Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Resumo

A coloração com ácido periódico de Schiff é uma técnica que visualiza o conteúdo de polissacarídeos dos tecidos. Este artigo demonstra o protocolo de coloração de Schiff com ácido periódico adaptado para uso em células mononucleares do sangue periférico purificadas de sangue venoso humano. Essas amostras são enriquecidas para linfócitos e outros glóbulos brancos do sistema imunológico.

Resumo

A coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) é uma técnica imuno-histoquímica usada em biópsias musculares e como ferramenta diagnóstica para amostras de sangue. Polissacarídeos como glicogênio, glicoproteínas e glicolipídios coram o magenta brilhante, facilitando a enumeração de células positivas e negativas dentro do tecido. Nas células musculares, a coloração PAS é usada para determinar o conteúdo de glicogênio em diferentes tipos de células musculares, enquanto em amostras de células sanguíneas, a coloração PAS foi explorada como uma ferramenta de diagnóstico para uma variedade de condições. O sangue contém uma proporção de glóbulos brancos que pertencem ao sistema imunológico. A noção de que as células do sistema imunológico possuem glicogênio e o utilizam como fonte de energia não foi amplamente explorada. Aqui, descrevemos uma versão adaptada do protocolo de coloração PAS que pode ser aplicado em células imunes mononucleares do sangue periférico do sangue venoso humano. Foram observadas células pequenas com grânulos positivos para PAS e células maiores com coloração difusa de PAS. O tratamento de amostras com amilase revoga esses padrões, confirmando a especificidade da coloração. Uma técnica alternativa baseada na digestão enzimática confirmou a presença e a quantidade de glicogênio nas amostras. Este protocolo é útil para hematologistas ou imunologistas que estudam o conteúdo de polissacarídeos em linfócitos derivados do sangue.

Introdução

Schiff (PAS) coloração ácido periódico é uma técnica de imuno-histoquímica, que é amplamente utilizado em pesquisas e diagnósticos muscular. Também é utilizada como uma ferramenta de diagnóstico em amostras de sangue. A técnica funciona através da aplicação de uma solução de ácido periódico à amostra, que oxida unidades dentro dos grupos de aldeído de polissacárido criando que reagem com o reagente de Schiff incolor produzindo assim um produto de magenta profunda. Os passos deste processo são mostrados na Figura 1. A mancha transforma nada com polissacarídeos de glicogénio magenta, incluindo, glicoproteínas, glicolipidos, mucinas, ou outras moléculas com porções de polissacáridos.

Coloração PAS é muitas vezes usado para medir os níveis de glicogênio nas fibras musculares. Cortes de tecidos músculos são ideais para a técnica como eles firmemente anexar ao slide e suportar múltiplas etapas de lavagem e de coloração. O glicogênio é mais presente em contração rápida fibras musculares tipo II, que possuem uma alta demandapara a produção de ATP rápida exigindo glicogênio para ^1,2 desempenho máximo. O glicogénio é um polímero ramificado de glucose que pode ser quebrada em glicose livre através da acção de enzimas de fosforilase de glicogénio. Em tempos de descanso e nutricional-suficiência, o glicogênio é reabastecido através do processo de glycogenesis, enquanto que em tempos de insuficiência nutricional ou de alta demanda de energia; glicogênio é quebrada em glicose por glicogenólise. Já a partir de 1950 os cientistas têm explorado clínico PAS coloração em amostras de sangue para analisar o conteúdo de glicogênio em várias doenças ^3-7. Por exemplo, na doença de Pompe-um armazenamento de glicogénio genuíno glóbulos brancos doen- ças acumular grandes quantidades de glicogénio que difere significativamente dos controles saudáveis ^​​8.

Este vídeo-artigo demonstra uma versão adaptada de coloração PAS para uso em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso de seres humanos saudáveis. PBMCs contêm principalmente linfócitos do linfócito T e B de linfócitos famílias, bem como outras células imunitárias, tais como as células assassinas naturais e monócitos. O primeiro passo de purificação remove os eritrócitos, neutrófilos, granulócitos e outros. Esta técnica fornece dados sobre uma parte do concentrado para a enumeração de linfócitos que permitem mais robusta de células-PAS positivo em relação ao meio de esfregaços de sangue total.

