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Floral-Dip Transformação de linho ( Linum usitatissimum) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

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DOI:

10.3791/52189

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19 de dezembro de 2014

 , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de transformar o linho usando Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dip. Este protocolo é simples de executar e barato, ainda produz uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos disponíveis para transformação de linho.

Resumo

Agrobacterium para transformação de plantas mediada por via floral por imersão é uma técnica largamente utilizada no domínio da transformação de plantas e tem sido relatada como sendo bem sucedida para muitas espécies de plantas. No entanto, não foi reportado linho (Linum usitatissimum) transformação por floral por imersão. O objectivo do presente protocolo é estabelecer que Agrobacterium e o método floral por imersão podem ser utilizados para gerar linho transgénico. Mostra-se que esta técnica é simples, de baixo custo, eficiente, e, mais importante, dá uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos de transformação disponíveis linho.

Em resumo, inflorescências de linho foram mergulhadas em uma solução de Agrobacterium transportando um plasmídeo vector binário (fragmento de T-DNA além do Inserção Sequência Linum, LIS-1) para 1 - 2 min. As plantas foram deitadas ao seu lado durante 24 horas. Em seguida, as plantas foram mantidas em condições normais de crescimento até o próximo tratamento. Os process do descenso foi repetido 2-3 vezes, com cerca de 10-14 dias de intervalo entre imersão. As sementes T1 foram colhidas e germinadas em solo. Após aproximadamente duas semanas, progênies tratadas foram testadas por PCR directa; 2 - 3 foram usadas folhas por planta, mais os iniciadores de ADN-T adequadas. Os transformantes positivos foram seleccionados e cultivadas até à maturidade. A taxa de transformação foi inesperadamente alta, com 50 - 60% das sementes de plantas tratadas serem transformantes positivos. Esta é uma taxa de transformação superiores aos relatados para Arabidopsis thaliana e outras espécies de plantas, usando transformação floral-dip. É também o mais elevado, o que tem sido relatada até agora, para a transformação do linho utilizando outros métodos de transformação.

Introdução

Linho (Linum usitatissimum) é uma importante cultura amplamente cultivada para suas fibras e óleos. Transformação do genoma de linho é possível com as técnicas tais como o ferimento, infecção por Agrobacterium, e a co-cultura em cultura de tecidos, a aplicação de partículas biolística de ultra-som ou sonicação seguido por regeneração. No entanto, estas técnicas têm muitas desvantagens, incluindo a tendência para muitos eventos mutacionais e um tempo prolongado para obter as linhas transgénicas. Alguns destes métodos também podem ser caros e requerem manipulação hábil e eficiente dos instrumentos, o que resulta em baixos mudas de recuperação. Mais importante ainda, estes técnica muitas vezes resultam em baixas taxas de transformação 2,6.

Agrobacterium mediada transformação de plantas via floral-dip é uma abordagem simples e eficiente para gerar plantas transgênicas. Tem sido rotineiramente utilizada com sucesso para muitas espécies de plantas, tais como Arabidopsis Thalianum grupo 1,4, Medicago truncatula 11, 12, tomate, trigo e milho 13 10. No entanto, não tem sido pensado como uma técnica viável para a transformação de linho, devido a vários factores, tais como o baixo número de flores produzidas por linho, número limitado de sementes obtidas a partir de cada flor, o grande tamanho da semente, e o revestimento de espessura, que também poderia ser problemático para tal processo de transformação genética. Além disso, o segmento de seleção da técnica floral-dip requer germinação de sementes transformadas em uma mídia de plantas contendo um antibiótico, com progênies transformadas distinguidos com base em sua capacidade de germinação e ficar verde, enquanto progênies não transformada ou não germinam ou germinar mas lixívia rapidamente e morrer. Na literatura corrente, constatou-se que o tipo selvagem linho tende a escapar alta concentração de selecções antibióticos, produzindo resultados falsos positivos, e fazendo a selecção de progênies T1 baseadosobre a resistência aos antibióticos mais difícil 6,14. Além disso, quando uma alta concentração do antibiótico foi adicionado ao meio de selecção, a taxa de transformação observada caiu dramaticamente 9.

