Introduction
Evnen af PEG-podede overflader for at vise kovalent bundne biokemiske ligander samtidig bevare iboende ikke-fouling egenskaber gør dem til et ideelt valg for engineering brugerdefinerede mikroskala miljøer på kultur substrater 1,2,3. De biospecifikke interaktioner medieret af ligand konjugeret PEG pensler muliggør reduktionistisk analyse af virkningerne af biokemiske signaler inden kompleks in vivo væv mikromiljøerne på individuelle cellefænotyper. Endvidere kan bio-ortogonale "klik" kemiske anvendes til at lette retningsbestemt immobilisering af ligander, således at de præsenteres i native konformationer 4-6. Således mikroskala rumlig mønsterdannelse af PEG børster er et alsidigt værktøj til at skabe designer in vitro nicher at undersøge cellesignalering induceret af immobiliserede biokemiske 6,7 signaler.
En almindelig fremgangsmåde til generering af rumlige mønstre af biokemisk cues indebærer mikrokontakttrykning (μCP) guld-substrater med mønstre af PEG konjugerede alkanthioler. Derefter de mikromønstrede selvsamlede monolag (SAM'er) af PEG-ylated alkanthioler begrænser fysisk adsorption af biokemiske molekyler, fx proteiner, kun til ikke-mønstrede regioner af substratet 8,9. Men SAMS genereret ved denne teknik er følsomme over for oxidation i langsigtet celledyrkningsmedier. Således μCP'd alkanthiol SAMs ofte yderligere podet med PEG polymer børster hjælp overflade-initierede atom transfer radikalpolymerisation (SI-ATRP) for at øge regionens ikke-tilsmudsning stabilitet 10. Specifikt μCP af alkanthiol polymerisation initiator, ω-meraptoundecyl bromisobutyrat på guld overflader efterfulgt af SI-ATRP af poly (ethylenglycol) methylether-methacrylat (PEGMEMA) monomerer genererer overflader med mikromønstrede langsigtet, stabil og ikke- begroning PEG børster. Desuden er disse er i stand til at blive yderligere modificeret til at præsentere forskellige kemiske dele 11.
Drage fordel af denne egenskab, Sha et. al. udviklet en metode til at konstruere kultur substrater med flerkomponent PEGMEMA børster præsenterer ortogonale "klik" kemi. Ved denne metode de bruger en række μCP / SI-ATRP trin spækket med sekventiel natriumazid, ethanolamin, og propargylamin nukleofile substitutioner skabe kultur substrater frembyder mikroskala mønstre af flere immobiliserede ligander 6. Mens potentialet for anvendelse af sådan kemi i forbindelse med manuel μCP at konstruere nye kultur substrater er enorm, er det begrænset af præcision og nøjagtighed med, som kan tilpasses flere μCP skridt på et enkelt substrat. En høj grad af præcision og nøjagtighed vil være forpligtet til at reproducerbart fremstille komplekse in vitro nicher ved hjælp af disse alsidige teknikker.
e_content "> For at løse denne begrænsning, har flere automatiske og halvautomatiske μCP systemer blevet genereret. Chakra et. al. udviklet et μCP system, hvor brugerdefinerede stempler er placeret på et skinnesystem og bringes i overensstemmende kontakt med guld-belagte objektglas med en computer-kontrolleret pneumatisk aktuator. Men denne metode kræver en præcis fremstilling af brugerdefineret stempel designs og rapporterer en 10 um præcision med nogen rapport af den opnåede, når du udfører flere μCP trin 12 nøjagtighed. For nylig en fremgangsmåde, der anvender et integreret kinematisk koblingssystem rapporteret præcision under 1 um ved anvendelse af et enkelt mønster, men var ikke i stand til præcist at tilpasse flere mønstre på grund af mangel på præcis styring af stempel funktioner fra formen for at forme 13. Derudover begge foregående metoder kræver substratet at forblive fastgjort mellem mønsterdannende trin og dermed væsentligt begrænse mangfoldigheden af overflademodificering kemi, der kan væreudnyttes. Her beskriver vi en automatiseret R-μCP system, der kan nøjagtig og præcis justering af flere μCP skridt, samtidig med at maksimal fleksibilitet i stempel design og fabrikation. Endvidere kan de mønstrede substrater gentagne gange fjernes fra systemet mellem udstansning, hvilket tillader anvendelse af forskellige substrat modifikation kemier, herunder sekventielle nukleofile substitutioner. Substrater manipuleret ved hjælp af sådan kemi er blevet anvendt til celledyrkning tidligere af både os 6,14 og andre 7. Således har vi fusioneret R-μCP og sekventielle nukleofile substitutionsreaktioner at udvikle en metode til skalerbar fremstilling af kultur substrater med komplekse og mikromønstrede biokemiske signaler.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering Elastomere Frimærker
- For at generere PDMS stempel siliciumprodukter mestre, designe fotomasken s funktion mønstre ved hjælp af computer-aided design software.
