Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Resumo

A abordagem cirúrgica pós-auricular descrita permite a entrega rápida e direta na escala timpânica coclear do camundongo, minimizando a perda de sangue e a mortalidade animal. Este método pode ser usado para terapia coclear usando entrega molecular, farmacológica e viral a camundongos pós-natais através da membrana da janela redonda.

Resumo

A terapia genética, usada para conseguir a recuperação funcional de surdez neurossensorial, promete conceder uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas subjacentes que contribuem para a perda de audição. Introdução de vectores para o ouvido interno deve ser feito de uma maneira que largamente distribui o agente de toda a cóclea ao minimizar lesão das estruturas existentes. Este artigo descreve a abordagem cirúrgica pós-auricular que pode ser utilizado para a terapia da cóclea de rato usando molecular, farmacológica, e entrega viral para ratinhos 10 dias pós-natais e mais velhos através da membrana da janela redonda (VM). Esta abordagem cirúrgica permite a entrega rápida e directa na escala timpânica, minimizando a perda de sangue e evitar a mortalidade animal. Esta técnica envolve negligenciável ou nenhum dano às estruturas essenciais do ouvido interno e médio, bem como os músculos do pescoço, enquanto preservando totalmente a audição. Para demonstrar a eficácia da técnica cirúrgica, a glutam vesicularComeram transportador 3 nocaute (VGLUT3 KO) será utilizado como um exemplo de um modelo de ratinho de surdez congénita que recupera auditiva após a entrega de VGLUT3 para o ouvido interno utilizando um vírus adeno-associado (AAV-1).

Introdução

A terapia genética tem sido sugerida como um potencial tratamento para perda auditiva genética, mas o sucesso nesta área permaneceu uma incógnita ^1. Até o momento, as metodologias de forma viral mediadas predominaram devido a capacidade teórica para atingir tipos específicos de células dentro da cóclea relativamente inacessível. Ambos os adenovírus (AV) e vírus adeno-associado (AAV) têm sido utilizadas para a entrega de genes coclear. AAV são vantajosos na cóclea por um número de razões. São vírus deficientes na replicação eficiente e pode transferir moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluindo neurónios, um alvo importante para um certo número de causas de perda de audição. Entrada de AAV na célula é mediada por receptores específicos ^2; assim, a escolha de um serotipo particular, deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. AAV pode eficazmente transfectar células ciliadas ³ e incorporar no genoma hospedeiro, resultando em estabilidade, expressão de longo prazo do traproteína nsgenic e mudança fenotípica na célula ^4. Embora não seja necessariamente vantajoso para as aplicações de curto prazo, tais como a regeneração de células de cabelo, expressão de longo prazo é muito importante para o salvamento estável de defeitos genéticos. Porque os AAV não estão associados com qualquer doença humana ou infecção e não demonstram ^5,6,7 ototoxicidade, que é um candidato ideal para utilização na terapia de gene para formas herdadas de perda auditiva ^8.

Transferência de material genético exógeno para o ouvido interno de mamíferos utilizando vetores virais tem sido estudada ao longo da última década e está emergindo como uma técnica promissora para o tratamento de ambas as formas genéticas e adquiridas de perda auditiva ^9. A cóclea é potencialmente um alvo ideal para terapia génica, por várias razões: 1) o seu volume pequeno necessita de uma quantidade limitada do vírus necessária; 2) seu relativo isolamento de outros efeitos limites de sistemas de órgãos secundários; e 3) suas câmaras cheias de líquido facilitar viralentrega ao longo do labirinto ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Modelos de ratos com surdez congênita permitir o uso de vários métodos de estudo para monitorar o desenvolvimento do ouvido interno de uma forma sistemática, replicável. Enquanto o pequeno tamanho do rato cochleae não apresenta alguma dificuldade cirúrgica, o mouse funciona como um modelo extremamente importante no estudo de surdez genética, com várias vantagens em relação a outras espécies experimentais ^16. Modelos de ratos permitir a avaliação de um conjunto de características por meio de análise de ligação genética, a coleta de observações morfológicas detalhadas, e simulação de cenários patogénicos; como tal, eles são bons candidatos para a terapia génica mediada por vírus. Estudos genéticos extensas em ratos, combinados com os avanços tecnológicos tornaram possível gerar camundongos geneticamente modificados de forma reproduzíveis em laboratório ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermore, existem inúmeros modelos para ambas adquiridas e herdou auditivos fenótipos perda em ratos, permitindo testes rigorosos neste modelo animal ^{22, 23,24.} Assim, corrigindo audiência usando terapia genética mediada por vírus em um modelo de rato é um primeiro passo adequado na busca de uma cura para a doença humana.

Nós já mostraram que camundongos transgênicos que faltam glutamato vesicular transporter 3 (VGLUT3) nascem surdos devido à falta de liberação de glutamato na fita sinapse IHC ^25. Porque esta mutação não leva a uma degeneração primária das células sensoriais ciliadas, estes ratinhos mutantes são potencialmente um excelente modelo em que para testar a terapia genética coclear para a perda auditiva congênita.