Neste protocolo, foi utilizado Agrobacterium e o método floral por imersão para transformar uma linha de fibra de linho, Stormont cirro (responsivo e plástico), que tem sido mostrado para responder a pressões do meio ambiente por alterar o seu genoma 3,5. Para superar o problema de fuga antibiótico, optamos por fazer o teste direto PCR de DNA a partir de folhas T1, em vez de selecção através da adição do antibiótico para a mídia planta. Nós aproveitou a simples anatomia de linho para acompanhar flores específicas no momento do tratamento. Este sistema de rastreio permitiu a seleção de sementes a partir de flores e específicos de germinação no solo, sem a adição de antibióticos. Transformantes positivos foram simplesmente identificados por testes de DNA obtido a partir de folhas, utilizando o método rápido e eficiente of PCR direto. Os nossos resultados demonstram que o método de mergulho floral-funcionou muito bem nesta linha de linho e surpreendentemente resultou em uma taxa muito elevada de transformação (50 - 60%), mais elevada do que a observada anteriormente para Arabidopsis thaliana, que foi relatada como sendo 0,1-1 1%, e também mais elevada do que outras espécies de plantas 10,12. Testamos também uma outra variedade de sementes de linho (linhaça óleo), Bethune (estável e não-responsivos), e os nossos dados preliminares indicam que floral-dip também funciona para essa variedade de linho.

O objetivo deste protocolo é para mostrar que Agrobacterium e floral-dip pode ser usado para gerar linho transgênico. Mostra-se que esta técnica é simples, barato e rápido do que outros métodos de transformação de linho. Mais importante ainda, resulta em uma taxa de transformação muito maior do que os outros métodos de transformação de linho 2,6. A anatomia da Arabidopsis thaliana, que tem muitos ramos e flores, makes difícil distinguir cruzamento e flores não mergulhou na mesma planta. Por isso, um grande número de sementes, cerca de 20.000 sementes por planta, têm de ser pesquisados ​​para identificar os transformantes positivos 8. Linho, por outro lado, tem menos ramos (um ramo principal e alguns ramos laterais) e menos flores, produzindo cerca de 100 sementes por planta, o que torna possível rastrear flores individuais e selecionar sementes específicas durante o processo de triagem.

Propomos que floral-dip é um método aplicável para transformar qualquer espécie relacionados de linho, um gênero de cerca de 200 espécies. Este método dá a taxa de transformação muito mais elevada do que outros métodos de transformação de linho. Também estamos propondo que o rastreio direto PCR de T1 folha DNA é uma maneira eficiente de superar o problema da fuga de resistência a antibióticos, que muitas vezes produz muitos falsos positivos. Rastreio directo de PCR pode ser aplicada a quaisquer outras espécies de plantas, e não está limitado to linho. A técnica de seguimento de sementes simples empregue neste protocolo pode ser aplicado a quaisquer outras espécies de plantas com ramificação semelhante à anatomia linho.

Protocolo

1. cultivar as plantas

  1. 6 semanas antes da imersão, encher vasos de 5 polegadas com o solo e semear sementes de linho ¼ polegada de profundidade no solo (4 sementes por vaso). Certifique-se de firmar o solo sobre as sementes. Regue as plantas regularmente e mantê-los em tempo de verão (luz 14 horas e 10 horas escuro).
  2. Verifique plantas regularmente para inflorescências primárias (clusters de órgãos das flores). As plantas estão prontas para transformação, quando os botões são visíveis e têm apenas formada na inflorescência (Figura 1 e 2). Para ver os gomos, cortar as folhas em torno dele, se necessário.
    NOTA: Usando a melhor fase da flor é crítica e está detalhado na discussão.
    1. Use o principal ramo da planta para o tratamento experimental, uma vez que produz mais flores do que os ramos laterais. Use os ramos laterais ou como controles (não deve ser mergulhado) ou para outros tratamentos experimentais.
    2. Como alternativa, use os principais e secundários ramos damesma planta para o tratamento experimental e usar outra planta como um controle ou para outros tratamentos experimentais. Use etiquetas para marcar ramos individuais e flores individuais com a data e tipo de tratamento.

