Method Article

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Abstract

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Defesa precoce contra patógenos da mucosa consiste de uma barreira epitelial e células imunitárias inatas. A imunocompetência de ambos, e sua intercomunicação, são de extrema importância para a proteção contra infecções. As interações de células imunitárias inatas epiteliais e com um patógeno são melhor investigada in vivo, onde o comportamento complexo se desenrola ao longo do tempo e do espaço. No entanto, os modelos existentes não permitem fácil imaging espaço-temporal da batalha com patógenos ao nível da mucosa.

O modelo desenvolvido aqui cria uma infecção das mucosas por injecção directa do agente patogénico fúngico, Candida albicans, em swimbladder de peixe-zebra juvenil. A infecção resultante permite imagens de alta resolução do comportamento das células epiteliais e imune inata ao longo do desenvolvimento da doença mucosa. A versatilidade deste método permite interrogatório do hospedeiro para sondar a seqüência detalhada de eventos imunológicos que levam a phrecrutamento agocyte e examinar os papéis de determinados tipos de células e vias moleculares na proteção. Além disso, o comportamento do agente patogénico como uma função do ataque do sistema imunológico pode ser iluminados simultaneamente por fluorescência utilizando-expressando proteína C. albicans. O aumento da resolução espacial da interação patógeno-hospedeiro também é possível através da técnica de dissecção da bexiga natatória rápida descrito.

O modelo de infecção da mucosa descrito aqui é simples e altamente reprodutível, tornando-se uma ferramenta valiosa para o estudo da mucosa candidíase. Este sistema pode também ser amplamente traduzível a outros agentes patogénicos das mucosas, tais como micróbios micobacterianas, bacterianas ou virais que normalmente infectam através de superfícies epiteliais.

Introduction

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As infecções da mucosa podem levar a infecções da corrente sanguínea com risco de vida devido ao dano da barreira epitelial, que permite o acesso dos patógenos ao ambiente sistêmico1,2. Além disso, as infecções da mucosa também podem causar imunopatologia significativa, mesmo quando contidas externamente3-5. O fungo unicelular comensal Candida albicans está presente na maioria da população na cavidade oral e em outros locais da mucosa6-9. Embora normalmente contidos por respostas imunes inatas e adaptativas, defeitos imunes inatos e intervenções médicas podem levar a candidíase mucosa grave. O ataque à barreira epitelial resulta em um risco aumentado de doença disseminada com risco de vida, bem como imunopatologia, como no caso da candidíase vulvovaginal, além disso, a colonização por C. albicans tem sido associada à homeostase imunológica pulmonar10,11. A candidíase disseminada é agora a quarta infecção mais comum da corrente sanguínea em unidades de terapia intensiva12 e a mortalidade de até 40% a torna uma grande preocupação. Devido ao aumento dos tratamentos imunomoduladores para pacientes com doenças autoimunes, câncer ou transplantes de órgãos, é imperativo entender a interação entre esse patógeno e o compartimento imunológico da mucosa.

A maioria dos avanços biológicos celulares em relação às interações C. albicans-células no nível da mucosa vem de modelos in vitro13-15 e murinos16-18. Ambas as abordagens têm vantagens distintas, mas a capacidade de obter imagens de células vivas em alta resolução em um hospedeiro intacto limitou a caracterização temporal e espacial da infecção. Para esses estudos, há a necessidade de um modelo in vivo onde a interação de patógenos, imunes inatos e células epiteliais possa ser visualizada em um hospedeiro vertebrado intacto.

O peixe-zebra surgiu como uma ferramenta inestimável para a compreensão das doenças humanas, principalmente devido à sua transparência e facilidade de manipulação genética. O desenvolvimento de células e órgãos foi fotografado em detalhes requintados, o que levou à descrição de novos comportamentos de células imunes, como o comportamento das células T no timo em desenvolvimento19 ou a batalha entre micobactérias intracelulares e fagócitos20-22. Trabalhos recentes descreveram as interações micróbio-hospedeiro intestinal em peixe-zebra e mostraram que a colonização microbiana do trato intestinal afeta a fisiologia intestinal do hospedeiro e a resistência a outras infecções23,24. Além disso, a infecção através do epitélio intestinal foi descrita para vários patógenos.

