Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

A capacidade de superfícies PEG-enxertadas para exibir ligantes bioquímicos ligados covalentemente, mantendo simultaneamente propriedades inerentes não sujar torná-los uma escolha ideal para ambientes personalizados microescala engenharia em substratos de cultura ^1,2,3. As interacções bioespecíficas mediadas por ligando conjugado PEG escovas permite a análise minimizam os efeitos de sinais bioquímicos encontrados dentro do complexo em tecidos microambiente in vivo com fenótipos de células individuais. Além disso, a bio-ortogonal "click" químicas pode ser usada para facilitar a imobilização de ligandos direccional de modo a que eles estão apresentados na conformações nativas ^4-6. Assim, a modelagem espacial em microescala de PEG escovas é uma ferramenta versátil para criar projetista em nichos in vitro para investigar a sinalização celular induzida por sinais bioquímicos imobilizados ^6,7.

Um método comum para a geração de padrões espaciais de cu bioquímicaes implica impressão microcontact (μCP) substratos revestidos a ouro com padrões de PEG alcanotióis conjugados. Em seguida, as monocamadas auto-montadas micropatterned (MCS) de PEG-alcanotiois ylated restringe a adsorção física de moléculas bioquímicas, por exemplo, proteínas, apenas para as regiões não modelado do substrato ^8,9. No entanto, as SAM gerados por esta técnica são sensíveis à oxidação a longo prazo em meio de cultura celular. Assim, μCP'd alcanotiol SAMs são muitas vezes mais enxertado com escovas de polímero PEG utilizando a transferência de átomo iniciou-superfície polimerização radical (SI-ATRP) para aumentar a estabilidade não-incrustantes da região ^10. Especificamente, μCP do iniciador de polimerização alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superfícies revestidas com ouro seguido pela SI-PRTA de poli (etileno-glicol), éter metil metacrilato (PEGMEMA) monómeros gera superfícies com micropadronadas longo prazo, estável e não- incrustação PEG escovas. Além disso, estes são capazes de ser ainda modificado para apresentar diversas porções químicas ^11.

Aproveitando essa propriedade, Sha et. ai. desenvolveu um método para projetar substratos de cultura com escovas PEGMEMA multicomponentes apresentando ortogonais "clique" químicas. Neste método, que utilizam uma série de passos μCP / SI-ATRP intercaladas com azida de sódio sequencial, etanolamina, e propargilamina substituições nucleófilas para criar substratos de cultura apresentam padrões de microescala de múltiplos ligandos imobilizados ^6. Embora o potencial de utilização de tais produtos químicos, em conjugação com μCP manual para engendrar novos substratos de cultura é imensa, que é limitada pela precisão e exactidão com que múltiplos passos μCP podem ser alinhadas num único substrato. Um elevado nível de precisão e exactidão seria necessário para fabricar reprodutivelmente complexo em nichos in vitro que utilizam estas técnicas versáteis.

e_content "> Para resolver esta limitação, vários sistemas μCP automatizados e semi-automatizados foram gerados. Chakra et. al. desenvolveu um sistema em que μCP selos personalizados são colocados em um sistema de transporte ferroviário e colocada em contato conformada com lâminas revestidas de ouro, utilizando um atuador pneumático, controlado por computador. No entanto, este método requer a fabricação precisa de selo projetos personalizados e relata uma precisão de 10 mm sem relatório da precisão obtida ao executar múltiplos μCP etapas ^12. Mais recentemente, um método que utiliza um sistema de acoplamento cinemático integrado precisão relatado abaixo de 1 mm usando um único padrão, mas foram incapazes de alinhar com precisão múltiplos padrões, devido a uma falta de controlo preciso de características selo de molde para moldar a ^13. Além disso, ambos os métodos anteriores requerem o substrato para permanecer fixo entre os passos de modelação , assim, limitando significativamente a diversidade de produtos químicos de modificação de superfície que pode serutilizado. Aqui, nós descrevemos um sistema R-μCP automatizado capaz de alinhamento exato e preciso de várias etapas μCP, permitindo flexibilidade máxima em design e fabricação de selo. Além disso, os substratos modelado pode ser repetidamente removida do sistema entre estampadas, permitindo assim a utilização de diversos produtos químicos de modificação do substrato, incluindo substituições nucleófilas sequenciais. Substratos manipuladas usando tais produtos químicos têm sido usados ​​anteriormente para a cultura de células por ambos os nós e os outros ^{7 6,14.} Assim, fundiram-se R-μCP e reacções de substituição nucleofílica sequenciais de desenvolver um método para a fabricação de substratos de cultura escalonável com sinais bioquímicos complexos e micropatterned.