2. Clonagem e transformação em Escherichia coli (E. coli) Células

  1. Clonar o fragmento / gene de interesse no local de clonagem múltipla de um vector binário vegetal albergando o ADN-T.
    1. Realizar a clonagem em uma etapa ou duas etapas.
      1. Diretamente clonar pequenas inserções neste protocolo (~ 500 pb) no vetor binário planta. Neste protocolo, utilize o vetor binário planta (PRI909). Caso contrário, use quaisquer outros vetores binários de plantas em uma estratégia similar.
      2. Alternativamente, clonar grandes inserções (≥6.5 kb) em duas etapas: primeiro, utilizando um kit de clonagem comercial geral (não específico da instalação), então subclonar dentro do binário vector planta.
  2. Configurar uma reac PCRção para amplificar o gene de interesse. Desenhar os iniciadores com locais de restrição na extremidade 5 '(de acordo com o local de clonagem múltipla do vector binário vegetal em uso).
    1. Realizar um padrão de PCR utilizando ADN genómico de linho com as seguintes condições de ciclo: uma espera inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 94 ° C, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 2 min. Realizar uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C.
    2. Os produtos de PCR separados de 1% de Tris / borato / EDTA (TBE) de gel de agarose, correr o gel a 100 V durante 1 h. Purificar os produtos a partir do gel e quantificar via Nanodrop.
  3. Configure a mistura de ligação para clonar o produto de PCR no vetor de clonagem comercial. Siga o protocolo do fabricante.
  4. Transformar a mistura de ligação em E. quimicamente competente células de E. coli como se segue.
    1. Adicione 2 mL da mistura de ligação em um frasco de chE. emically competente células de E. coli. Incubar em gelo durante 30 min.
    2. Choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C (tempo de choque de calor e a temperatura depende do tipo de células utilizado).
    3. Incubar em gelo e adicione 250 mL de caldo de super RT ideal com catabolite repressão (SOC) médio.
    4. Tapar o tubo e incubar num agitador orbital a 200 rpm a 37 ° C durante uma hora.
    5. Espalhe 10 - 50 ul de cada transformação sobre uma placa pré-aquecida LB (pré-aquecido a 37 ° C) + antibiótico selectivo apropriado (determinar o antibiótico selectivo de acordo com o tipo de vector de clonagem comercial utilizado). Incubar as placas a 37 ° CO / N.
  5. Escolha ~ 10 colônias para mini purificação prep plasmídeo, utilizando um kit comercial. Mini-prep de purificação de plasmídeo é geralmente realizada como se segue.
    NOTA: Os nomes de buffer são específicos para o kit comercial utilizado, mas as suas funções gerais são semelhantes.
    1. Inocular as colónias individuais em 2- 5 ml de meio LB contendo o antibiótico selectivo apropriado (determinado com base no tipo de vector utilizado comercial).
    2. Incubar durante cerca de 8 horas a 37 ° C com agitação vigorosa (~ 300 rpm).
    3. Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min.
    4. Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão a 250 ul. Misture e vortex para dispersar completamente o sedimento.
    5. Lise das células bacterianas através da adição de 250 ul de tampão de lise, misturar bem, invertendo os tubos 4 - 6 vezes.
    6. Neutraliza-se o lisado em tampão de neutralização e a inverter 4 - 6 vezes para misturar. Centrífuga por 10 min a ~ 17.900 xg em um microcentrifuge table-top.
    7. Transfira os sobrenadantes a partir do passo anterior a uma coluna de centrifugação. Centrifugar novamente a ~ 17.900 xg por 30 - 60 seg.
    8. Lava-se a coluna de centrifugação por adição de tampão de lavagem de 0,75 ml e centrifugar por 30 - 60 seg. Descartar o fluxo de passagem.
    9. Centrífuga para um adicional de 1 min a remove tampão de lavagem residual. Coloque a coluna de rotação em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo. Para eluir o ADN, adicionar 50 ul de água para o centro de cada coluna. Deixe descansar por 1 min, e centrifugar por 1 min.