Até à data, foram descritos um número de técnicas de entrega virais para terapia genética coclear, incluindo membrana da janela redonda difusão, injecção membrana da janela redonda, e entrega através de um cocleostomias. Existem potenteial vantagens e desvantagens de cada uma destas abordagens ^9.

Aqui nós relatamos um método cirúrgico para entrega gene viral mediada para o ouvido interno VGLUT3 KO rato através da membrana da janela redonda (VM). O método de injeção RWM pós-auricular é minimamente invasivo, com excelente preservação auditiva, e é relativamente rápido. Como já publicado anteriormente, num esforço para restaurar a audição neste modelo de ratinho, um vector que transporta o gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) foi introduzido na cóclea destes ratinhos surdos, dia pós-natal 12 (P! @), Resultando em a restauração da audição ^26. Ouvindo nos ratos VGLUT3 KO foi verificada por audiometria de tronco encefálico (ABR), enquanto que a expressão da proteína transgene foi verificada através de imunofluorescência (IF). Esta metodologia demonstra, portanto, que a terapia génica mediada por vírus pode corrigir um defeito genético que de outra forma seria resulta em surdez.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos e manejo de animais respeitadas as diretrizes de ética do NIH e requisitos protocolo aprovado do Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco.

1. Preparar o animal para a cirurgia

1. Realizar procedimentos cirúrgicos em um espaço dedicado limpo. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, esterilizar com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia.
   NOTA: Neste protocolo, utilize dia pós-natal (10-12 P10-12) camundongos FVB. Diferentes idades e linhagens de camundongos podem ser usados ​​para atender às necessidades de um projeto específico. Ratos com idade superior a P40 pode ser um desafio, porque o osso bolha fica mais difícil.
2. Anestesiar os ratos com injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg), hidrocloreto de xilazina (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Comece a preparação cirúrgica só depois que o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada. Se necessary, administrar uma dose de reforço (um quinto da dose original) do cocktail de anestésico para restaurar o plano anestésico originais.
   Nota: Tenha cuidado nesta etapa porque a maioria da mortalidade observada nesta idade é causada por overdose de anestésico.
3. Cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica de proteção para manter os olhos úmidos durante a anestesia, suprimindo piscar reflexo do animal.
4. Posicione o mouse com o pescoço estendido sobre uma almofada de aquecimento durante todo o processo até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia.
5. Raspar a região pós-auricular esquerdo com um clipper e desinfectar com álcool 70% e iodopovidona antes de manipulação cirúrgica.

2. O procedimento cirúrgico e Vector Injection

1. Use uma abordagem pós-auricular para expor a bula timpânica. Inciso a tecido subcutâneo com uma tesoura pequena para expor o músculo pós-auricular. Depois de recolher o tecido adiposo para poe lado posterior da incisão, para separar os músculos do lado direito e esquerdo perpendicularmente à incisão para expor o osso temporal. Certifique-se de que esta incisão é tempo suficiente para trabalhar confortavelmente com visualização adequada.
2. Perfurar a bula timpânica com uma agulha de 25 G e expandir o buraco, se necessário com uma pinça por descascar o osso de volta para permitir o acesso ao giro basal da cóclea, e, em seguida, ampliar o suficiente para visualizar a artéria estapediana ea membrana da janela redonda (VM) .
3. Perfurar o VM suavemente no centro com uma pipeta de borosilicato capilar. Observe efluxo fluido através da VM neste ponto; isso é normal. Aguarde até que o efluxo estabilizou (o fluido effluxed da cóclea é seca com um papel de filtro estéril).
   NOTA: Tome cuidado ao segurar e fazer avançar a agulha de vidro para que a perfuração RWM é tão pequeno quanto possível. Dependendo do microscópio utilizado, segurar as pipetas utilizando um micromanipulador ou à mão, utilizando uma pipetatitular.
4. Prepare as pipetas para injecção utilizando uma pipeta extrator da mesma forma que as pipetas de fixação de membranas são preparadas. Certifique-se de que o diâmetro da ponta é grande (cerca de 15 m de diâmetro), de modo que a pipetagem do vírus dentro e para fora é feito facilmente.
5. Elaborar 1-2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP em uma pipeta de injeção. Depois do efluxo é estabilizada (5 a 10 min), microinject este volume fixo na rampa timpânica através do mesmo orifício feito previamente RWM.
6. Selar o nicho RW rapidamente depois de retirar a pipeta com uma pequena porção de músculo e fixe-o com uma pequena gota de cola de tecido colocado no músculo para evitar fugas da janela redonda.
   NOTA: Selar este furo muito bem após a agulha é removida com uma pequena camada de músculo para impedir qualquer fuga de perilinfa a cóclea-este passo é crítico para preservar audição. Falha para selar completamente o VM irá resultar em perda de audição ao longo do tempo.
7. Após a injeção, cobrir oburaco na bula auditivo com o tecido adiposo, os músculos retornar pós-auricular e tecido adiposo para a sua posição normal e suturar a ferida em camadas com uma sutura absorvível 6-0 crómico ou menor.
8. Desinfectar a ferida com iodopovidona.

