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Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

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DOI:

10.3791/52204

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14 de novembro de 2014

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1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I, University of Münster

Neste artigo

Resumo

As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) são interconectadas por proteínas juncionais específicas formando uma barreira altamente regulada que separa o sangue e o sistema nervoso central (SNC), a chamada barreira hematoencefálica (BBB). O isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais murinas primárias, conforme discutido neste protocolo, permite estudos in vitro detalhados da BHE.

Resumo

A barreira hematoencefálica é ultraestruturalmente montada por uma monocamada de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) interconectadas por um complexo juncional de junções apertadas e aderentes. Juntamente com outros tipos de células, como astrócitos ou pericitos, eles formam a unidade neurovascular (NVU), que regula especificamente o intercâmbio de fluidos, moléculas e células entre o sangue periférico e o SNC. Por meio desse sistema complexo e dinâmico, os BMECs estão envolvidos em vários processos que mantêm a homeostase do SNC. Uma disfunção da BHE é observada como uma etapa essencial na patogênese de muitas doenças graves do SNC. No entanto, as terapias específicas e direcionadas são muito limitadas, pois os mecanismos subjacentes ainda estão longe de serem compreendidos.

Modelos animais e in vitro têm sido amplamente utilizados para obter uma compreensão profunda de processos fisiológicos e fisiopatológicos complexos. Por redução e simplificação, é possível centrar a investigação no assunto de interesse e excluir uma variedade de fatores de confusão. No entanto, a comparabilidade e a transferibilidade também são reduzidas nos sistemas-modelo, que devem ser tidos em conta para a avaliação. Os modelos animais mais comuns são baseados em camundongos, entre outros motivos, principalmente devido às possibilidades cada vez maiores da metodologia. Estudos in vitro de BMECs murinos isolados podem permitir uma análise aprofundada de suas propriedades e da barreira hematoencefálica em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Mais informações sobre os mecanismos complexos da BHE potencialmente fornecem a base para novas estratégias terapêuticas.

Este protocolo descreve um método para isolar células endoteliais microvasculares murinas primárias por uma sequência de etapas de purificação física e química. Considerações especiais para pureza e cultivo de MBMECs, bem como controle de qualidade, aplicações potenciais e limitações são discutidas.

Introdução

Microvascular cerebral células endoteliais (BMEC) formam monocamadas, que são parte integrante do sangue-cérebro-barreira altamente especializado (BBB). BMECs estão interligados por proteínas juncionais ligados a uma membrana basal. Juntamente com os pericitos, células musculares lisas, pés terminais astrocíticos e células sanguíneas circulantes formarem o chamado unidade neurovascular (NVU) 1. Contra o conceito anterior de uma barreira impermeável entre o sangue e o sistema nervoso-central (SNC), o NVU é uma interface dinâmica, altamente específica e regulado, que controla a passagem de fluidos, moléculas e células entre vasos sanguíneos cerebrais e do sistema nervoso central 2 . Uma disfunção ou desregulação do NVU podem iniciar e / ou contribuir para uma variedade de neuro-vasculares, doenças infecciosas, inflamatórias ou degenerativas do sistema nervoso central, tais como acidente vascular cerebral isquémico, HIV-encefalopatia, esclerose múltipla, doença de Parkinson ou de Alzheimer 3-6.

_content "> A monocamada BMEC é hermeticamente fechado por um complexo juncional constituído de apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ) 7. A alta resistência elétrica ea baixa permeabilidade paracelular do BBB se baseiam principalmente nas proteínas TJ 8. Os TJs são complexos formados pelas proteínas transmembranares da família claudina e ocludina, que estão ligadas ao citoesqueleto das células endoteliais por moléculas adaptadoras, tais como os zonulaoccludens (ZO) proteínas ZO1-3 4. junções aderentes são montados, principalmente, pela proteína de membrana integral -cadherin vascular endotelial (VE), que está ligada ao citoesqueleto através cateninas 8.