Em contraste com o trato intestinal, a bexiga natatória representa um modelo de mucosa mais isolado e complementar. Este órgão é uma extensão do tubo intestinal em desenvolvimento e se forma anteriormente ao fígado e pâncreas25,26. Produz surfactante, muco e peptídeos antimicrobianos27,28 e anatomicamente, assim como ontogeneticamente, esse órgão é considerado homólogo do pulmão de mamíferos29,30. Como o duto pneumático permanece conectado ao intestino do peixe-zebra, isso permite que a infecção por imersão ocorra naturalmente. Notavelmente, as únicas infecções naturais conhecidas de peixes com espécies de Candida são infecções por C. albicans na bexiga natatória31. Recentemente, descrevemos um modelo experimental de infecção por imersão em que C. albicans infecta a bexiga natatória e descobrimos que essa infecção recapitula algumas das características da interação C. albicans-epitelial in vitro32,33.

No método apresentado aqui, o modelo original de infecção por imersão é aprimorado injetando diretamente C. albicans na bexiga natatória de 4 dias após a fertilização (dpf) peixe-zebra. Isso permite um controle temporal preciso da infecção, bem como um inóculo altamente reprodutível. Ele permite imagens intravitais detalhadas, juntamente com a versatilidade do modelo de peixe-zebra. Como exemplo do que pode ser feito com este método, apresentamos a dinâmica espaço-temporal do crescimento de C. albicans juntamente com o recrutamento de neutrófilos para o local da infecção. Como o tecido da bexiga natatória do peixe-zebra é difícil de obter imagens intravitais, também apresentamos uma técnica rápida de dissecção da bexiga natatória que melhora o sinal de fluorescência e a resolução microscópica. Esses métodos expandem a caixa de ferramentas para pesquisas fúngicas, imunológicas e de aquicultura, além de descrever uma nova rota de infecção que pode ser traduzida para modelar outras infecções fúngicas, bacterianas ou virais de superfícies mucosas.

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Protocol

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NOTA: Todos os protocolos de cuidados de peixe-zebra e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH sob Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) A2012-11-03 protocolo.

1. Zebrafish Elevando a 4 dias após a fertilização

  1. Recolhe AB peixe-zebra, ou quaisquer outras linhas transgénicas, dentro da primeira hora após a fertilização 3, como mostrado em outro vídeo 34.
  2. Incubar 120 ovos em um 15 centímetros placas de Petri contendo 150 ml de mídia E3 (mM NaCl 5; KCl 0,17; 0,33 mM CaCl 2; 0,33 mM MgCl2; HEPES 2 mM; pH 6,8) com azul de metileno (0,3 ug / ml definitiva concentração) em um 33 ° C incubadora com 12/12 luz / fotoperíodo escuro.
  3. Substituir o material após 6 h com E3 + PTU (1-fenil-2-tioureia, 10 ug / ml de concentração final) e remover os ovos mortos.
  4. Incubar durante 4 dias a 33 ° C, trocando a mídia com nova E3 + PTU após 2 dias.

2. Eminjeção Micro-agulha Preparação

  1. Puxe capilar borosilicato (OD 1,2 milímetros; ID 0,69 milímetros) em um micro-agulha usando um extrator agulha com as seguintes configurações (550 Calor; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
    NOTA: As configurações irão variar de filamento para filamento para se obter micro-agulhas em forma semelhante (ver Figura 1) e necessitam de ser reajustados sempre que um novo filamento está instalado.
  2. Encha uma micro-agulha com 3 ul de 0,4 um filtrou-tampão salino de fosfato (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM de Na 2 HPO 4; 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma pipeta de 20 uL microloader ponta.
  3. Defina-se a micro-agulha num suporte de micropipeta em um micromanipulador ligado a um sistema de injecção de pressão. Ajuste a pressão de injeção para 30 PSI e a duração do pulso de 30 ms.
  4. Usando uma placa de Petri com água destilada, inferior a micro-agulha até 1/5 da agulha está na água. Clipe da wi micro-agulhath uma pinça fina logo abaixo do nível da água. Traga a micro-agulha para fora da água e empurrar o pedal várias vezes até um bolus aparece.
  5. Medir o diâmetro do bolo baixando a micro-agulha em um hemocitómetro em camadas com uma gota de óleo de tipo A imersão. Ajustar a duração do impulso para obter o volume desejado (ver Tabela 1).
  6. Ajuste da contrapressão para o bólus se mantenha estável em óleo (diminuir a pressão, se aumenta o volume do bolo e aumentar a pressão de retorno se o volume de bolus diminui). Grave a duração do pulso para cada micro-agulha.
  7. Retire a PBS da micro-agulha, aspirando-lo usando uma ponteira microloader e expulsar a esquerda-over PBS, colocando-o de volta no injector e apertar o interruptor de pulso contínua. Reserve cada micro-agulha.