- Designe det første mønster som en 20 x 20 matrix af ringåbningerne med 300 um indvendig diameter (ID) og 600 um OD med 1.200 um center-til-center afstand.
- Design det andet mønster som en 20 x 20 matrix af ringåbningerne med 600 um id og 900 um OD med 1.200 um center-til-center.
- Derudover placerer 1 x 1 mm 2 firkantede referencemærker på alle fire hjørner af hvert array design afstand 1.200 um center-til-center fra hjørnet mønster i en 45 ° vinkel.
- Fabrikere silicium mastere til brug i dette eksperiment med 1: 1 formatforhold, korrelere til en 300 um funktion dybde ved hjælp af standard litografiteknikker beskrevet andetsteds 15 eller i samarbejde med en mikrofluid støberi.
BEMÆRK: Feature dybder mindre end 100 um kan føre til unormal deformation af stempler før kontakt med substratoverflader.
BEMÆRK: Denne protokol begynder med allerede at have opnået silicium mastere med de beskrevne mønstre af fotoresist, som kræver specialudstyr og rene værelser til at skabe. Det er bedst at rådføre sig med en fabricator eller kerne mulighed for at oprette disse mønstrede mestre.
- Silanize silicium mestre O / N ved inkubation med (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) trichlorsilan damp.
BEMÆRK: Silan damp er meget giftigt og bør kun håndteres i et stinkskab. - Skabe inverse kopier af silicium mestre ved hærdning af en 10: 1-forhold mellem PDMS pre-polymer og PDMS hærdemiddel oven på silaniserede silicium mestre i en petriskål O / N ved 60 ° C.
- Fjern PDMS frimærker fra silicium mestre, og binde frimærker acrylonitrilbutadienstyren (ABS) underlag eller andet stift materiales brug af lim.
BEMÆRK: materiale valg behøver ikke at være gennemsigtig eller biokompatible. Dog skal det give en flad overflade for interface med robot værktøj og højere stivhed end PDMS.
2. Forberedelse Coverslides
- Skyl mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) i toluen, methanol og sonikeres i acetone i 1 min før skylning med ethanol og tørring under en blid nitrogenstrøm.
BEMÆRK: Håndter toluen og acetone kun i et stinkskab. - Coat coverslides med ~ 3,5 nm titan (Ti), efterfulgt af 18,0 nm guld (Au) under anvendelse af en fokuseret elektronstråle fordamper.
BEMÆRK: Denne procedure er i overensstemmelse med en række guld-belagte substrater, herunder silicium og polystyren. Selv om det er muligt at generere disse på stedet, guld-substrater er også tilgængelige via kommercielle leverandører.
BEMÆRK: Ti lag skal være mindst 3 nm tyk, mens Au lag på substrater bør være ent mindst 5 nm tykt og kan strække sig hele vejen til 1 mm i tykkelse afhængigt af den ideelle optiske egenskaber af det endelige substrat 16,17. Substrater er ikke forpligtet til at være optisk klar til fremstilling; men det letter mikroskopisk analyse af jern- substrater. - Skyl guldbelagte coverslides med ethanol og tør under blid nitrogen umiddelbart før anvendelse.