3. Analisar o Purificada plasmídeos para a presença de Insert

  1. Restrição Digest:
    1. Defina-se uma digestão de restrição para determinar a presença da inserção por digestão do plasmídeo com as enzimas de restrição utilizados para clonar o inserto. Uma restrição típico digestão dupla reacção da seguinte forma: 1 ug de plasmídeo purificado, 1 ul de cada uma das enzimas de restrição, 2 ul de 10x tampão de digestão de restrição + 2 ul de BSA (se aplicável), X ul de água (para um total de 20 ul)
    2. Misturar suavemente e incuba-se à temperatura recomendada (varia de uma enzima para o outro).
    3. Analisar a digestão de restrição de reacção em 1% de gel de agarose TBE, executar a 100 V durante 1 h e procurar o abandono de tamanho apropriado.
  2. A análise de PCR:
    1. Defina-se uma PCR com o plasmídeo purificado, utilizando iniciadores da região vector comercial para amplificar interior da inserção ou junção entre o vector e da inserção. Primers comuns são M13 frente e verso, e primers T3 / T7.
    2. Neste protocolo, utilizar as seguintes condições de ciclos de PCR: uma espera inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 94 ° C, seguido de 18 ciclos a 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 2 min. Realizar uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C.
    3. Produtos de Carga de PCR em um 1% TBE em gel de agarose e correr para 100-120 V durante 1 hora.
  3. Sequencing:
    1. Enviar o plasmídeo purificado para um serviço de sequenciação comercial para analisar e confirmar a presença do inserto.
    2. Uma vez que a construção correcta é obtida, utilizá-lo para a segunda etapa de clonagem (na planta vector binário).
      NOTA: As etapas 2,3-3,3pode ser eliminado se a conclusão da clonagem em uma etapa.

4. Clonagem no Binary Vector Vegetal (PRI909) e E. coli Transformation

  1. Defina-se uma digestão dupla reacções de restrição para linearizar o vector binário vegetal e isolar o inserto clonado anteriormente usando os mesmos locais de enzimas de restrição que foram adicionados aos iniciadores (passo 2.2).
  2. Analisar as digestões de restrição usando electroforese em gel, executar a 100 V durante 1 - 2 h. Cortar a inserção e o vector binário vegetal linearizado a partir do gel.
  3. Use um kit comercial para purificar os produtos em gel. Consulte o manual do fabricante.
  4. Configurar uma reacção de ligação para ligar a inserção no vetor binário planta. O inserto para vector proporção depende do tamanho do inserto e o vector binário vegetal. Neste protocolo a inserção LIS1 foi de 6,5 kb e a planta vetor binário foi de 9 kb. Portanto, utilizar uma mistura 1: 2 de inserção relação vector.
  5. Repita os passos de 2,4-3 para a transformação de bactérias, purificação de plasmídeo e análise. Uma vez que a construção correcta (insert + planta vetor binário) é obtido, prossiga para a eletroporação na etapa 5.

5. A electroporação para Agrobacterium tumefaciens células eletro-competentes

  1. Descongelar um frasco de Agrobacterium tumefaciens células eletricamente competentes no gelo.
  2. Adicionar 1 ng de ADN do vector plasmídico binário de 20 ul de células competentes, em gelo, e misturar suavemente.
  3. Refrigere a eletroporação tina 0,1 centímetros no gelo.
  4. Transferir a mistura de célula / DNA competente às cuvetes de electroporação, e toque para recolher a mistura na parte inferior. Coloque a cuvete na máquina electroporador e pulso (condições de tensão e de tempo depende do tamanho de cuvete e o electroporador utilizado).
  5. Adicionar 1 ml de meio SOC e as células de transferência para um tubo de 15 ml.
  6. Incubar durante 1 hora a 28-30° C, agitação a 100 rpm. Placa 50 - 100 ul de células em agar LB + antibiótico selectivo apropriado (dependem do plasmídeo binário planta e a estirpe de Agrobacterium utilizada Neste protocolo de utilização de 50 ug / ml de canamicina e 100 ug / ml de estreptomicina.).
  7. Incubar as placas até 48 horas a 28 - 30 ° C.
  8. Repita o passo 2.5 para seleção colônia e purificação plasmídeo.
  9. Repetir o passo 3 para analisar o plasmídeo e para verificar a integridade da inserção do T-DNA e antes utilizando a construção para floral-imersão. Repita o passo 3.2, utilizando vários iniciadores de PCR em toda a região de inserção inteiro e em todas as regiões de T-DNA e por seqüenciamento como no passo 3.3.
    NOTA: Neste protocolo de 4 diferentes iniciadores foram desenhados através do T-DNA e 10 iniciadores em todo o inserto.
  10. Uma vez que a presença da planta plasmídeo binário na colônia Agrobacterium selecionado for confirmada, células lugar que eun 50% de glicerol e armazenar a -80 ° C. Loja restantes colónias na placa a 4 ° C, se eles são para ser usado dentro de uma semana 7.