Figura 1:. Passo a metodologia passo de coloração PAS em PBMC (A) Em primeiro lugar, o isolamento de PBMC é conseguido através de um gradiente de Ficoll, no painel da esquerda mostra a preparação antes da centrifugação, o painel direito mostra que após centrifugação, onde o buffy coat contendo as PBMC Observa-se no centro do tubo. (B) isoladas PBMC são fixadas sobre a lâmina utilizando solu fixador formalina-etanolção. A lâmina é cuidadosamente enxaguada com água destilada a partir de um frasco de lavagem de plástico. (C) A lâmina é então colocada em 100 ml de um meio caminho copo cheio com solução de amilase, que irá dissolver glicogénio. A lâmina é lavada delicadamente. (D) A lâmina é tratado com solução de ácido periódico, onde oxidação de sacarídeos ocorre. As lâminas são lavadas suavemente; isto irá remover o excesso de ácido periódico e parar o passo de oxidação. (E) Quando o reagente de Schiff é adicionada às lâminas, que vai reagir com aldeídos criados durante o passo de oxidação. Este reagente incolor irá então resultar em um produto magenta vermelho escuro. As lâminas são lavadas suavemente para remover o excesso de reagente de Schiff.

Protocolo

A pesquisa com amostras de sangue humano foi aprovado pela Concordia University Ética Review Board, número do certificado 10000618. O trabalho no músculo do rato foi aprovado pela Concordia University Ética Review Board, número do certificado 2010BERG.

1. PBMC Isolamento de Sangue Total

NOTA: Realizar este procedimento em uma cabine de segurança biológica utilizando uma técnica estéril e equipamentos esterilizados pelo fabricante.

1. Com cuidado, despeje 10-15 ml de sangue total a partir dos tubos de heparina (anticoagulante) de coleta de sangue em um tubo de 50 ml estéril. Para derramamentos de sangue menores, limpe com DDH ₂ O e 70% EtOH usando tecido de limpeza.
2. Dilui-se o sangue no tubo cónico para uma proporção de 1: 1 com Solução Salina de Tampão Fosfato (PBS 1x), pH 7,4. Certifique-se de que o volume máximo total não exceda 30 ml.
3. Misture delicadamente usando uma pistola de pipeta sorológica evitar bolhas.
   NOTA: Não misture invertendo o tubo para evitar o sangue de umccumulation na tampa e infiltração subsequente durante a centrifugação.
4. Adicionar 13 ml de Ficoll-Paque (ver Materiais e Equipamento tabela), para um novo tubo cónico de 50 ml de capacidade. Mantenha o tubo na posição vertical no rack.
5. Usando uma pipeta, tomar sangue diluído, tocar com a ponta da pipeta de transferência para a parede interior do tubo perto do topo. Com pressão constante e lenta, a transferência do sangue ao longo da parede interior do tubo, formando uma camada de sangue no topo da camada de sacarose. Faça este passo várias vezes até que todo o sangue foi transferido.
6. Tampe o tubo bem e centrifugar o tubo à temperatura ambiente por 30 minutos a 700 xg em um rotor balanço com set aceleração média a 5, e desaceleração de zero.
7. Lentamente, retire o tubo e sem perturbar as camadas, levá-la de volta para a cabine de segurança biológica.
8. Recolher cuidadosamente o creme leucocitário (camada branca nublado fina), onde estão localizados PBMC, colocado entre a PBS / plasma umand ficoll camadas utilizando uma pipeta de transferência. Evite coleta camada de sacarose e não perturbe a camada de células vermelhas do sangue.
9. Transferir o creme leucocitário para um novo tubo de 50 ml estéril. Pode demorar várias vezes de repetir o passo 1.8 para coletar todo o PBMC.
10. Adicionar PBS pH 7,4 para o tubo com a PBMC e encha até à marca de 45 ml. Agitar minuciosamente tubo. Não vortex.
11. Lavar 1: Centrifugar durante 15 minutos a 480 xg tanto com aceleração e desaceleração máxima definida para 9. Observar formação de um sedimento de PBMC na parte inferior do tubo cónico.
12. Descartar o PBS (sobrenadante) para um copo de plástico com 10 ml de lixívia.
13. Solte pellet celular com cuidado "quebrando" contra uma superfície ondulada (ie, rack de vazio). Não vortex.
14. Adicionar 25 ml de PBS fresco de pH 7,4 ao tubo. Se mais de um tubo está a ser processado, reunir os peletes juntamente neste passo.
15. Lave 2: Centrífuga o tubo por 12 min a 480 xg with tanto aceleração máxima e desaceleração definir a 9.
16. Descarte o PBS (sobrenadante) no copo de plástico com um esguicho de água sanitária.
17. Gently "cremalheira" contra uma superfície ondulada (ie, rack de vazio). Não vortex.
18. Adicionar 25 ml de PBS fresco ao tubo.
    1. Retire 50 ul de células e transferir para um tubo de microcentrífuga para contagem de viabilidade.
    2. Adicionar um montante igual (50 ul) de azul de tripan (a mancha de viabilidade) e pipeta cima e para baixo para misture delicadamente.
19. Retire 10 ul e transferi-lo para um hemocitômetro para verificar a viabilidade de células por ml. Grave o número de células / ml.
20. Retirar a quantidade desejada de células e centrifugar o tubo durante 12 minutos a 480 xg tanto com aceleração e desaceleração máxima definida para 9.
21. Descarte o PBS (sobrenadante) no copo com água sanitária.
22. Gently "cremalheira" contra uma superfície ondulada (ie, rack de vazio). Adicionar 80 mL de PBS para o tubo.