1. Geração elastoméricos selos

1. Para gerar mestres de silício do selo PDMS, padrões de design característica da fotomáscara usando software de desenho assistido por computador.
   1. Design o primeiro padrão como uma matriz de 20 x 20 dos anéis com 300 mm de diâmetro interno (ID) e 600 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro.
   2. Projetar o segundo padrão como 20 x 20 matriz de anéis com 600 mm ID e 900 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro.
   3. Além disso, coloque 1 x 1 milímetro ^duas marcas de referência quadrados em todos os quatro cantos de cada projeto leque espaçados 1.200 mm de centro a centro do padrão de canto em um ângulo de 45 °.
   4. Fabricar os mestres de silício para utilização neste experimento com 1: 1 proporções, correlacionando a uma profundidade de 300 mm característica usando técnicas de litografia padrão detalhados em outros lugares ¹⁵ ou em colaboração com uma fundição de microfluídica.
      NOTA: Característica profundidades menores do que 100 mm pode levar à deformação anormal de carimbos anteriores ao contacto com superfícies de substrato.
      NOTA: Este protocolo começa com ter mestres de silício já obtidos com os padrões descritos de fotorresiste, o que exige equipamento especializado e quartos limpos para criar. É melhor consultar com uma facilidade fabricante ou núcleo para criar esses mestres estampados.
2. Mestres de silício silanizar O / N de incubação com (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapor trichlorosilane.
   NOTA: Silano vapor é altamente tóxico e só deve ser manipulado em uma coifa química.
3. Criar réplicas inversa dos mestres de silício por cura de uma proporção de 10: 1 de PDMS pré-polímero e agente de PDMS em cima dos mestres de silício silanizadas de cura numa placa de Petri S / N a 60 ° C.
4. Remover os selos de PDMS com os mestres de silício, e unir os selos para acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) backings ou qualquer outro material rígidos usando cola.
   NOTA: O material de escolha não necessita de ser transparente ou biocompatível. No entanto, ele deve fornecer uma superfície plana para a interface com o ferramental robótico e maior rigidez do que o PDMS.

2. Preparar Coverslides

1. Coverslides microscópio de enxaguamento (24 milímetros x 50 mm # 1) em tolueno, metanol e sonicado em acetona durante 1 minuto antes da lavagem com etanol e secagem sob uma corrente de azoto suave.
   NOTA: Manusear tolueno e acetona apenas em uma coifa química.
2. Coverslides revestimento com ~ 3,5 nm de titânio (Ti), seguido de 18,0 nm de ouro (Au), utilizando um evaporador de feixe de electrões focado.
   NOTA: Este procedimento é compatível com uma variedade de substratos revestidos a ouro, incluindo silicone e poliestireno. Embora seja possível gerar estes no local, substratos revestidos a ouro, também estão disponíveis através de fornecedores comerciais.
   NOTA: As camadas de Ti deve ser de pelo menos 3 nm de espessura, enquanto Au camadas em substratos deve ser umt menos 5 nm de espessura e pode variar todo o caminho até um milímetro de espessura, dependendo das propriedades ópticas ideais do substrato final ^16,17. Substratos não são obrigadas a ser opticamente transparente para a fabricação; no entanto, isso facilita a análise microscópica de substratos fabricados.
3. Lavar coverslides revestido de ouro com etanol e seco sob atmosfera de azoto suave imediatamente antes da utilização.

3. R-μCP do anel externo

1. Antes R-μCP com o sistema compatível seletivamente braço robótico articulado (SCARA), calibrar os efetores de ferramentas robóticas e sistemas de dupla câmara de acompanhamento, utilizando o software do sistema.
   NOTA: Estes instrumentos são retratados na Figura 1.

Figura 1. R- μCP Sistema e Robotic Arm Tooling. (A) vista em grande escala do sistema de R-μCP com todas as ferramentas e utensílios, (a) chuck vácuo, (b) banho de reagente, (c) para baixo da câmera, (d) fixação de nidificação selo, (e) robótica ferramenta. (B) Braço robótico ferramental retratando (f) ferramenta de gravura com ponta de diamante e (g) ferramenta de sucção pneumática segurando um (h) PDMS selo lastreados em ABS.