O fechamento hermético da certificação impede a livre troca de substratos e células entre o sangue e líquor. Exceções a essa regra são lipofílicos moléculas pequenas, com um peso molecular <400 Da, que são capazes de atravessar a certificação por mediada por lipídios difusão 9. A passagem do maior e / oumoléculas hidrófilas, tais como a glucose, aminoácidos, péptidos, proteínas e diversos fármacos é limitada a sistemas altamente controladas de transporte transcelular 10, que podem ser classificadas em cinco categorias principais: transporte mediado por transportador, de transporte de iões, o transporte de efluxo activo, mediado por receptores transporte, e mediada por caveolae transporte 4. Estes sistemas de transportadores de ajudar a manter a homeostasia do sistema nervoso central, o que é necessário para a geração de um sinal preciso, transdução e integração. Além disso, BMECs são capazes de controlar activamente a transição de moléculas distintas pela expressão de uma variedade de ectoenzimas. Estas enzimas estão localizadas na superfície da célula e modificar os substratos endógenos e exógenos específicos impedindo ou permitindo a passagem do BBB 11.

Considerando que o CNS foi considerada como um órgão imunológico privilegiado por um longo tempo, descobertas recentes sugerem um sistema muito dinâmico e fortemente regulamentado de surv imunológicoeillance do SNC. Os BMECs estão criticamente envolvidas na regulação da transmigração de células imunes. Pela expressão de selectinas sobre as suas superfícies linfócitos são induzidos selectivamente para ligar frouxamente ao endotélio. A secreção de quimiocinas que se deparam com receptores específicos na leucócitos leva à expressão ou alterações conformacionais de integrinas de leucócitos, tais como LFA-1 (antigénio de funções de linfócitos associada-1) e VLA-4 (antigénio muito tardio-4). As integrinas mediar uma adesão firme ao ligar seus counterreceptors endoteliais, por exemplo, VCAM-I (molécula de adesão celular vascular), ICAM-I (molécula de adesão intercelular) que permite a transmigração para o parênquima cerebral entre ou através BMECs do BBB 12-14. Estas e outras conclusões sublinham o papel ativo do próprio endotélio na regulação da migração de células imunes.

Além disso, BMECs como parte do NVU estão envolvidos na regulação do fluxo sanguíneo cerebral linked às demandas metabólicas neuronais locais. Após estimulação astrocitário células endoteliais produzem substâncias vasoactivas, tais como o óxido nítrico, conduzindo ao relaxamento das células musculares lisas vasculares 15.

Angiogênese e neurogênese no desenvolvimento, bem como na padronização paralelo adulto show de cérebro e desenvolvimento e compartilham muitas propriedades de regulação 1, 4. As células endoteliais estão criticamente envolvidas nestes processos 16, 17.

Em resumo, BMECs fornecer recursos essenciais para justificar um bom desenvolvimento e funcionamento do SNC. BBB disfunção está ligada a muitas doenças neurológicas graves. No entanto, só muito poucos alvos foram identificados na interface cérebro-vascular para um tratamento específico e eficiente 18. Simplificado modelos in vitro têm sido usados ​​para compreender os mecanismos envolvidos na função e regulação de sistemas fisiológicos complexos para a lotempo ng. O isolamento como descrito por este manuscrito e estudo in vitro de murino BMECs, dada a grande variedade de rato específico nocaute estirpes, pode proporcionar uma maior compreensão da função e regulação BBB em condições fisiológicas e fisiopatológicas que se abrem novos caminhos terapêuticos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelas autoridades locais ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, tierschutz; Recklinghausen, Alemanha") e realizada de acordo com a lei alemã de proteção animal.

1. Comentários gerais para rato Experimentos

  1. Realizar todos os experimentos com ratos, de acordo com as diretrizes do respectivo Comitê Institucional Animal Care e Uso.
  2. Mantenha os ratos sob condições livres de patógenos e capacitá-los a ter acesso a alimentos e água ad libitum.
  3. Use ratos da mesma idade e sexo em grupos experimentais porque as propriedades biológicas podem variar de acordo com idade e sexo.
  4. Sempre que possível tentar reduzir, aperfeiçoar ou substituir experiências com animais.

2. Preparação do gradiente de Percoll

  1. Misturar 19 ml de 1x PBS com 1 ml de PBS 10x, 1 ml de FCS e 10 ml de Percoll.
  2. Realize sterile filtração em um tubo de vidro (diâmetro de poros do filtro: 0,2 um). Depois armazenar a solução a 4 ° C.