3. Preparação Candida

  1. Streak Candida albicans transformada com otimizado-códon dTomato, GFP, BFP, EOS ou FarVermelho de um lote congelado (-80 ° C estoque em glicerol a 25%) usando um passador de madeira estéril para uma levedura dextrose peptine (YPD) placa de agar (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 20 g / L de dextrose , 20 g / L de agar; autoclavado e verteu-se 25 ml em placas de Petri) e incubar durante a noite a 30 ° C.
  2. Escolha uma colónia utilizando um pino de madeira e estéril para inocular 5 ml de meio YPD líquido (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 20 g / L de dextrose, autoclavado e assepticamente em alíquotas de 5 ml em 16 x 150 milímetros de cultura de vidro tubos).
  3. Incubar durante a noite a 30 ° C num tambor de rolos a 60 rpm.
  4. Colete 1 ml de C. albicans cultura e transferência para um tubo de centrífuga de 1,7 ml estéril.
  5. Centrifugar a 5000 xg por um par de segundos. Esvazie o sobrenadante e adicionar 1 ml de PBS estéril, vortex completamente. Repita isso duas vezes.
  6. Contar as colónias utilizando um hemocitómetro por diluição do stock 1 mL de 1: 1000 em PBS estéril.

4. Injetar Zebrafish ema bexiga natatória

  1. Aquecer um prato de injecção (2% de agarose) durante 30 min em uma incubadora de 33 ° C.
  2. No momento desejado, remover 100 dos 150 ml de E3 + UTP a partir do prato de 15 centímetros de Petri contendo o peixe para injectar, utilizando uma pipeta de 25 ml sem aspirar qualquer peixe-zebra.
  3. Anestesiar 4 dpf peixe-zebra por adição de 2 ml de uma mistura 4 mg / ml tamponado tricaina metano sulfonato estoque (TR) para os restantes 50 ml de meio (concentração final de 200 ug / ml) e aguardar durante 15 minutos.
  4. Sob um microscópio de dissecação, selecione peixe com uma bexiga natatória inflado. Os peixes também podem ser rastreados na época para fenótipo mais homogêneo, como a distribuição de neutrófilos em mpo: linha GFP utilizando um microscópio de epifluorescência dissecando.
  5. Dilui-se a C. albicans de estoque a sua concentração original (passo 3.8) e 1,5 x 10 7 unidades formadoras de colónias por ml (cfu / ml) em PBS.
  6. Transferir 30 peixes-zebra para o prato de injecção usando um tubo de transferência de plásticotte e remover o excesso de mídia.
  7. Usando uma ferramenta de fio de pesca (0,012 polegadas de diâmetro linha de pesca super-colado em um capilar de borosilicato), fazer 3 linhas de 10 peixes, segurando o prato injeção vertical e orientar o peixe verticalmente.
  8. Retire o excesso de mídia.
  9. Absolutamente vortex do tubo com 1,5 x 10 7 ufc / mL C. albicans.
  10. Encha um micro-agulha com 3 l de C. albicans utilizando uma nova ponta microloader pipeta e definir a duração do pulso para a definição apropriada (veja o passo 2.9).
  11. Rode o prato de injeção para fazer um ângulo de 20 ° entre o micro-agulha ea cabeça do peixe, que aponta para a parte de trás da bexiga natatória (Figura 3A).
  12. Empurrar o micro-agulha para dentro da bexiga natatória, certificando-se o furo da agulha está no lúmen, e uma vez que pressiona o pedal.
  13. Repita o procedimento para cada peixe e transfira para um prato de recuperação (25 ml E3 + PTU) inundando o prato com um E3d esvaziando-a no prato de recuperação.
  14. Transferir mais 30 peixes para o prato de injecção.
  15. Repita injeção com um novo micro-agulha cheia com cuidadosamente agitadas C. albicans.
  16. Concluir através da injecção do controlo de PBS, se necessário, utilizando um prato de injecção diferente, para evitar a contaminação e transferir para uma cápsula de recuperação separada (passo 4.10).