2. Colocar manualmente um carimbo de PDMS com 600 mm ID e 900 mm OD saliente anéis face para baixo no suporte de nidificação de selo. Colocar manualmente um coverslide revestido a ouro limpo de fresco no topo do mandril de vácuo, apresentado na Figura 1A, e imobilizá-lo utilizando o vácuo do laboratório ligado.
3. Usando os controles do robô, alinhe a câmera voltada para baixo sobre o ponto central da coverslide revestido de ouro, como na Figura 2A.
   NOTA: Este ponto pode, inicialmente, ser definida por inspecção visual e não requer grande precisão, como o selo PDMS é muito larger do que a lâmina revestida de ouro.
4. Instrua o braço robótico para gravar quatro referência "X" marcas nos vértices de um quadrado com dimensões 3,8 milímetros por 3,8 milímetros centradas no coverslide revestido de ouro usando a ferramenta de ataque com ponta de diamante preso ao braço robótico. (Ilustrado na figura 2B; processo automatizado)
   NOTA: Este garante que todas as quatro marcas de referência estão dentro de um quadro visual da câmera voltada para baixo.
5. Usando as ferramentas de sucção pneumática robôs, pick-up e mantenha os PDMS carimbar 1 mm acima da fixação do assentamento selo como na Figura 2C. (Processo automatizado)
6. Usando a câmera voltada para cima e anel de iluminação LED retratado na Figura 2D e E, visualizar marcas de referência quadrado do selo e identificá-los com o software da câmera 10 vezes, a fim de determinar média X do selo, Y, e angular deslocamento do centro da eixo robô ferramental. (Processo automatizado)
7. Como em NOTA: Um cálculo interno é realizado pelo software do sistema robótico para alinhar precisamente o X da lamela, locais de centro de Y e deslocamentos angulares em futuras etapas R-μCP do selo e.
8. 3.8) Coloque o selo em um banho de alcanotiol iniciador de PRTA, bromoisobutirato ω-mercaptoundecyl (2 mM em etanol) tal como representado na Figura 2F. (Processo automatizado)
9. Remova o selo da solução alcanotiol e colocá-lo sobre o córrego nitrogênio pressurizado para 0,48 bar (5 psi) para evaporar o etanol como na Figura 2G. Após 1 min aumentar a pressão da corrente de azoto é 1,03 bar (15 psi), para assegurar a secura uniforme. (Processo automatizado)
   NOTA: secagem incompleta irá resultar em perda total ou parcial do padrão de fidelidade.
10. Após a secagem, mover o selo através da posição de centro calculado da lâmina revestida de ouro e baixá-lo em incrementos de 100 mm, enquanto monitorar a força do motor no eixo Z como ilustrado na Figura 2H.
    NOTA: Este é comunicada como torque experimentado pelo motor do eixo Z e exibido no software de orientação do robô. (Processo automatizado)
11. Pare de baixar o selo uma vez conseguida a pressão predeterminada de 79,2 kPa, e manter contato com a lâmina revestida de ouro por 15 s. (Processo automatizado)
    NOTA: Os valores de pressão aqui são otimizados para o projeto do selo e recurso de altura atual. Se o desenho de selo é alterada, especificamente em alta carimbos relação de aspecto, de acordo com estes sintonizar por um processo de tentativa e erro.
12. Lentamente, retire o selo da lâmina revestida de ouro e colocar o selo de volta no suporte de nidificação de selo. (Processo automatizado)

4. SI-PRTA de PEGMEMA em micropatterned Coverslides

1. Solte a pressão do vácuo segurando o coverslide micropadronadas, e transferi-lo para um frasco de 50 ml Schlenk. Seal e degas o frasco Schlenk utilizando uma bomba de vácuo.
2. Adicionar 5,5 ml de mistura de reacção contendo o macromonómero PRTA PEGMEMA (208,75 mmol), água (34,4 ml), metanol (43,8 ml), cobre (II), brometo de (1 mmol), e 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) de o balão de Schlenk.
3. Adicionar 0,5 ml de ascorbato de sódio-L (454,3 mM) em água para iniciar a reacção, e permitir que ele continue durante 16 horas à temperatura ambiente sob um gás inerte.
   NOTA: Após a adição de L-ascorbato de sódio, a cor da reacção irá mudar de verde-claro a castanho escuro, como mostrado na Figura 3A-B.
   NOTA: A reacção pode continuar para além de 16 horas, mas não vai aumentar de forma significativa o comprimento das escovas de PEG.