6. Floral-dipping

NOTA: 2 dias antes do floral-dipping:

  1. Cultivar células de Agrobacterium para a fase estacionária (OD 600 entre 0,5-1 é aceitável) em LB + antibióticos adequados no meio líquido.
    NOTA: Estes são os mesmos antibióticos como na etapa 5.6, com base no vector binário vegetal e o tipo de estirpe de Agrobacterium utilizada.
  2. Iniciar a cultura com 1: 100 de um diluições saturado (5 ml) O / N e a cultura crescer durante 24-48 horas a 28-30 ° C, agitando a 150 rpm. A cultura deve ter alcançado a fase midlogarithmic e mais provável será que se aproxima ou na fase estacionária 1. OD de aproximadamente 0,8 (novamente OD entre 0,5 a 1 são aceitáveis) 8. Recolher as células por centrifugação a 5.000 xg à temperatura ambiente.
  3. Ressuspender as células em meio de infiltração (5,0% de sacarose + 0,05-0,003% de Silwet L-77). Para a primeira rodada do descenso, use 0,05% Silwet-77. Para a segunda e terceira rondas, para reduzir a concentração de 0,03% (em Discussão detalhada).
  4. Prossiga com o passo floral-dip. Coloque a planta em seu lado e mergulhar apenas os botões visíveis no meio de infiltração para 1-2 min. Deixe a planta do seu lado e cubra-a com filme plástico para manter a umidade alta na cúpula (Figura 3).
  5. No dia seguinte, colocar a planta em posição vertical e manter normalmente.
  6. Quando o broto cresce maior (geralmente depois de cerca de 10-14 dias), repita os passos de 6,1-6,4. Reduzir o tempo de imersão de 30-60 seg e Silwet-77 concentração de 0,003%.
  7. Manter as plantas normalmente até que suas sementes são maduros e prontos para serem recolhidos (Figura 4).

7. Seleção de Tra Positivensformants com PCR direto

  1. Semear as sementes T1 no solo como no passo 1.1.
    1. Como alternativa, fazer Murashige e Skoog sal basal (meio MS), adicionando 2,2 g de MS médio + 4 g de ágar-ágar em 500 ml de água. Autoclave e despeje em pequenos vasos de plantas. Mantenha a 4 ° C até ser utilizado.
    2. Semear a semente, colocando-os no meio MS solidificado. Manter sob longo luz do dia (14 horas de luz e 10 horas de escuro). As sementes germinaram em cerca de 4-6 dias (Figura 5).
    3. Use uma semente de cada flor como um ponto de partida. Se não transformante positivo é obtido, repita este passo, escolhendo outra semente da flor.
      Nota: Teste diferentes sementes das mesmas flores, porque em alguns casos nem todas as sementes de uma flor será transformado. A seleção de sementes adicionais de flores experimentais às vezes é necessário.
  2. Confira nas plântulas regularmente. Em cerca de 10 - 14 dias após a germinação, quando verdadeirodeixa desenvolver, testar as plantas com PCR direto.
  3. Prepare o extrato de folha de DNA por corte 2-3 folhas (5-10 mg de peso) de cada muda e colocá-los em um tubo de microcentrífuga.
  4. Adicionar 180 ul de NaOH 50 mM a cada tubo, e incubar durante 10 min a 95 ° C.
  5. Neutraliza-se o extracto por adição de 20 ul de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0).
  6. Use 1 ul do extracto na reacção directa de PCR, utilizando primers desenhados em todo o T-DNA ou a insero (Figura 7), para seleccionar transformantes positivos.
    1. Neste protocolo, utilizar PCR directo, com uma fixação inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 98 ° C, seguido de 40 ciclos de (98 ° C durante 10 segundos, o passo de recozimento durante 15 segundos, e um passo de extensão a 68 ° C). Execução de uma etapa de extensão final a 68 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. (Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre primers, temperaturas de recozimento e tempos de extensão para os ciclos).
  7. Identificar transformantes positivos e cultivá-las até o vencimento. Se as sementes foram germinadas em meio MS, transplante para o solo em um vaso maior (Figura 5).