3. R-μCP af ydre cirkelring
- Før R-μCP med selektivt kompatibel leddelte robotarm (SCARA) systemet kalibrere robot værktøj effektorer og ledsagende Dual Camera systemer ved hjælp af systemets software.
BEMÆRK: Disse redskaber er afbilledet i figur 1.
Figur 1. R- μCP System og Robotic Arm Tooling. (A) i stor målestok af R-μCP system med alle værktøjer eller tilbehør, (a) vakuum chuck, (b) reagens bad, (c) nedad vender kameraet, (d) stempel nesting stativ, (e) robot værktøj. (B) Robotic arm værktøj afbilder (f) diamant spids ætsning værktøj og (g) pneumatisk sugning værktøj i besiddelse af en (h) ABS-backed PDMS stempel.
- Manuelt placere en PDMS frimærke med 600 um id og 900 um OD fremspringende ringåbningerne forsiden nedad i frimærke nesting stativ. Manuelt placere en frisk renset guldbelagt coverslide på toppen af vakuum chuck, vist i figur 1A, og immobilisere det ved hjælp af den tilsluttede lab vakuum.
- Ved hjælp af robotten kontrol tilpasse nedadvendende kameraet over midtpunktet af guldcoatet coverslide, som i figur 2A.
BEMÆRK: Dette punkt kan i første omgang være defineret ved visuel inspektion og ikke kræver stor nøjagtighed, da PDMS stempel er meget largis end guld-belagte dias. - Instruer robotarmen at ætse fire reference "X" varemærker knudepunkter af en firkant med dimensionerne 3,8 mm x 3,8 mm centreret om guld-belagte coverslide hjælp af diamantværktøj ætsning værktøj fastgjort til robotarmen. (Afbildet i figur 2B; automatiseret proces)
BEMÆRK: Dette sikrer, at alle fire referencemærker er inden for en visuel ramme den nedadgående vender kameraet. - Brug af robotter pneumatiske suge værktøj, afhentning og holde PDMS stamp 1 mm over stempel nesting armaturet som i figur 2C. (Automatiseret proces)
- Brug den opadgående vender kameraet og LED belysning ring afbilledet i figur 2D og E, visualisere stempel Torv referencepunkter og identificere dem med kameraet software 10 gange for at bestemme stempel gennemsnitlige X, Y og kantet forskydning fra midten af robot værktøj akse. (Automatiseret proces)
- Som i
- 3.8) Placer stempel i et bad af alkanthiol ATRP initiator, ω-mercaptoundecyl bromisobutyrat (2 mM i ethanol) som vist i figur 2F. (Automatiseret proces)
- Fjern stemplet fra alkanthiol løsning og placer det over nitrogen strøm under tryk til 0,48 bar (5 psi) for at fordampe ethanol som i figur 2G. Efter 1 min øge nitrogenstrømmen er trykket til 1,03 bar (15 psi) for at sikre ensartet tørhed. (Automatiseret proces)
BEMÆRK: Mangelfuld tørring vil resultere i helt eller delvist tab af mønster troskab. - Efter tørring flytte stempel over beregnede midtpunkt guldcoatet slide og sænk den på 100 um intervaller under overvågning af Z-aksen motor kraft som vist i figur 2H.
BEMÆRK: Dette er kommunikeret som drejningsmoment opleves af Z-aksen motor og vises i robot vejledning software. (Automatiseret proces) - Stop sænke stempel, når det forudbestemte tryk på 79,2 kPa er nået, og holde kontakt med guld-belagte dias til 15 sek. (Automatiseret proces)
BEMÆRK: trykværdierne her er optimeret til den aktuelle stempel design og funktion højde. Hvis stempel design ændres, specielt til højdimensionsforhold frimærker, tune disse i overensstemmelse hermed ved en trial and error proces. - Langsomt fjerne stempel fra guld-belagt slide og placere stemplet tilbage i stemplet nesting stativ. (Automatiseret proces) 4. SI-ATRP af PEGMEMA på mikromønstrede Coverslides
- Slip vakuum pres holder mikromønstrede coverslide, og overføre det til en 50 ml Schlenk-kolbe. Seal og afgasse Schlenk-kolbe under anvendelse af en vakuumpumpe.
