Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Resumo

A coloração com ácido periódico de Schiff é uma técnica que visualiza o conteúdo de polissacarídeos dos tecidos. Este artigo demonstra o protocolo de coloração de Schiff com ácido periódico adaptado para uso em células mononucleares do sangue periférico purificadas de sangue venoso humano. Essas amostras são enriquecidas para linfócitos e outros glóbulos brancos do sistema imunológico.

Resumo

A coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) é uma técnica imuno-histoquímica usada em biópsias musculares e como ferramenta diagnóstica para amostras de sangue. Polissacarídeos como glicogênio, glicoproteínas e glicolipídios coram o magenta brilhante, facilitando a enumeração de células positivas e negativas dentro do tecido. Nas células musculares, a coloração PAS é usada para determinar o conteúdo de glicogênio em diferentes tipos de células musculares, enquanto em amostras de células sanguíneas, a coloração PAS foi explorada como uma ferramenta de diagnóstico para uma variedade de condições. O sangue contém uma proporção de glóbulos brancos que pertencem ao sistema imunológico. A noção de que as células do sistema imunológico possuem glicogênio e o utilizam como fonte de energia não foi amplamente explorada. Aqui, descrevemos uma versão adaptada do protocolo de coloração PAS que pode ser aplicado em células imunes mononucleares do sangue periférico do sangue venoso humano. Foram observadas células pequenas com grânulos positivos para PAS e células maiores com coloração difusa de PAS. O tratamento de amostras com amilase revoga esses padrões, confirmando a especificidade da coloração. Uma técnica alternativa baseada na digestão enzimática confirmou a presença e a quantidade de glicogênio nas amostras. Este protocolo é útil para hematologistas ou imunologistas que estudam o conteúdo de polissacarídeos em linfócitos derivados do sangue.

Introdução

Schiff (PAS) coloração ácido periódico é uma técnica de imuno-histoquímica, que é amplamente utilizado em pesquisas e diagnósticos muscular. Também é utilizada como uma ferramenta de diagnóstico em amostras de sangue. A técnica funciona através da aplicação de uma solução de ácido periódico à amostra, que oxida unidades dentro dos grupos de aldeído de polissacárido criando que reagem com o reagente de Schiff incolor produzindo assim um produto de magenta profunda. Os passos deste processo são mostrados na Figura 1. A mancha transforma nada com polissacarídeos de glicogénio magenta, incluindo, glicoproteínas, glicolipidos, mucinas, ou outras moléculas....

Protocolo

A pesquisa com amostras de sangue humano foi aprovado pela Concordia University Ética Review Board, número do certificado 10000618. O trabalho no músculo do rato foi aprovado pela Concordia University Ética Review Board, número do certificado 2010BERG.

1. PBMC Isolamento de Sangue Total

NOTA: Realizar este procedimento em uma cabine de segurança biológica utilizando uma técnica estéril e equipamentos esterilizados pelo fabricante.

1. Com cuidado, despeje 10-15 ml de sangue total a partir dos tubos de heparina (anticoagulante) de coleta de sangue em um tubo de 50 ml estéril. Para derramamentos de sangue....

Resultados

Para validar os reagentes e técnica básica, coloração PAS foi realizada de acordo com as instruções do fabricante sobre seções musculares rato sóleo. A coloração foi feita mesmo dia que o sacrifício e no último passo da coloração, as secções foram fixadas por xileno. O músculo sóleo é conhecido por conter ~ 35% de glicogénio-positiva células ^9. As células musculares coradas exibido duas grânulos puntiformes Features- PAS positivo distintas dentro da célula, e uma linha contínua demarking da membrana celular <.......

Discussão

Os passos críticos deste artigo de vídeo foram amilase durante a lavagem e tratamento das células. Enquanto lavava os slides, o passo fundamental estava usando uma garrafa de lavagem squeezable plástico e deixando a água correr suavemente através da amostra no slide e não visando diretamente sobre as amostras. Mesmo a menor pressão da água direto faria com que as células para sair do slide. Outro passo importante foi usar a mesma lâmina para ± condições de amilase. Após as PBMC foram aderidos à corrediça, a corrediça fo.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Ácido Periódico de Schiff	Sigma-Aldrich	395B	Leve à temperatura ambiente antes do uso. Os materiais deste kit são tóxicos e prejudiciais. Use cautela.
α-Amilase do pâncreas suíno	Sigma-Aldrich	A3176
Microscópio Binocular	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Kit de Dosagem de Glicogênio	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Polímero sintético não iônico de sacarose.
Centrífuga			Para o isolamento de PBMC, foram utilizados baldes oscilantes.