Figura 3. Iniciação de SI-PRTA. (A) A iniciação da reacção e (B) subsequente mudança de cor após a adição de L-ascorbato de sódio. Imagem (C) Microscópio de superfície coverslide micropadronadas seguinte procedimento SI-ATRP. Barra de escala de 1 mm.

4. Remover o coverslide micropadronadas a partir do balão de Schenk e enxagua-se com etanol, água e etanol e seco sob uma corrente suave de azoto.
   NOTA: Seguindo SI-PRTA, modificações de superfície deve ser visível a olho nu e podem ser visualizados e analisados ​​ao microscópio como na Figura 3C.
   NOTA: Este é o método mais simples para testar a precisão do ensaio, uma vez que elimina a necessidade de imunocoloração os substratos.

5. A funcionalização Azide das Cadeias micropatterned PEGMEMA

1. Coloque a coverslide micropadronadas num frasco de 20 ml de reacção de vidro.
2. Adicionar 6 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) contendo 100 mM de azida de sódio para o frasco de reacção. Manter esta reacção a 37 ° C durante 24 h.
   NOTA: Manusear DMF apenas em uma coifa química. Tenha cuidado ao pesando azida de sódio.
3. Após a conclusão, remover o coverslide micropadronadas a partir do frasco de reacção e enxagua-se com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto.

6. Passivation das Cadeias Bromo funcionalizados PEGMEMA

1. Coloque coverslide micropatterned em 20 ml tubos de ensaio de vidro.
2. Adicionar 6 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) contendo 100 mM etanolamina 300 mM de trietilamina e para o frasco de reacção. Manter esta reacção a 40 ° C durante 24 h.
   NOTA: Manusear DMSO, etanolamina e trietilamina, apenas em uma coifa química.
3. Após a conclusão remover o coversl micropadronadaside a partir do frasco de reacção, lavar com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto.

7. R-μCP de Inner Annulus e SI-ATRP de PEGMEMA

1. Levar a cabo passos de R-μCP como anteriormente descrito nos Passos 3.2 e 3,6-3,12, substituindo um selo PDMS com 300 um e 600 um ID OD anéis salientes, de tal modo que as coroas circulares com características menores são colocados no interior dos anéis anteriormente micropadronadas.
   NOTA: O limite de pressão para este selo é 132,0 kPa. Como mencionado anteriormente, esses ajustes de pressão são otimizados para as características de selo a ser utilizado neste experimento.
2. Realizar passos SI-ATRP como anteriormente descrito nos passos 4,1-4,4.

8. O acetileno funcionalização das Cadeias micropatterned PEGMEMA

1. Coloque coverslide micropadronadas em um frasco de 20 ml reação vidro.
2. Adicionar 6 ml de DMSO contendo 100 mMpropargilamina para o frasco de reacção. Manter esta reacção à temperatura ambiente durante 24 horas.
   NOTA: Manusear DMSO e propargilamina apenas em uma coifa química.
3. Após a conclusão remover o coverslide micropadronadas a partir do frasco de reacção e enxagua-se com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto.

9. catalisada por cobre "Clique em" Biotinila�o de acetileno Encerrado Chains PEGMEMA

1. Coloque coverslide micropadronadas em um frasco de 20 ml reação vidro.
2. Adicionar 6 ml de sulfato de cobre (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA, 30 mM) (1: / v de água 1 v / DMF) contendo 562 uM de azida de _PEG-4 biotina conjugado ao frasco de reacção. Adicionar 1,2 ml de ácido L-ascórbico (0,15 mM) em água à mistura para iniciar a reacção.
3. Bolha de azoto através da solução de reacção durante 10 seg, selar o frasco com Parafilm e reagir durante 24 horas à temperatura ambiente.
4. Após completion remover coverslide micropadronadas do frasco de reação, lave com água e coloque-o em um de 12 poços de poliestireno prato.

10. Detecção de imunofluorescência de Biotinylated acetileno Grupos

1. Bloquear coverslide micropadronadas em DPBS (3% Donkey Soro) durante 1 h à TA. Mancha para grupos de acetileno biotinilados com estreptavidina-546 conjugado (2 ug / ml) em DBPS (3% Donkey Soro em PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente.
2. Lavar coverslide micropadronadas 5 vezes com DPBS durante 10 min com agitação suave.
   NOTA: A Figura 4B representa uma imagem da corrediça depois desta etapa é concluída.

11. Cobre-livre "Clique em" Biotinila�o de Azide Encerrado Chains PEGMEMA

NOTA: Se se desejar, esta modificação passo substrato pode ser realizada in situ durante a cultura de células.