- Tilføj 5,5 ml ATRP reaktionsblandingen indeholdende makromonomer PEGMEMA (208,75 mmol), vand (34,4 ml), methanol (43,8 ml), kobber (II) bromid (1 mmol) og 2 ', 2-bipyridin (3 mmol) til Schlenk-kolbe.
- Tilsæt 0,5 ml L-natriumascorbat (454,3 mM) i vand for at initiere reaktionen, og tillader den at fortsætte i 16 timer ved stuetemperatur under indifferent gas.
BEMÆRK: Efter tilsætning af L-natriumascorbat, vil reaktion farveskift fra lysegrøn til mørkebrun som vist i figur 3A-B.
BEMÆRK: Reaktionen kan fortsætte ud over 16 timer, men det vil ikke øge længden af PEG børster. - Fjern mikromønstrede coverslide fra Schenk kolben og skylles med ethanol, vand og ethanol og tørres under en blid nitrogenstrøm.
BEMÆRK: Efter SI-ATRP bør overflademodifikationer være synlige for øjet og kan afbildes og analyseres under et mikroskop som i figur 3C.
BEMÆRK: Dette er den enkleste metode til at teste nøjagtigheden af forsøget, da det overflødiggør behovet for at immunfarve substraterne. - Placer mikromønstrede coverslide i et 20 ml glas reaktionshætteglas.
- Tilsæt 6 ml N, N-dimethylformamid (DMF) indeholdende 100 mM natriumazid til reaktionshætteglasset. Oprethold denne reaktion ved 37 ° C i 24 timer.
BEMÆRK: Håndter DMF kun i et stinkskab. Udvis forsigtighed, når der vejer ud natriumazid. - Ved afslutning, fjern mikromønstrede coverslide fra reaktionen hætteglasset og skyl med ethanol og derefter vand og tør under en nitrogenstrøm.
- Placer mikromønstrede coverslide i 20 ml glas reaktionsglassene.
- Tilsæt 6 ml dimethylsulfoxid (DMSO) indeholdende 100 mM ethanolamin og 300 mM triethylamin til reaktionshætteglasset. Hold denne reaktion ved 40 ° C i 24 timer.
BEMÆRK: Håndtag DMSO, ethanolamin, triethylamin og kun i et stinkskab. - Ved afslutningen fjerne mikromønstrede coverslide fra reaktionen hætteglasset, skylles med ethanol og derefter vand og tør under en nitrogenstrøm.
- Udføre R-μCP trin som tidligere beskrevet i trin 3.2 og 3,6-3,12 substituere en PDMS stempel med 300 um ID og 600 um OD udragende ringrum, således at ringåbningerne med mindre funktioner er anbragt inden for det tidligere mikromønstrede ringåbningerne.
BEMÆRK: Tærsklen pres for dette frimærke er 132,0 kPa. Som tidligere nævnt, er disse trykindstillinger optimeret til stempel funktioner bliver anvendt i dette eksperiment. - Udføre SI-ATRP trin som tidligere beskrevet i trin 4,1-4,4.
- Placer mikromønstrede coverslide i et 20 ml glas reaktionshætteglas.
- Tilsæt 6 ml DMSO indeholdende 100 mMpropargylamin til reaktionen hætteglasset. Oprethold denne reaktion ved stuetemperatur i 24 timer.
BEMÆRK: Håndter DMSO og propargylamin kun i et stinkskab. - Ved afslutningen fjerne mikromønstrede coverslide fra reaktionshætteglasset og skyl derefter med ethanol vand og tør under en nitrogenstrøm.
- Placer mikromønstrede coverslide i et 20 ml glas reaktionshætteglas.