Resultados

Figura 1 - 4 ilustram alguns dos passos dentro do protocolo. Nas Figuras 1 e 2, as folhas em torno dos gomos inflorescência são cortados para expor-los para as células de Agrobacterium e as diferentes fases do botão que foram usados ​​para desenvolver o protocolo. A Figura 3 mostra o processo de linho floral por imersão. Figura 4, mostra um exemplo de como os principais ramos laterais e pode ser marcado e como flores indivíduo pode ser rastreados e identificados. A Figura 5 mostra como as progênies T1 pode ser germinadas em meio MS das plantas e, em seguida transplantadas para o solo para a maturidade. A Figura 6 ilustra como wild- Tipo de linho pode escapar altas concentrações de canamicina, confirmando resultados anteriores na literatura 6,9,14.

A Figura 7 mostra um exemplo de amplificação directa por PCR a partir de transformantes positivos T1. As flores T1 foram coletadas a partir do main e laterais brotos de uma única planta T0. Como pode ser visto a partir da PCR directo, 8/12 plantas T1 testaram positivo por PCR e ampliaram as diferentes regiões de todo o T-DNA. Nossos primers também foram projetadas entre os LIS-1 de inserção e os múltiplos locais de clonagem (Figura 7b e C). Foram utilizados iniciadores adicionais a partir do vector binário vegetal para amplificar diferentes segmentos de T-DNA, tais como a fronteira esquerda e o terminador NOS (dados não mostrados) ou o bordo direito e o local de clonagem múltipla (Figura 7D). Os iniciadores específicos para o LIS-1 inserto também foram utilizados neste protocolo (dados não mostrados). Uma lista de iniciadores é fornecida na Tabela 1. No entanto, as sequências destes iniciadores depende da sequência do vector binário vegetal T-DNA e o inserto utilizado para o floral-mergulho. Observamos, também, que não houve diferença significativa na taxa de transformação entre flores recolhidas a partir dos principais e secundários ramos.


Figura 1. Corte as folhas em volta dos botões inflorescência primárias para expô-los às células Agrobacterim. (A) Os botões são cobertos por folhas. (B) folhas foram cortadas em torno dos botões para expô-los. (C) imagem ampliada a partir de planta em (A) após o corte para expor gemas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. As diferentes fases bud que foram utilizados neste protocolo para determinar o melhor palco para usar para o mergulho floral. (A) A fase de botão precoce é approxima tely 2 mm. (B) O broto estágio médio é de aproximadamente 5 mm. (C) O broto fase tardia é de cerca de cerca de 1 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. O processo de linho floral-imersão. (A) As inflorescências primárias são mergulhados na mídia de infiltração contendo as células de Agrobacterium. (B) ampliada a partir de (A). (C) As plantas são mergulhados na horizontal até o dia seguinte, e os ramos de cruzamento são cobertos com plástico para manter alta umidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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. Figura 4. O processo de coletas de rastreamento de flores e sementes, a partir das plantas T0 tratado (A) Um exemplo de toda a planta com o ramo principal (o ramo mais alto do centro) eo lado ramos (B - D). Um . exemplo das flores de diferentes ramos (E) Um exemplo das sementes coletadas a partir de flores individuais (rotulado a - k). do ramo principal Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5. As plântulas T1 são crescidas sem selecção de antibiótico. (A) sementes são T1germinadas na mídia de MS da planta. (B) transformantes positivos, conforme determinado pela PCR direta, são transplantadas para o solo e cresceu para a maturidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. fuga Antibiótico, um problema para a seleção T1, é superada pela triagem PCR direto. (A) do tipo selvagem de linho sementes germinadas em meios MS planta sem antibiótico. (B) do tipo selvagem sementes de linho germinadas em MS media de plantas + concentrações crescentes de canamicina (200 ng / ml, 600 ug / ml, 1 mg / mL). (C) do tipo selvagem de linho sementes germinadas em meios MS planta com 2 mg / ml de canamicina. (D) por PCR a partir do tipo selvagem de linho e T1 mudas, utilizando iniciadores de canamicina, todos amplified os genes canamicina (lendas: EZ1: marcadores de DNA, FlaxS, do tipo selvagem flaxS, C: controlar ramo não-mergulhado, Ma: T1 progênie de flor "a" recolhidos a partir do ramo principal, Sc, Sd, Se, Sf: progênies T1 de diferentes flores "c, d, e, f" coletados a partir do ramo lateral, W:. no-DNA) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 7. Um exemplo de amplificações de PCR bem sucedidos de progênies T1, utilizando o método PCR direto. (A) Diagrama do vetor binário Planta + clonado LIS-1 insert. As setas azuis indicam a posição dos iniciadores de PCR utilizados no rastreio de PCR directo (modificado a partir de Takara). (B) por PCR com os iniciadores M13F + 3 '(C) por PCR com os iniciadores M13R + 18a Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fonte sequência de iniciador de sentido directo sequência 5'-3 ' Fonte sequência iniciadora reversa Sequência 5'-3 ' O recozimento Temprature (° C) Extensão Time (Sec) O tamanho esperado (pb)
M13F (T-DNA) CTGCAAGGCG
ATTAAGTTGG 		3 '(LIS-1 insert) GAGGATGGAA
GATGAAGAAGG 		57 40 450
18-A (LIS-1 insert) TATTTTAACCC
M13R (T-DNA) ATTAGGCACC
CCAGGCTTTA 		57 40 520
MCS (T-DNA) TGGTCATAGC
TGTTTCCTGTG 		RB (T-DNA) TTTAAACTGA
AGGCGGGAAA 		60 20 200
LB (T-DNA) TTTGATGGTG
GTTCCGAAAT 		NOS (T-DNA) GAATCCTGTT
GCCGGTCTT 		60 30 380
NPTII (T-DNA) GCGATACCGT
AAAGCACGAG 		NTPII (T-DNA) GCTCGACGTT
GTCACTGAAG 		65 45 502