3. Preparação de Meio endotélio celular e revestimento de placas de cultura celular

  1. Médio de células endoteliais:
    1. Preparação de 500 ml de meio de: (. Aprox 20%) Misturar 400 mL de meio DMEM (aprox. 80%) com 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 ug / ml; aproximadamente 0,05%), 0,5 ml de heparina (100 ul / ml; aprox. 0,1%) e 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; aprox. 0,1%). Adicionar pyrumycin apenas por meio de cultura de células usados ​​nos primeiros 2 dias de cultura.
    2. Efectuar a filtração estéril num tubo de vidro (diâmetro dos poros do filtro: 0,2 um). Depois armazenar a solução a 4 ° C.
  2. Revestimento de placas de cultura de célula:
    1. Para obter 1 ml de solução de revestimento, se preparar uma solução de 500 ul ddH2O, 400 ul de colagénio IV (0,4 mg / ml) e 100 ul de fibronectina (0,1 mg / ml).
    2. Cubra toda a superfície do each poço da placa de cultura de células com a solução de revestimento. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite.

4. Isolamento de células endoteliais microvasculares de Murino Cérebro (MBMEC)

  1. Sacrifício 10 ratinhos adultos (8-12 semanas de idade, C57BL / 6) por deslocamento cervical. Depois isolar os tapetes do cérebro e loja em 5 ml de PBS (Ressalva: Trabalho estéril).
  2. Remover cérebro caules, cerebelo e tálamo com uma pinça. Retire meninges com cuidado rolando os cérebros em um papel mata-borrão estéril. Recolha os resultantes prosenc�alos meninges-livres.
  3. Transferir os cérebros para um tubo Falcon de 50 ml cheia com 13,5 ml de DMEM.
  4. Picar o tecido, primeiro com uma pipeta de 25 ml, em seguida, com uma pipeta de 10 mL até os meios de comunicação torna-se leitosa.
  5. Em seguida, digerir o tecido com uma mistura de 0,6 ml de colagenase CLS2 (10 mg / ml em DMEM) e 0,2 ml de DNAse (1 mg / ml em PBS) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) durante 1 hora a 37 ° C em um orbital tremerr a 180 rpm.
  6. Adicionar 10 ml de DMEM adicionado à suspensão de tecido e centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  7. Descartar o sobrenadante (Ressalva: PELLET é fácil perder)
  8. Para remover a mielina, ressuspender o sedimento com uma pipeta de 25 ml em 25 ml de DMEM-BSA (20% w / v) (aprox. 25 vezes), e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
  9. Descarte a camada de mielina superior (leitoso), com uma pipeta de Pasteur de vidro quebrado com diâmetro maior, e, em seguida, descartar a camada de BSA com uma pipeta Pasteur normal.
  10. Ressuspender o sedimento em 9 ml de DMEM e adicionar 1 ml de colagenase / dispase (concentração final é de 1 mg / ml) e 0,1 ml de DNAse. Digerir a solução durante 1 hora a 37 ° C num agitador orbital a 180 rpm (ressalva: não utilize a pipeta para ressuspender - células podem ser perdidos).
  11. Durante a digestão, centrifugar a solução de Percoll para definir-se o gradiente de densidade usando uma ultracentrífuga a 3.000 xg durante 1 hora a 4 ° C, com aceleração, wifreio thout.
  12. Adicionar 10 ml de DMEM para a suspensão de células digerido. Centrifugar a suspensão a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de DMEM.
  13. Adicionar as células ressuspensas cuidadosamente no topo do gradiente de Percoll e centrifugar a 700 xg durante 10 min a 4 ° C sem aceleração e de travagem. Nota: As células são visíveis como uma nuvem na interfase.
  14. Tome aprox. 12 ml da interfase com células com uma agulha estéril de comprimento e colocá-lo em um novo Falcon de 50 ml com 5 ml de DMEM.
  15. Centrifuga-se as células novamente em 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Em seguida ressuspender o sedimento em meio de células endoteliais (use aprox. 0,2 ml de meio por 1 cm2 de superfície de placa de cultura celular).
  16. Remover solução de revestimento de placas de cultura de células revestidas (veja o passo 3.2) e enxaguar bem com todos os PBS estéril em duas etapas de lavagem consecutivos.
  17. Manter em culturas de células endoteliaismeio celular a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador estéril. Alterar o médio a cada 2-3 dias. Dividir células a 90% de confluência.