- Tilsæt 6 ml kobbersulfat (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA-, 30 mM) (1: 1 v / v vand / DMF), der indeholdt 562 uM azid-PEG 4 Biotin konjugat til reaktionshætteglasset. Tilsæt 1,2 ml af L-ascorbinsyre (0,15 mM) i vand til blandingen for at initialisere reaktionen.
- Boble nitrogen gennem reaktionsopløsningen i 10 sek, forsegle hætteglasset med Parafilm og reagere i 24 timer ved stuetemperatur.
- Ved completion fjerne mikromønstrede coverslide fra reaktionshætteglasset, skylles med vand og læg den i en 12-brønds polystyrenskål.
- Blokere mikromønstrede coverslide i DPBS (3% Donkey Serum) i 1 time ved stuetemperatur. Stain for biotinylerede acetylen grupper med Streptavidin-546-konjugat (2 ug / ml) i DBP (3% Donkey serum i PBS) i 2 timer ved stuetemperatur.
- Skyl mikromønstrede coverslide 5 gange med DPBS i 10 minutter under forsigtig omrøring.
BEMÆRK: Figur 4B viser et billede af objektglasset efter dette trin er fuldført. - Efterlad mikromønstrede coverslide i 12-godt polystyrene fad efter DBP under skylninger.
- Tilsæt 2 ml af DBP (eller celledyrkningsmedier) indeholdende 20 uM DBCO-PEG 4 Biotin og tillade denne reaktion til at fortsætte i 24 timer ved stuetemperatur (eller ved 37 ° C i en inkubator).
- Ved afslutning, skylles mikromønstrede coverslide 5 gange med DPBS (eller blot udføre et medie ændring).
- Stain for biotinylerede azidgrupper med Streptavidin-488-konjugat (2 ug / ml) i 2 ml DPBS (3% Donkey serum) i 2 timer ved stuetemperatur.
- Skyl mikromønstrede coverslide 5 gange i DPBS i 10 minutter med forsigtig omrøring.
- Billede mikromønstrede coverslide hjælp konfokal fluorescens mikroskop. Figur 4A-C viser billeder af dias efter dette trin er fuldført.
BEMÆRK: Når du bruger substrater for vævskultur assays, springe §§ 10 og 12 i denne protokol. Efter at den ønskede Degree af funktionalisering, sterilisere manipuleret coverslide ved skylning begge sider med 100% ethanol og tørring under en nitrogenstrøm. Overfør dias til en steril biologisk sikkerhed kabinet og skyl slide med PBS fem gange, før du fortsætter med cellepodning og kultur.
5. azid Funktionalisering af mikromønstrede PEGMEMA kæder
6. passivering af Brom funktionaliserede PEGMEMA Kæder
7. R-μCP af indre Cirkelring og SI-ATRP af PEGMEMA
8. Acetylen Funktionalisering af mikromønstrede PEGMEMA kæder
9. Kobber-katalyseret "Klik" Biotinylering acetylen Opsagt PEGMEMA Kæder
10. Immunfluorescerende Påvisning af Biotinylerede Acetylen Grupper
11. Kobber-fri "Klik" Biotinylering af Azide Opsagt PEGMEMA Kæder
BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan dette substrat modifikation trin udføres in situ under cellekultur.
