Aqui, descrevemos um método para quantificação simultânea de círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão de K (KRECs). O ensaio TREC/KREC pode ser usado como marcador de débito tímico e de medula óssea.
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Artigo de método
Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real
Neste artigo
Resumo
Resumo
círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão K (KRECs) são elementos de DNA circularizados formados durante o processo de recombinação que cria receptores de células T e B. Como os TRECs e KRECs são incapazes de se replicar, eles são diluídos após cada divisão celular e, portanto, persistem na célula. Sua quantidade no sangue periférico pode ser considerada como uma estimativa da produção tímica e da medula óssea. Ao combinar o ensaio TREC bem estabelecido e comumente usado com uma versão modificada do ensaio KREC, desenvolvemos uma PCR quantitativa duplex em tempo real que permite a quantificação de linfócitos T e B recém-produzidos em um único ensaio. O número de TRECs e KRECs é obtido usando uma curva padrão preparada pela diluição em série de juntas de sinal TREC e KREC clonadas em um plasmídeo bacteriano, juntamente com um fragmento do gene da constante alfa do receptor de células T que serve como gene de referência. Os resultados são relatados como número de TRECs e KRECs/106 células ou por ml de sangue. A quantificação desses fragmentos de DNA tem se mostrado útil para monitorar a reconstituição imune após o transplante de medula óssea em crianças e adultos, para melhorar a caracterização de deficiências imunológicas ou para uma melhor compreensão de certas atividades imunomoduladoras de drogas.
Introdução
Círculos excisão do receptor de células T (TRECs) e os círculos a recombinação de excisão-exclusão K (KRECs) são pequenos elementos de ADN circularizado que são excisados, numa proporção de células T e B-, respectivamente, durante um processo de recombinação de DNA genómico, levando à formação de um repertório altamente diversificada de T e receptores de células-B. Eles não têm qualquer função, mas porque eles são estáveis e não pode ser replicado, eles são diluídos após cada divisão celular, persistindo assim em apenas uma das duas células filhas. Portanto, os seus níveis no sangue periférico pode ser assumida como uma estimativa da potência do timo e da medula ós....
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Protocolo
Declaração de Ética: NOTA: Este protocolo segue as diretrizes da nossa instituição, o Spedali Civili di Brescia
1. Elaboração de um "Triple-Insert" plasmídeo
- Selecção e preparação de material de partida apropriado:
- Obter uma amostra contendo células muito susceptíveis de ter TRECs e KRECs detectável por PCR, tal como sangue periférico de um sujeito jovem saudável recolhido em tubos contendo EDTA.
NOTA: Originalmente, tínhamos desenvolvido o método que utiliza para TRECs timócitos e células mononucleares de fragmentos da amígdala para KRECs, mas indivíduos saudáveis costumam ter uma quantidade de TRECs e KRECs su....
- Obter uma amostra contendo células muito susceptíveis de ter TRECs e KRECs detectável por PCR, tal como sangue periférico de um sujeito jovem saudável recolhido em tubos contendo EDTA.
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Resultados
O ensaio foi realizado em uma amostra representativa de 87 controles saudáveis: 42 crianças com idades entre 0-17 (masculino / feminino: 25/17) e 45 adultos com idades entre 24-60 (homens / mulheres: 29/16). Os resultados foram obtidos como TRECs e KRECs por 10 6 PBMC, e, em seguida, os TRECs e KRECs por ml de sangue foram calculados.
O número de TRECs diminui com a idade, devido a involução do timo, 4, em especial de uma forma muito acentuada de 0 a 3 - 4 anos. Em adul.......
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Discussão
A quantificação de TREC e KREC pode ser considerada uma boa estimativa da produção recente de tímico e medula óssea, desde que algumas ressalvas sejam levadas em consideração. Embora um método de quantificação absoluta que emprega a curva padrão exija mais reagentes e mais espaço na placa de reação de PCR em tempo real, ele garante resultados quantitativos altamente precisos porque quantidades de amostra desconhecidas são interpoladas a partir de curvas padrão construídas sobre quantidades conhecidas de material de parti.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores não têm agradecimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | método de separação de gradiente de densidade |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | Extração de DNA |
| Oligonucleotídeos de DNA não modificados HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Ressuspender o produto liofilizado a 100 pmol/µ l | |
| AmpliTaq DNA Polimerase: incluindo 10x Buffer II e 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| Kit de Clonagem TOPO TA para Subclonagem | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Células Competentes de Grau de Subclonagem | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE tampão (1 mM TRIS e 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master | Mix Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Sondas duplas marcadas HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Ressuspender o produto liofilizado a 100 pmol/µ l | |
| Espectrofotômetro NanoDrop 2000c | ThermoFisher | ||
| Aplicador Termociclador Biosystems 2720 | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Sistema de PCR em Tempo Real Fast 7500 | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| Software de Detecção de Sequência SDS 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Referências
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication hist....
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Reimpressões e permissões