5. Triagem do Peixe para o inóculo desejado

  1. Preparar 40 ml de 0,4% de baixo ponto de fusão solução de agarose (LMA) através da adição de 160 mg de agarose de baixo ponto de fusão a 40 ml de E3, fervendo por microondas até à dissolução, e de se arrefecer para 37 ° C. Adicionar 400 ul de TR (concentração final de 200 ug / ml) uma vez arrefecida.
  2. Depois de 30 minutos de recuperação, anestesiar os peixes como descrito (passo 4.3 utilizando apenas 1 ml de TR em 25 mL E3 + PTU, concentração final de 200 ug / ml).
  3. 30 Transferência de peixe (com um mínimo de meios quanto possível) a 2 ml de LMA em peso de um barco.
  4. Aspirar peixes individuais com uma pipeta de transferência e a placa de peixe com um LMA em gotas de uma placa de imagiologia de 96 poços, utilizando-se apenas os 10 x 6 poços centrais.
  5. Repita até que todos os peixes para a tela são carregados para a placa de imagem.
  6. Deixar os meios solidificar à temperatura ambiente durante 5 min.
  7. Coloque o peixe do seu lado, certificando-se que eles estão em contato com o fundo de vidro.
  8. Usando o objetivo 20X em um epifluorescência / microscópio confocal invertido e o filtro apropriado, registrar o número de C. células de levedura albicans na bexiga natatória de cada peixe.
  9. Selecione o peixe com 15-25 células de levedura na bexiga natatória (ou inóculo desejado), eutanásia peixe não selecionados (800 ug / ml de TR na E3) e retornar peixe selecionado para um prato fundo Petri com 50 ml de E3 + PTU por adicionar 3 gotas de E3 para a chapa de imagem poços selecionados e aspirar o peixe com uma pipeta de plástico.
  10. Incubar a 33 ° C durante o tempo desejado.

6. Imaging o Peixe Pós-screening

  1. No momento desejado, remover 25 dos 50 ml de meio E3 + PTU do prato fundo Petri contendo o peixe para a imagem.
  2. Anestesiar os peixes como descrito (passo 4.3 utilizando apenas 1 ml de TR em 25 ml E3 + PTU remanescente, concentração final de 200 ug / ml).
  3. Placa o peixe para uma placa de imagiologia de 96 poços e posição apropriadamente (passos 5,3-5,7).
  4. Imagem por microscopia confocal utilizando os lasers adequados e filtros de emissão. Primeiro foco nos peixes usando o objetivo 4X sob contraste de interferência diferencial (DIC) e adquirir imagens da região de interesse, utilizando o objetivo 20X com os lasers confocal em modo de digitalização com 2 velocidade ms / pixel e 1024 x 600 pixel proporção. Adquirir Z-stacks com 1 mm tamanho do passo, aplicando-se o modo de filtro de Kalman de 3 frames.
  5. Retornar para um prato fundo de Petri com 50 ml E3 + PTU ou em individual (poços de 24 poços do prato de cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubar a 33 ° C.

7. Dissecando a bexiga natatória

  1. Encher uma seringa de 10 ml com graxa alto vácuo.
  2. Prepara-se uma LMA 2% (passo 5.3 com 160 mg de agarose a baixo ponto de fusão em 8 ml de E3).
  3. No momento desejado, anestesiar o peixe (passo 5.2).
  4. Transferir 10 de peixe para um tubo de centrífuga de 1,7 mL com 1 ml de E3 e eutanásia por adição de 200 ul de 4 mg / ml tricaina (concentração final de 800 ug / ml) para o tubo de centrifugação e incubação durante 15 min à temperatura ambiente.
  5. Prepare uma lâmina de vidro de imagem, colocando 4 gotas de graxa de vácuo em uma praça, com 1 cm de diferença em um microlâmina (75 x 25 mm, Figura 2).
  6. Coloque 2 gotas de 2% LMA no meio da praça.
  7. Coloque um peixe em uma lâmina de vidro separada sob um microscópio de dissecação e verificar que o coração parou de bater, retire o excesso de água.
  8. Usando uma pinça fina dissecar a bexiga natatória, mantendo a cabeça em uma posição fixa com a pinça esquerda e puxando para baixo o intestino anterior com a pinça direita (Figura 4A).
  9. Pegue o swimbladder pelo duto pneumático com a pinça esquerda, separando-o do aparelho digestivo, e colocá-lo no centro da LMA 2% antes de ela se solidifica.
  10. Colocar uma tampa de deslizamento (18 x 18 mm) na parte superior da lâmina de vidro de imagem e empurrá-lo até que ela toque a graxa vácuo, bem como o LMA (Figura 2).
  11. Imagem dentro de 10 min de esvaziamento, tal como descrito na etapa 6.4. Repita o passo 7,7-7,11 com os outros peixes.