12. Immunfluorescerende Påvisning af Biotinylerede azidgrupper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelsen af manuelle tilpasning μCP teknikker til at konstruere kultur substrater med arrays af PEG-podede børster funktionaliseret med ortogonale "klik" kemier er blevet påvist i tidligere arbejde 6. Men dette giver minimal kontrol mønster orientering og ofte resulterer i overlapning af funktionaliserede områder. Her, er en hidtil ukendt R-μCP system, der anvendes til at overvinde denne begrænsning, og dets evne til præcist mønster et array af PEG børste ringrum med 300 um ID og 600 um OD præsentere terminale alkyngrupper inden for en særskilt række af PEG børste ringrum med 600 um ID og 900 um OD præsentere terminale azidgrupper demonstreres 14. Efter omsætning af alkyn præsentere PEG børster med azid-PEG 3 Biotin og omsætning af azid præsentere PEG børster med DBCO-PEG 4 Biotin blev substratet immunfarvet med fluorescerende prober og afbildes ved hjælp af et konfokalt mikroskop (Figur 4). Analyse af disse billeder ved hjælp af en brugerdefineret MATLAB program beregnet, at de to PEG børste arrays blev rettet med sub-10 um nøjagtighed, dvs X ~ 6,4 um, Y ~ 1,7 um, og θ ~ 0,02 °, hvilket er på fabrikantens citeret grænse vores SCARA model (dvs. ca. 10 um) og tegn på R-μCP systemets ydeevne forudgående 14. Således mener vi, at brugen af mere avancerede SCARAs i dette system vil give endnu lavere, sub-micron opløsning. Disse resultater viser de alsidige substrat tekniske kapaciteter muliggjort af den kombinerede anvendelse af R-μCP systemet og sekventielle nukleofile substitutionsreaktioner. Den minimale krydsreaktivitet fremgår af fluorescerende mærkning af de ortogonale overfladekemier tjener til at illustrere potentialet i dette system til præcis immobilisering af biokemiske signaler til at generere komplekse kultur substrater for vævsdyrkningsapplikationer. </ P>
Figur 2. Skematisk R- μCP Process. (A) Downward vender kameraet visualisere immobiliseret guld-belagte dias, (B) ætsning referencemærkerne på guld-belagte coverslide, (c) fjernelse PDMS frimærke fra stempel nesting armatur, (D - E) visualisere PDMS stempel referencemærker med opadgående vender kameraet (F) anbringelse PDMS stempel i alkanthiol initiator bad, alkanthiol (G) tørring initiator opløsningsmiddel løbet kvælstof streams, og (H) stempling alkanthiol belagt PDMS stempel på guld-belagte coverslide.
Figur 4. immunfarvede Billeder af mikromønstrede dias. (A) azid og (B) alkyngrupper, biotinyleret under anvendelse af kobber-fri og kobber-medieret klik kemi og påvist med streptavidin-488 og -546 hhv. (C) Overlay begge fluorescerende kanaler. Alle skalapanelerne 500 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ideelle substrater for tissue engineering ville blive bioinspirerede og derved rekapitulere den rumlige fordeling af kritiske bioaktive ligander inden de indfødte væv. De ville også have dynamiske egenskaber, der muliggør tidsmæssige justeringer af ligander og de rumlige mønstre, som de præsenteres for at tillade rettet vævsmorfogenese og rumligt begrænsede induktion af celle skæbne. Fabrikation af sådanne substrater kræver immobilisering af flere biokemiske signaler i komplekse og stærkt bestilte retningslinjer for substrater. Mens simulerer alle de endogene faktorer af en celles niche in vitro er urimeligt, R-μCP her beskrevne system giver mulighed for immobilisering af flere regioner af ortogonale bioaktive kemi med mikroskala styring af rumlig orientering.
Nytten af disse substrater stiger yderligere, når overvejer at mens PEG børste arrays bundet med immobiliserede liganderkan fremkalde biospecifikke interaktioner, ubundne PEG børster forbliver modstandsdygtige over for proteinadsorption og kan således tjene til at kontrollere celleadhæsion og migration. Selvom passiv, mikromønstrede adsorption af ekstracellulær matrix (ECM) proteiner eller polymer-PEG-konjugater er en enklere fremgangsmåde til regulering af cellers adhæsion og migration, kun disse teknik transient kontrol, da adsorption er en reversibel proces 11. Også molekyler adsorberes til overflader i uforudsigelige retninger og på tilfældige koncentrationer derved begrænser troskab og kontrol af biospecifikke interaktioner. Endvidere forbindelser typisk anvendes til at skabe ikke-forurenende regioner, såsom bovint serumalbumin eller Pluronic F127, ikke besidder udpeget reaktive steder til yderligere funktionalisering begrænse post-adsorption in situ modifikationer. SAM af alkanthioler kan genereres med sådanne reaktive grupper til ekstra overfladebehandling, men de har også begrænset holdbarhed i vævskultur conditioner på grund af manglen på oxidativ afskærmning gives ved podet PEG børster 10,11. Omvendt sammenlægningen af vores R-μCP platforme med PEG-børste podning og sekventielle nukleofile substitutionsreaktioner giver mulighed for at konstruere substrater med holdbare, mikroskala cytophobic regioner, der kan ændres på forhånd, eller in situ med bio-ortogonal funktionaliteter. Dette vil muliggøre bedre kontrol med biospecifikke interaktioner, der kan regulere in vitro vævsmorfologi og vækst.