2. Fazer o slide PBMC

1. Colocar 80 ul de células numa lâmina de microscópio. Manchar a gota, com a ajuda de uma outra corrediça ou colocar duas gotas de 40 ul cada uma em ambas as extremidades da corrediça.
2. Deixe slide na cabine de segurança biológica para secar. Rotular o slide com um lápis no lado fosco.

3. Fixação das amostras nos slides

1. Preparar a solução fixadora por mistura de 0,5 ml de formaldeído a 37% de etanol 4,5 ml de 99%.
2. Depois as lâminas são secas, tirar 2 ml da solução fixadora frescos e derramar sobre a corrediça de modo que toda a superfície da lâmina é coberta.
3. Deixe a solução no slide por 1 min. Lave o slide para 1 min com água corrente e deixe-o secar ao ar.

4. Fazer a Solução Amylase para Controle Negativo

1. Tome 0,25 g de pó de amilase e dissolver em 50 ml de diágua estava calma. Despeje a solução em um ambiente limpo 100 ml.
2. Imergir a corrediça no recipiente de forma a que metade da corrediça recebe o tratamento e a outra metade permanece sem tratamento e depois incubar durante 15 min à temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Tome nota de que lado do slide está recebendo o tratamento amilase. Desenhar uma linha na parte de trás da lâmina que indica a fronteira entre o tratamento e controlo.
4. Lavam-se as lâminas com _ddH2O para remover a solução de amilase e deixar a lâmina de ar seco.

5. Execute Ácido Periódico de Schiff (PAS) Coloração e Imagem

NOTA: reagentes PAS são tóxicas por inalação e são corrosivos, por isso os passos precisam ser feitos em um exaustor química, e os resíduos devem ser eliminadas de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Coloque o slide em uma superfície plana e despeje 1,50-2,00 ml de solução de ácido periódico sobre a amostra. Incubate durante 5 min à temperatura ambiente.
2. Lavar as lâminas em várias acusações de água destilada.
3. Pour 1,50-2,00 ml de reagente de Schiff sobre a lâmina e incubar-la à temperatura ambiente durante 15 min.
4. Lava-se a lâmina com água destilada durante 5 minutos e deixa-se secar ao ar.
5. Aplicar 10 jul meios de montagem no slide e cubra com duas pequenas lamelas ou aplicar 50 ul e utilizar uma lamela grande.
6. Aplique unha polonês claro nas bordas da lamínula, deixe secar durante a noite.

6. obter imagens com a luz do microscópio binocular Usando o Objetivo 100X

Resultados

Para validar os reagentes e técnica básica, coloração PAS foi realizada de acordo com as instruções do fabricante sobre seções musculares rato sóleo. A coloração foi feita mesmo dia que o sacrifício e no último passo da coloração, as secções foram fixadas por xileno. O músculo sóleo é conhecido por conter ~ 35% de glicogénio-positiva células ^9. As células musculares coradas exibido duas grânulos puntiformes Features- PAS positivo distintas dentro da célula, e uma linha contínua demarking da membrana celular <...

Discussão

Os passos críticos deste artigo de vídeo foram amilase durante a lavagem e tratamento das células. Enquanto lavava os slides, o passo fundamental estava usando uma garrafa de lavagem squeezable plástico e deixando a água correr suavemente através da amostra no slide e não visando diretamente sobre as amostras. Mesmo a menor pressão da água direto faria com que as células para sair do slide. Outro passo importante foi usar a mesma lâmina para ± condições de amilase. Após as PBMC foram aderidos à corrediça, a corrediça fo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Ácido Periódico de Schiff	Sigma-Aldrich	395B	Leve à temperatura ambiente antes do uso. Os materiais deste kit são tóxicos e prejudiciais. Use cautela.
α-Amilase do pâncreas suíno	Sigma-Aldrich	A3176
Microscópio Binocular	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Kit de Dosagem de Glicogênio	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Polímero sintético não iônico de sacarose.
Centrífuga			Para o isolamento de PBMC, foram utilizados baldes oscilantes.