3. Cuidados Pós-Operatórios

1. Coloque os ratos em uma gaiola quente e não deixá-los abandonados até que sejam totalmente recuperado depois movê-los de volta com a mãe. Recomenda-se a remover o macho da gaiola antes de colocar os filhotes de volta com a mãe.
2. Administrar Carprofeno subcutânea (2 mg / kg) para analgesia pós-operatória e a cada 24 horas depois durante 3 dias, para gerir a inflamação e dor. Monitorar os animais diariamente para sinais de sofrimento, perda de peso anormal, dor ou infecção. Geralmente pelo ^3º dia após a cirurgia todos os ratos devem estar agindo normalmente. Se quaisquer sinais de angústia ou doença aparecer em um rato após o ^3º dia, considerar a eutanásia de tele rato conforme diretrizes institucionais.

4. Avaliação da função coclear Após Parto Viral Usando Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) Recordings

NOTA: O tronco encefálico (ABR) é um potencial auditivo extraído da atividade elétrica em curso no cérebro e gravado através de eletrodos colocados sob o couro cabeludo evocado. O animal é estimulado com som. A gravação resultante consiste de cinco ondas que reflectem a actividade eléctrica dos pontos sucessivos da via auditiva nos primeiros 10 ms após o início do estímulo auditivo.

1. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina.
2. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento durante todo o teste de audição até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia.
   NOTA: Useos seguintes estímulos sonoros nesta experiência: clique (5 ms de duração, 31 de taxa de apresentação Hz).
3. Coloque eletrodos de agulha subdérmicos no vértice, abaixo do pavilhão auricular esquerdo (de referência), e abaixo da orelha contralateral (terra) e começar a gravação ABRs como descrito anteriormente em uma câmara à prova de som ^27,28. Grave ondas ABR em 5 intervalos de nível de pressão sonora dB para baixo de amplitude máxima.
4. Determinar os limiares ABR postoperatively logo aos quatro dias após o parto viral
   NOTA: Threshold é definido como o nível mais baixo de estímulo no qual a resposta picos de ondas I-V foram claramente e repetidamente presente na inspeção visual.
5. Medida da onda I analisar a atividade do nervo coclear. O nível mais baixo estímulo que produz uma forma de onda ABR detectável é definido como o limiar.

5. Coclear Transgene Expression Protein, através de imunofluorescência

1. Anestesiar ratos com uma sobredosagem de intraperitoneal injeção de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina.
2. Decapitar a cabeça somente após o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada.
3. Dissecar o cochleae fora e processo para imunofluorescência todo o monte, como descrito ^26. Um protocolo detalhado do conjunto de montagem coclear imunofluorescência utilizando anticorpos anti-VGLUT3 7a e anticorpos anti-miosina é descrito em Akil et al., 2013 ^29.
4. Para a etiquetagem de GFP, incubar as cocleares inteiras montagens durante a noite a 4 ° C com um anticorpo de coelho anti-GFP em 1: 250 de diluição.
5. Lavar as cócleas duas vezes durante 10 min com PBS e depois incubar durante 2 horas em IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy2 diluído 1: 4000 em PBS.
6. Lavar as cócleas com PBS duas vezes durante 10 minutos e incubar com DAPI durante 15 min.
7. Monte o cochleae em lâminas de vidro e observar under um microscópio com imunofluorescência confocal.

Resultados

Para verificar as características técnicas e utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP foram entregues em camundongos P10-12 ouvido interno através da VM. Esta abordagem demonstra a expressão do transgene de sucesso dentro das células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 GFP e GFP Figura 3A), células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) e células de suporte (GFP Figur...

Discussão

Neste trabalho, nós descrevemos em pormenor uma técnica que pode ser utilizada para terapia génica coclear, com o objectivo de restaurar ou resgatar função auditiva normal, que está comprometida por um defeito genético. Como é tipicamente atraumática, esta abordagem é seguro para a transferência de genes coclear ou outras terapias moleculares potenciais ^30. Outras abordagens para a terapia coclear foram descritas, incluindo uma abordagem ventral ^24, cocleostomias ^31,32 e saco endolinfáti...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazina	Fornecida pela UCSF LARC
Analgesia de carprofeno	fornecida pela UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
pomada oftálmica de dexametasona (TobraDex)	Alcon
Almofada de aquecimento	Braintree scientific, inc.
BD	305127		25G
	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Sutura PDS*plus Antibacteriano	Ethicon	PDP149
Cola de tecido (Vetcode)	Butler Schein	31477
Coelho Anticorpo Anti-GFP	Invitrogen	A11122
Microscópio de dissecação	Micropipeta Leica		MZ95
Flaming/ Brown	Extrator de Instrumentos Sutter Modelo
P-97
Sistema TDT BioSig III	Tecnologias

Pipeta capilar de borosilicato agulha Tucker-Davis