En afgørende styrke ved R-μCP sammenlignet med andre systemer til justering sekventielle microcontact oplag er evnen til at fjerne underlaget fra systemet mellem gentagne udstansning, mens du stadig opretholde en høj tilpasning nøjagtighed 12,13. Dette giver en større mangfoldighed i de typer af overfladekemier, der kan anvendes, og varigheden af overfladevand modifikationsreaktioner kan varieres til at tune tætheder af efterfølgende immobiliserede ligander 6. Således kan R-μCP bruges til at etablere fokale koncentrationsgradienter i de biokemiske signaler, der medierer biospecifikke interaktioner 14. R-μCP systemet med kapacitet til præcist at kontrollere både placering og graden af biospecifikke interaktioner, tilbyder en unik metode til at undersøge roller bioaktive ligander i vævsmorfogenese og etablerer et robust system til frembringelse kultur substrater simulerer præsentation af biologiske signaler i in vivo niche.
Et kritisk aspekt af cellulære nicher, specielt inden for udvikling, er spatiotemporale modulation af signalering faktorer 18. Selvom opløselige biokemiske signaler kan sættes til dyrkningsmediet i en tidsmæssigt defineret måde er der begrænset rumlig kontrol over, hvilke celler støder på disse signaler. Med R-μCP her beskrevne system, er det muligt at konstruere mikromønstrede kultur substrater med terminalt functionalized PEG børster præsentere azidgrupper funktionelle grupper, der ikke har nogen effekt på celle skæbne i kultur. Mens azidgrupper er i stand til at undergå kobber-katalyseret "klik" reaktioner med alkyn præsenterer molekyler, kan dette ikke udføres i nærvær af celler i kultur givet toksiciteten af kobber. Men high-strain-molekyler som dibenzocyclooctyne (DBCO) gennemgår en meget selektiv og biokompatible kobber-fri azid-alkyn cycloadditionsreaktion 19,20. Ved konjugation af DBCO indeholdende linkere kan mikromønstrede kultur substrater modificeres in situ med nye biologiske ligander 21. Med evnen til at gengive cytophobic regioner cytophilic eller tilføje forskellige biokemiske signaler til brug i multi-trins signalering procedurer, kultur substrater genereret med denne metode har nye adaptive evner og dermed give en mere robust system til at instruere vævsmorfogenese in vitro.
På trods af den enorme potdifferens- og nytte af R-μCP platform, har det visse ulemper. Brugen af talrige SI-ATRP skridt til at generere PEG-podede substrater øger fabrikation tid i forhold til metoder, der indebærer inkjet print eller mikrosmådråbe aflejring af ECM-proteiner. Mens præcision inkjet trykteknikker konkurrence med den nuværende F-μCP system, adsorption af ECM-proteiner er reversibel hvilket giver mindre kontrol af celle-protein interaktioner. Desuden kan substrater genereret via inkjet trykteknikker ikke fjernes under fabrikation, derved hindre anvendelsen af forskellige underlag modifikation kemier, der tillader for eksempel rumligt begrænsede in situ substrat ændringer 22. På grund af disse begrænsninger inkjet teknikker er bedre egnet til hurtig generering af kultur substrater primært beskæftiger sig med kortvarige, statiske arrangementer af biomolekyler og celletyper 23 hvorimod R-μCP system er meget better velegnet mod generere mangefacetterede substrater designet til at udstille en langsigtet, dynamisk kontrol over begge rumlige og tidslige cellulære interaktioner i 2D med forskellige biologiske ligander.
