecido para o estudo da mielinização do SNC in vitro. Para fazer isso, as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) são adicionados aos gânglio da raiz primária roedor dorsal (DRG) neurónios purificados para formar myelinating co-culturas. A fim de interrogar especificamente os papéis que determinadas proteínas expressas pelos oligodendrócitos exercer sobre mielinização nós desenvolvemos protocolos que transduzem seletivamente OPCs usando o lentivírus overexpressing tipo selvagem, proteínas negativas constitutivamente ativos ou dominantes antes de serem semeadas em neurônios do GRD. Isso nos permite interrogar especificamente as funções destas proteínas na regulação oligodendrogliais mielinização. Os protocolos podem também ser aplicado no estudo de otos tipos de células, proporcionando assim uma abordagem que permite a manipulação selectiva de proteínas expressas por um tipo de célula desejado, tais como oligodendrócitos orientada para o estudo de mecanismos de sinalização e de compensação. Em conclusão, a combinação de ensaio in vitro com a mielinização lentivirais infectados OPCs fornece uma ferramenta estratégica para a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na mielinização.

Introdução

Mielinização de axónios é crucial para a transmissão rápida e eficiente do potencial de acção em ambos os sistemas nervosos central e periférico. As células especializadas, as células de Schwann no sistema nervoso periférico e oligodendrócitos no sistema nervoso central, enrole e embainham axônios em mielina, efetivamente isolamento do nervo e que facilitam a condução saltatory ^1. O processo de mielinização pode ser estudada in vitro usando neurónios ganglionares da retina ^{2, 3,} nanofibras modificadas ou neurónios do gânglio da raiz dorsal de co-cultivados quer com células de Schwann ⁴ ou oligodendrócitos ^5-7. O en....