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Results

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Microinjection na bexiga natatória posterior

O método experimental aqui apresentado descreve a injecção de uma dose consistente de C. células de levedura albicans na bexiga natatória de 4 dpf peixe-zebra. Trabalhos anteriores com o modelo de imersão sugere que a resposta imune a bexiga natatória C. albicans é semelhante à da mucosa de mamífero candidíase 32. Aqui demonstramos um método de infecção modificado que é mais simples, mais rápida e reprodutível; v...

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Discussion

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Os avanços e as limitações do modelo de doença microinjeção swimbladder

O modelo apresentado aqui é uma extensão do modelo de imersão mucosa candidíase descrito no Gratacap et al (2013).; acrescenta as vantagens de um tempo de infecção controlada, uma dose de infecção altamente reprodutível, e, por conseguinte, uma maior eficiência. Nós demonstramos aqui novos métodos que permitem a documentação temporais não-invasivo de dinâmica de infecção em grande detalhe, bem como maior resolução ...

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

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Os autores agradecem ao Dr. Le Trinh e Dr. Tobin para generosamente fornecer a α-catenina: linha citrino peixes e Bill Jackman por nos permitir fazer a filmagem em seu laboratório. Os autores reconhecem as fontes de financiamento Institutos Nacionais de Saúde (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Projeto nº ME0-H-1-00517-13). Este manuscrito é publicado como principal Agricultura e Florestas Experiment Station número de publicação 3371.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de 1,7 mlAxygenMCT-175-C
Placas de Petri profundasFisher Scientific89107-632
Pipetas de transferênciaFisher Scientific13-711-7M
Extrato de leveduraVWR Scientific90000-726
PeptonaVWR Scientific90000-264
DextroseFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
Pinças finas (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Buchas de madeiraVWR Scientific10805-018
Baixa agave de fusãoVWR Scientific12001-722
Extrator de micropipeta marrom flamejanteSutter InstrumentsP-97
Sistema de injeção capilar de borosilicatoSutter InstrumentsBF120-69-10
MPPI-3Instrumentação Científica AplicadaMPPI-3
Unidade de contrapressãoInstrumentação Científica AplicadaBPU
Kit de suporte de micropipetaInstrumentação Científica Aplicada InterruptorMPIP
Applied Scientific InstrumentaçãoFSW
MicromanipuladorInstrumentação Científica AplicadaMM33
Base MagnéticaInstrumentação Científica AplicadaBase
Tricaine metano sulfonatoWestern Chemical Inc.MS-222
Microscópio de dissecaçãoOlympusSZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Microscópio confocalOlympusIX-81 com sistema confocal de varredura a laser FV-1000
Eppendorf930001007
Tubos de cultura de vidro (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Argila infantil (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Azul de metilenoVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Placas de PetriFisher ScientificFB0875712
Hemocitômetro ( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
Óleo de imersão tipo ABlue Marble Products51935
CentrifugeEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Fio de pescaStren
96 placa de imagem de poço (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Graxa de alto vácuo (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Microslide (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Lamínulas (18 x 18 mm), N.º 1.5VWR Scientific48366-045
Placa de Petri de 15 cm (plásticos Olympus)Genesee Scientific32-106
Glicerol (produtos químicos EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
Placa de cultura de 24 poços (plásticos Olympus)Genesee Scientific25-107
Peso dos barcos (8,9 cm)VWR Scientific89106-766
de pé Magnética 20X objetiva de microscópio Olympus UPlanSApo 20x/0,75 Tambor de rolo New Brunswick Scientific TC-7 Microloader pontas de pipeta

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

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