Mikrokontakttrykning muliggør hurtig aflejring af nano-til-mikroskala "ink" funktioner over store arealer, men der har altid været en betydelig heterogenitet i koncentrationen af deponeret "blæk" stoffer. Dette er også en strømbegrænsning af R-μCP platform som kan observeres i figur 4. Vi hypotesen, at heterogeniteten i fluorescerende modifikation af PEG børster skyldes robottens anvendelse af en ujævn normal kraft over hele PDMS stempel, som er også sandsynligt ikke helt flad. Dette resulterer i ikke-ensartet anlægstryk mellem alle regioner i stempel og substratet hvorved ujævn aflejring af alkanthiol initiator og efterfølgende tykkelse af transplanterede PEG børste. IFor at fremstille PEG-podede substrater med endnu aflejring af alkanthioler og dermed overflade funktionalitet, vil prægeværktøjet design skal optimeres til at anvende en distribueret og ensartet normal kraft over hele PDMS stempel. Dette vil lette ensartet kontakt med guldbelagte slides på tværs af hele interfacet uafhængigt af stempel ufuldkommenheder. Også i figur 4B, kan man iagttage svag krydskontaminering af acetylen grupper på azidet PEG børste. Mens overfladedensiteten af immobiliserede ligander på grund krydskontaminering minimal sammenlignet med den tilsigtede PEG-børste, kan dette reduceres til nær nul ved at øge varigheden af ethanolamin passivering reaktion (se afsnit 6), som vist tidligere 6.
Den primære anvendelse af R-μCP her beskrevne system er til fremstilling af komplekse vævskultur substrater, der kan anvendes til at udøve rumlig og tidsmæssig kontrol of celleskæbnen. Men den høje præcision og nøjagtighed af R-μCP platform gør det til en attraktiv metode til andre applikationer som godt. Evnen til mønster cytophilic områder med differentierede ligand kemi efterfulgt af in situ modifikation af tidligere inaktive, cytophobic regioner giver mulighed for co-kultur af flere cellelinier med stram kontrol over deres rumlige orientering. Dette kombineret med den iboende high-throughput karakter micropatterning præsentere et alternativ til de nuværende metoder til high-throughput screening af både enkelte celler og flercellede kombinationer 24. Mens R-μCP systemet har et stort potentiale i realm af biologi, kan den også anvendes til området for MEMS (MEMS). I MEMS fabrikation, er det ønskeligt at overføre MEMS-komponenter med høj præcision og nøjagtighed til masseproduktion. Med hidtil ukendte kinetiske stempling teknikker, kan R-μCP her beskrevne system tilpasses til effektivt at udskrive componeNTS af silicium eller galliumnitrid på siliciumskiver til brug i generering MEMS 25. Således kan R-μCP platform anvendes til en bred vifte af potentielle anvendelsesmuligheder.
Konklusionen er, at brugen af R-μCP systemet generere PEG-podede kultur substrater ortogonalt funktionaliserede hjælp sekventielle nukleofile substitutionsreaktioner præsenterer ikke kun en ideel platform for potentielt kontrollerende vævsmorfologi og vækst in vitro, men en fremragende system til at undersøge roller multiple bioaktive ligander på celle skæbne. Evnen til mønster flere biokemiske signaler i distinkte og meget bestilt mønstre fastlægger grundlaget for konstruktionen af kultur substrater i stand til at instruere dannelsen af vævsstrukturer med flere celletyper tilrettelægges på micron skala. Dette, kombineret med evnen til at ændre mikromønstrede substrater in situ, kan tillade for uovertruffen styring af vævsmorfogenese og cell skæbne i kultur. Mønsterdannelsen teknikker der er beskrevet her giver et alsidigt system til fremstilling af kultur substrater, der en dag kunne lette rationel og reproducerbar produktion af organotypiske vævsstrukturer in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A.
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