Resultados

Imediatamente após o isolamento, BMECs murino e células contaminantes formar conglomerados que flutuam no meio de cultura celular (Figura 1A, dia 0). O tratamento com pyrumycin leva a uma selecção de BMECs de murino uma vez que expressam elevados níveis de transportadores de efluxo tais como P-glicoproteína que conduz a uma resistência em relação a toxinas. Células contaminantes são muito mais suscetíveis a pyrumycin mediada citotoxicidade 19. Durante o processo de selecção pyrumicin, células contaminantes entrar morte celular apoptótica ou necrótica, enquanto MBMECs começar a prender às colagénio IV / revestidas com fibronectina placas de cultura celular (Figura 1A, dia 1 e dia 2). Até dia 5, os MBMECs proliferam a uma densidade de aprox. 80 - 90%. Eles são caracterizados pela aparência típica em forma de fuso. Na confluência, elas formam uma monocamada de células de contacto inibido não sobrepostos embaladas apertadamente, alinhados longitudinalmente e (Figura 1A, o dia 5). Porpyrumicin selecção, um elevado grau de pureza de até 99% é atingido MBMEC como demonstrado pelo marcador celular endotelial CD31 (PECAM1; Figura 1B). Os MBMECs formar monocamadas estreitamente selados interligados por proteínas de junções apertadas. Após 7-8 dias de cultura, as camadas de células endoteliais construir-se estáveis ​​para valores de resistência eléctrica (atingindo os valores típicos entre 20 - 30 Ω cm x 2). E capacitância (Figura 1C) Neste ponto de tempo de ensaios funcionais, tais como célula.dia experiências de migração 3, 20,21 e permeabilidade testes, por exemplo, com Evans azul ou dextrano, deve ser realizada.

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Figura 1. morfológica e propriedades funcionais de Murino BMECs. (A) Claro tempo Representante da BMECs cultivadas vistos por transmissão de luz microSCOPY mais de 5 dias. Barra de escala aplica-se para todas as imagens. (B) coloração de imunofluorescência para o marcador celular endotelial CD31 no dia 5. CD31 (verde) e DAPI (azul). (C) As células foram pré-cultivados durante 5 dias e depois transferidas para um sistema automatizado para a análise das propriedades biofísicas (resistência e capacitância). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Disfunção hematoencefálica-barreira é uma característica de várias doenças deletérios do SNC, por exemplo, uma repartição do BBB na esclerose múltipla extensivamente facilita a invasão do SNC por células imunes auto-reativas e permite o encontro ea destruição de oligodendrócitos. No AVC isquêmico o rompimento do BBB e subsequente formação de edema cerebral são fatores críticos que influenciam o crescimento do infarto secundário ea sobrevida global dos pacientes 6. Além disso, por alterações da certificação em áreas remotas lesões isquémicas focais são capazes de induzir alterações funcionais generalizados do cérebro. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes são desconhecidos 5. Em contraste, a alta densidade e de diversidade de transportadores de efluxo em BMECs funcionais reduz a concentração de fármacos benéficos, tais como quimioterapêuticos para malignidades do cérebro ou antibióticos para doenças infecciosas. Portanto, uma compreensão mais profunda do cérebro-sangue-barrier função sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é necessária para desenvolver agentes farmacológicos que são capazes de regular especificamente a função de barreira na direcção favorecida 21. Confiável em modelos in vitro do BBB são ferramentas indispensáveis ​​para o estudo dos mecanismos de regulação do BBB.

