A abordagem cirúrgica pós-auricular descrita permite a entrega rápida e direta na escala timpânica coclear do camundongo, minimizando a perda de sangue e a mortalidade animal. Este método pode ser usado para terapia coclear usando entrega molecular, farmacológica e viral a camundongos pós-natais através da membrana da janela redonda.
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Artigo de método
Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane
Neste artigo
Resumo
Resumo
A terapia genética, usada para conseguir a recuperação funcional de surdez neurossensorial, promete conceder uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas subjacentes que contribuem para a perda de audição. Introdução de vectores para o ouvido interno deve ser feito de uma maneira que largamente distribui o agente de toda a cóclea ao minimizar lesão das estruturas existentes. Este artigo descreve a abordagem cirúrgica pós-auricular que pode ser utilizado para a terapia da cóclea de rato usando molecular, farmacológica, e entrega viral para ratinhos 10 dias pós-natais e mais velhos através da membrana da janela redonda (VM). Esta abordagem cirúrgica permite a entrega rápida e directa na escala timpânica, minimizando a perda de sangue e evitar a mortalidade animal. Esta técnica envolve negligenciável ou nenhum dano às estruturas essenciais do ouvido interno e médio, bem como os músculos do pescoço, enquanto preservando totalmente a audição. Para demonstrar a eficácia da técnica cirúrgica, a glutam vesicularComeram transportador 3 nocaute (VGLUT3 KO) será utilizado como um exemplo de um modelo de ratinho de surdez congénita que recupera auditiva após a entrega de VGLUT3 para o ouvido interno utilizando um vírus adeno-associado (AAV-1).
Introdução
A terapia genética tem sido sugerida como um potencial tratamento para perda auditiva genética, mas o sucesso nesta área permaneceu uma incógnita 1. Até o momento, as metodologias de forma viral mediadas predominaram devido a capacidade teórica para atingir tipos específicos de células dentro da cóclea relativamente inacessível. Ambos os adenovírus (AV) e vírus adeno-associado (AAV) têm sido utilizadas para a entrega de genes coclear. AAV são vantajosos na cóclea por um número de razões. São vírus deficientes na replicação eficiente e pode transferir moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluindo neurónios, um alvo importante para um cer....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos e manejo de animais respeitadas as diretrizes de ética do NIH e requisitos protocolo aprovado do Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco.
1. Preparar o animal para a cirurgia
- Realizar procedimentos cirúrgicos em um espaço dedicado limpo. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, esterilizar com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia.
NOTA: Neste protocolo, utilize dia pós-natal (10-12 P10-12) camundongos FVB. Diferentes idades e linhagens de camundongos podem ser usados para atender às necessidades de um projeto específico.....
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Resultados
Para verificar as características técnicas e utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP foram entregues em camundongos P10-12 ouvido interno através da VM. Esta abordagem demonstra a expressão do transgene de sucesso dentro das células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 GFP e GFP Figura 3A), células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) e células de suporte (GFP Figur.......
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Discussão
Neste trabalho, nós descrevemos em pormenor uma técnica que pode ser utilizada para terapia génica coclear, com o objectivo de restaurar ou resgatar função auditiva normal, que está comprometida por um defeito genético. Como é tipicamente atraumática, esta abordagem é seguro para a transferência de genes coclear ou outras terapias moleculares potenciais 30. Outras abordagens para a terapia coclear foram descritas, incluindo uma abordagem ventral 24, cocleostomias 31,32 e saco endolinfáti.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por uma doação R21 do National Institutes of Health e por uma doação da Hearing Research, Incorporated.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazina | Fornecida pela UCSF LARC | ||
| Analgesia de carprofeno | fornecida pela UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| pomada oftálmica de dexametasona (TobraDex) | Alcon | ||
| Almofada de aquecimento | Braintree scientific, inc. | ||
| BD | 305127 | 25G | |
| World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | ||
| Sutura PDS*plus Antibacteriano | Ethicon | PDP149 | |
| Cola de tecido (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Coelho Anticorpo Anti-GFP | Invitrogen | A11122 | |
| Microscópio de dissecação | Micropipeta Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown | Extrator de Instrumentos Sutter Modelo | ||
| P-97 | |||
| Sistema TDT BioSig III | Tecnologias |
Referências
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81
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Reimpressões e permissões
