Artigo de método

Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

DOI:

10.3791/52184

⸱

6 de dezembro de 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CREA, Diagnostics Department, Spedali Civili di Brescia

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um método para quantificação simultânea de círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão de K (KRECs). O ensaio TREC/KREC pode ser usado como marcador de débito tímico e de medula óssea.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão K (KRECs) são elementos de DNA circularizados formados durante o processo de recombinação que cria receptores de células T e B. Como os TRECs e KRECs são incapazes de se replicar, eles são diluídos após cada divisão celular e, portanto, persistem na célula. Sua quantidade no sangue periférico pode ser considerada como uma estimativa da produção tímica e da medula óssea. Ao combinar o ensaio TREC bem estabelecido e comumente usado com uma versão modificada do ensaio KREC, desenvolvemos uma PCR quantitativa duplex em tempo real que permite a quantificação de linfócitos T e B recém-produzidos em um único ensaio. O número de TRECs e KRECs é obtido usando uma curva padrão preparada pela diluição em série de juntas de sinal TREC e KREC clonadas em um plasmídeo bacteriano, juntamente com um fragmento do gene da constante alfa do receptor de células T que serve como gene de referência. Os resultados são relatados como número de TRECs e KRECs/106 células ou por ml de sangue. A quantificação desses fragmentos de DNA tem se mostrado útil para monitorar a reconstituição imune após o transplante de medula óssea em crianças e adultos, para melhorar a caracterização de deficiências imunológicas ou para uma melhor compreensão de certas atividades imunomoduladoras de drogas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Círculos excisão do receptor de células T (TRECs) e os círculos a recombinação de excisão-exclusão K (KRECs) são pequenos elementos de ADN circularizado que são excisados, numa proporção de células T e B-, respectivamente, durante um processo de recombinação de DNA genómico, levando à formação de um repertório altamente diversificada de T e receptores de células-B. Eles não têm qualquer função, mas porque eles são estáveis ​​e não pode ser replicado, eles são diluídos após cada divisão celular, persistindo assim em apenas uma das duas células filhas. Portanto, os seus níveis no sangue periférico pode ser assumida como uma estimativa da potência do timo e da medula ós....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Declaração de Ética: NOTA: Este protocolo segue as diretrizes da nossa instituição, o Spedali Civili di Brescia

1. Elaboração de um "Triple-Insert" plasmídeo

  1. Selecção e preparação de material de partida apropriado:
    1. Obter uma amostra contendo células muito susceptíveis de ter TRECs e KRECs detectável por PCR, tal como sangue periférico de um sujeito jovem saudável recolhido em tubos contendo EDTA.
      NOTA: Originalmente, tínhamos desenvolvido o método que utiliza para TRECs timócitos e células mononucleares de fragmentos da amígdala para KRECs, mas indivíduos saudáveis ​​costumam ter uma quantidade de TRECs e KRECs su....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio foi realizado em uma amostra representativa de 87 controles saudáveis: 42 crianças com idades entre 0-17 (masculino / feminino: 25/17) e 45 adultos com idades entre 24-60 (homens / mulheres: 29/16). Os resultados foram obtidos como TRECs e KRECs por 10 6 PBMC, e, em seguida, os TRECs e KRECs por ml de sangue foram calculados.

O número de TRECs diminui com a idade, devido a involução do timo, 4, em especial de uma forma muito acentuada de 0 a 3 - 4 anos. Em adul.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A quantificação de TREC e KREC pode ser considerada uma boa estimativa da produção recente de tímico e medula óssea, desde que algumas ressalvas sejam levadas em consideração. Embora um método de quantificação absoluta que emprega a curva padrão exija mais reagentes e mais espaço na placa de reação de PCR em tempo real, ele garante resultados quantitativos altamente precisos porque quantidades de amostra desconhecidas são interpoladas a partir de curvas padrão construídas sobre quantidades conhecidas de material de parti.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm agradecimentos.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Histopaque-1077Sigma Aldrich SRL10771-500 MLmétodo de separação de gradiente de densidade
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)QIAGEN51106Extração de DNA
Oligonucleotídeos de DNA não modificados HPSF 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l Ressuspender o produto liofilizado a 100 pmol/µ l
AmpliTaq DNA Polimerase: incluindo 10x Buffer II e 25 mM MgCl2Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080261
Kit de Clonagem TOPO TA para SubclonagemInvitrogen/Life-TechnologiesK4500-01
XL1-Blue Células Competentes de Grau de SubclonagemStratagene200130
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1223
SpeI 500UNew England BiolabsR0133S
HindIII-HF 10,000 UNew England BiolabsR3104S
PureYield Plasmid Midiprep SystemPromegaA2492
XhoI 5,000 UNew England BiolabsR0146S
TRIS UtrapureSigma Aldrich SRLT1503
EDTASigma Aldrich SRLE5134
TE tampão (1 mM TRIS e 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR MasterMix Applied Biosystems/Life-Technologies4364338
Sondas duplas marcadas HPLC 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l Ressuspender o produto liofilizado a 100 pmol/µ l
Espectrofotômetro NanoDrop 2000cThermoFisher
Aplicador Termociclador Biosystems 2720Applied Biosystems/Life-Technologies4359659
Sistema de PCR em Tempo Real Fast 7500Applied Biosystems/Life-Technologies
Software de Detecção de Sequência SDS 1.4Applied Biosystems/Life-Technologies

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
  2. Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication hist....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

TREC KREC QuantificationReal time PCR AssayT cell Receptor Excision CirclesK deleting Recombination Excision CirclesThymic Bone Marrow OutputDuplex Quantitative PCRStandard Curve PreparationPeripheral Blood Mononuclear CellsTCR Alpha Constant GeneImmune Reconstitution Monitoring

Artigos relacionados