Tabela 1. Alguns dos iniciadores utilizados para o teste de PCR directo.

Discussão

Em algumas espécies de plantas, tais como fibras de linho (Linum usitatissimum), a transformação de plantas de sucesso tem sido limitado. Anteriormente, a transformação do linho requerida uma infecção por Agrobacterium e ferindo o co-cultivo, aplicando partículas biolística ou sonicação usando ultra-sons, seguido de regeneração; um processo que é tanto tempo e propenso a ser acompanhados por muitos eventos mutacionais. Além disso, o processo de selecção destas técnicas exige a utilização de marcadores seleccionáveis ​​de antibióticos tais como a canamicina. No entanto, constatou-se na literatura que este método de selecção produz muitos falsos positivos, como o linho tende a escapar altas concentrações de antibióticos 6,9,14. Outra desvantagem das técnicas anteriores na transformação de linho tem sido as baixas taxas de transformação 2,6.

No protocolo descrito aqui, Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dipping foi mostradodar origem a uma elevada taxa de transformação para o linho (50 - 60%). Transformantes foram obtidos a partir de flores de cruzamento e recolhidos de ramos principais e secundários. Selecção dos transformantes positivos foi feita simplesmente por crescimento das plantas T1 no solo e as folhas de triagem logo após eles germinadas, não passa pelo uso de selecção antibiótico, um passo utilizado anteriormente como uma norma em floral por imersão para outras espécies de plantas. Através da realização de um ensaio directo de PCR de folhas, e utilizando os iniciadores de ADN-T adequadas, os transformantes positivos podem ser rapidamente seleccionados. Esta técnica é simples, barato e fácil de realizar, mas resulta numa taxa de transformação muito mais elevado que aqueles descritos anteriormente para Arabidopsis e de outras espécies de plantas utilizando este método 1,10,12. É também a maior taxa de transformação relatado para o linho.

No entanto, há passos críticos nos procedimentos, incluindo a selecção da melhor fase flor e a melhor concentração de tensioactivo, a fim de queo Agrobacterium pode penetrar nas células da planta sem matar os órgãos florais. Se uma fase de botão início é usado (Figura 2A) com elevada concentração de Silwet-77 de mais do que 0,05%, a flor não desenvolveu nem formar sementes. Se o estágio final de enxertia é utilizado (Figura 2C), embora a transformação pode funcionar, ela irá ocorrer a uma taxa muito inferior. Resultados semelhantes foram obtidos com a transformação Arabidopsis dip floral 1,4. Para este protocolo, todos os estádios florais foram testados com diferentes concentrações de Silwet-77 e a melhor fase foi determinada como sendo a fase de botão do meio (Figura 2C) com Silwet-77 a 0,05% para a primeira imersão, seguido por uma segunda imersão em a fase final de bud (Figura 2C), com uma ligeira redução concentração Silwet-77 de 0,03%. A transformação também funcionou bem usando a fase de botão precoce (Figura 2A), com um baixo Silwet-77 concentração de 0,003%, seguido poruma segunda fase de botão de imersão com meio (Figura 2B), a maior concentração de 0,05% de Silwet-77.