1. Deixe coverslide micropadronadas em 12 poços pprato olystyrene seguinte DBPS lavagens.
2. Adicionar 2 ml de DBPS (ou meios de cultura de células) contendo 20 uM DBCO _PEG-4 biotina, e permitir que esta reacção continue durante 24 horas à temperatura ambiente (ou a 37 ° C em uma incubadora).
3. Após a conclusão, lavar coverslide micropadronadas 5 vezes com DPBS (ou simplesmente realizar uma mudança de mídia).

12. Detecção de imunofluorescência de Biotinylated azídicos Grupos

1. Mancha para grupos azida biotinilados com estreptavidina-488 conjugado (2 ug / ml) em 2 ml de DPBS (3% Donkey Soro) durante 2 horas à temperatura ambiente.
2. Lavar coverslide micropadronadas 5 vezes em DPBS durante 10 minutos com agitação suave.
3. Imagem micropatterned coverslide utilizando microscópio de fluorescência confocal. 4A-C mostra imagens do slide após essa etapa for concluída.
   NOTA: Quando utilizar substratos para ensaios de cultura de tecidos, pule seções 10 e 12 do presente protocolo. Após o desejado degree de funcionalização, esterilizar o coverslide manipulado por lavagem ambos os lados com etanol a 100% e a secagem sob uma corrente de azoto. Transferir as lâminas para uma estéril cabine de segurança biológica e lavar a lâmina com PBS cinco vezes antes de prosseguir com a semeadura e cultura de células.

A utilização de técnicas de alinhamento μCP manuais para engenheiro substratos de cultura com matrizes de escovas de PEG-enxertados funcionalizados com ortogonal "clique" químicas tem sido demonstrada em trabalhos anteriores 6. No entanto, este oferece um controle mínimo de orientação padrão e muitas vezes resulta em sobreposição de áreas funcionalizados. Aqui, um novo sistema R-μCP é usado para superar esta limitação, e sua capacidade de precisão padrão de um conjunto de PEG escova anéis com 300 mm ID e 600 mm OD apresentando grupos alcino terminais em uma matriz separada de PEG escova anéis com 600 mm ID e 900 mm OD apresentando grupos azida terminais é demonstrado 14. Seguindo a reacção do alcino apresentando PEG escovas com Azida de PEG-3 -biotina e a reacção de azida de PEG apresentando escovas com DBCO PEG-4 biotina, o substrato foi imunocorada com sondas fluorescentes e fotografada utilizando um microscópio confocal (Figura 4). A análise destas imagens usando um programa MATLAB costume calculado que as duas matrizes escova de PEG foram alinhadas com precisão sub-10 um, ou seja, X ~ 6,4 um, Y ~ 1,7 mm, e θ ~ 0,02 °, que é o fabricante do citado limite do nosso modelo SCARA (ou seja, ~ 10 mm) e indicativo de desempenho anterior do sistema R-μCP 14. Assim, acreditamos que o uso de SCARAs mais sofisticados neste sistema forneceria ainda mais baixa, a resolução sub-micron. Estes resultados demonstram as capacidades de engenharia substrato versáteis habilitados pelo uso combinado do sistema R-μCP e reações de substituição nucleofílica seqüenciais. A reatividade cruzada mínima evidenciado pela marcação fluorescente dos produtos químicos superficiais ortogonais serve para ilustrar o potencial desse sistema para imobilização preciso de pistas bioquímicos para gerar substratos de cultura complexos para aplicações em engenharia de tecidos. </ P>

Figura 2. Diagrama esquemático do processo de R- μCP. (A) virado para baixo câmera visualizando imobilizado lâmina revestida a ouro, marcas (B) de referência gravura sobre coverslide revestido de ouro, (c) remoção do selo PDMS de fixação de nidificação selo, (D - E) visualizando marcas de referência selo PDMS com câmera virada para cima , (F) colocando selo PDMS em alcanotiol banho iniciador, (G) secagem alcanotiol iniciador solvente sobre fluxos de nitrogênio, e (H) stamping alcanotiol selo PDMS revestido em coverslide revestido de ouro.

Figura 4. imunocorados Imagens de micropatterned slide. (A) e azida (B) grupos alcino, biotinilado utilizando isento de cobre e cobre mediada por clique química, e detectado com Estreptavidina-respectivamente 488 e -546. (C) Sobreposição de ambos os canais fluorescentes. Todos escala barras 500 mm.

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.