Neste protocolo, alguns outros parâmetros foram tentadas para otimizar a taxa de transformação, mas verificou-se que não há efeitos sobre o resultado final. Exemplos incluem o alargamento do tempo após o mergulho que as plantas estava do seu lado e coberto de plástico de um dia para dois dias; usando uma DO de mais do que 1 para a cultura de Agrobacterium, em vez de 0,5-1; aumentando o tempo de imersão para 5 - 15 min em vez de 1 - 2 minutos. Mais uma vez, não ter notado qualquer efeito sobre a taxa de transformação usando essas estratégias. Os fatores mais eficazes, no entanto, foram encontrados para ser o uso de plantas saudáveis ​​nas fases de flores corretas, e usando a melhor concentração Silwet-77. Percebemos que dois intervalos de imersão, de alguma forma funciona melhor do que uma vez, mesmo que um mergulho tempo também funciona.

Modificação para este protocolo pode ser alcançado por reducing a concentração de Silwet-77 para tão pouco quanto 0,003% na segunda ou terceira imersão. Uma vez que o Silwet-77 é tóxico, uma concentração demasiadamente elevada resultados nas flores em desenvolvimento mal, resultando na ausência de produção de sementes. A frequência de imersão pode ser reduzido a um, com o segundo ou terceiro eventos eliminados se as plantas não estão com aspecto saudável e os botões não estão se desenvolvendo bem.

Uma grande limitação desta técnica é o baixo número de flores produzidas por o linho, o número limitado de sementes obtidas a partir de cada flor, e o ciclo de vida longo de linho. Leva 6 - 8 semanas depois da sementeira de sementes para que as gemas primárias imediata para a primeira imersão e um adicional 8 - 10 semanas após a imersão para chegar à geração T1. No total, uma gama de 5 - 6 meses, é necessário para obter a geração T1. Ao contrário de outras espécies de plantas, que florescem em qualquer altura do ano, alguma flor variedades de linho melhor em momentos específicos do ano. Planejamento tão bem planejadas para esta técnica é importante.

Em resumo, os resultados de nossas dip floral com duas variedades de linho diferentes: o linho têxtil, Stormont Cirrus (plástico sensível e), eo linho óleo, Bethune (estável e não-responsivos), mostram que Agrobacterium - a transformação de plantas mediada através floral por imersão é um método aplicável e eficiente para a transformação de linho e pode ser usado para substituir as técnicas utilizadas anteriormente para a transformação de linho. As modificações do método floral-dip neste protocolo será aplicável para uso com quaisquer outras espécies de plantas e não se limitando a linho.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo fundo Ogelbay.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sementes de linho da variedade original Stormont Cirrus (PL)
Vasos
Solo
Estufa com ajuste
Termociclador
de eletroférese de gel de agaroseConfiguração
Silwet-77LEHLE SEEDSVIS-01Tóxico, use luvas
GoTaq Green Master MixPromegaPart# 9PIM712
Terra PCR Direct Polymerase MixClontech639270
Vetor binário PRI 909Takara3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ETakara9115
Kit de clonagem TOPO TAInvitrogenK4595-01
SacaroseFisher Scientific
Electroporator e cubetasBio-Rad165-2092
Shaker
Spinner
Filme plástico e papel alumínio speedSTAR
DNA polimeraseTakaraRR070A/B
QlAquick kit de extração de gelQiagen28704
QIAGEN minikit de plasmídeoQiagen12123
SalI-HF enzimaNEBR3138S
SacI-HF enzimaNEBR3156S
T4 kit de ligação de DNANEBM0202
Murashige SkoogSigmaM5524
AgarFisher ScientificA360-500
de 5" para vasosde luz apropriadoEquipamento de imagem digital

Referências

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Reimpressões e permissões

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