Muitas linhas de células endoteliais do cérebro imortalizados foram estabelecidos e utilizados como modelos in vitro do BBB 22. Estas linhas celulares oferecem certas vantagens sobre BMECs primários à medida que crescem mais rápido e manter certas características do BBB sobre diversas passagens. No entanto, as linhas de células endoteliais não pode substituir totalmente para células primárias como propriedades importantes são alterados que se misturam com a transferibilidade dos resultados experimentais para a situação in vivo. Por exemplo, a linha de células endoteliais de cérebro de murídeo bEnd.5 expressa apenas baixos níveis de proteínas de junções apertadas distribuídos descontinuamente que conduzem a alta pAraCpermeabilidade ellular 23. BEnd.3, outra linha de células endoteliais do cérebro murino frequentemente utilizado, demonstra junções densas e contínuas distribuídas apertados, uma alta resistência transendotelial, vários transportadores de efluxo e baixa permeabilidade paracelular. No entanto, as camadas de células em comparação com bEnd.3 BMECs primárias não possuem uma verdadeira discriminação no que diz respeito à permeação de certos substratos e transcelular paracelulares 24.

Em preparações de culturas de células primárias, células contaminantes pode interferir significativamente com a validade dos resultados experimentais. No protocolo descrito, pyrumicin é usado como um agente selectivo para as células endoteliais para alcançar uma elevada pureza. No entanto, um controlo de qualidade regular da cultura de células é inevitavelmente necessário para garantir para experiências fiáveis. Existem vários métodos para o controlo de qualidade, além de propriedades morfológicas típicas de células endoteliais (ver Figura 1A), o transendothelial resistência pode ser medida, ou a expressão do marcador de célula endotelial, tais como CD31 (ver Figura 1B) ou factor de von Willebrand (vWF) pode ser avaliada.

O número de células endoteliais cerebrais isoladas a partir de um cérebro de ratinho é relativamente baixo e para estabelecer uma cultura de células adequada para várias experiências, os cérebros dos vários ratos têm de ser reunidas. Na nossa experiência, no mínimo, 10 ratinhos necessitam de ser usado para um ensaio que pode ser um factor limitante, dependendo dos recursos da respectiva instalação para animais. Para evitar viés ou fatores de confusão, apenas camundongos com um fundo genético e ambiental idêntico deve ser agrupadas. Em contraste, bovina e preparações de células endoteliais de cérebro de suíno proporcionar um grande número de células endoteliais do cérebro disponíveis em um cérebro. No entanto, além da criação de simples e de habitação, o repertório amplo e cada vez maior de camundongos transgênicos disponíveis torna murino primário BMECs como um idealmodelo para estudar a função do sangue-cérebro-barreira.

Várias descobertas-chave sobre as funções do BBB e os mecanismos moleculares subjacentes vieram de estudos em sistemas de cultura de tecidos em 2D. Recentemente, sistemas de cultura têm sido desenvolvidos 3D 25, onde as células endoteliais são colocados dentro de uma matriz de colagénio o que lhes permite formar lúmen e redes tubulares. Estes novos sistemas de cultura de células para permitir uma reprodução mais precisa dos processos vasculares no organismo intacto in vivo. O envolvimento de outras células dos NVU em 3D sistemas de cultura de células, tais como pericitos e astrócitos pode revolucionar a estudar in vitro da função sangue-cérebro-barreira; primeiros modelos foram desenvolvidos recentemente 26.

Há algumas recomendações para a solução de problemas. Em primeiro lugar de trabalho estéril é essencial para a qualidade da cultura de células endoteliais. Em segundo lugar, pyrumycin só deve ser adicionado para celularmeio de cultura utilizado nos primeiros 2 dias de cultura, mais aplicação pode conduzir a um aumento da morte celular e MBMEC função de barreira baixa qualidade. Em terceiro lugar, as enzimas aplicadas neste protocolo deve ser utilizado e armazenado de acordo com as instruções do fabricante; caso contrário, sua função adequada pode ser comprometida. Além disso, o revestimento de placas de cultura de células pode ser alterado se as células endoteliais não atribuem. As concentrações de fibronectina e colagénio pode ser alterada ou outras proteínas de matriz pode ser adicionado à solução de revestimento. Por último, idade, sexo, estação do ano e condições ambientais dentro das instalações dos animais, são fatores importantes que podem influenciar a qualidade de MBMEC isolamento ea comparabilidade dos experimentos. Deve assegurar-se que as condições são comparáveis ​​entre experimentos independentes.

O protocolo descrito deve ser considerado como um método básico para isolar neuroimunológicos BMECs murino. As células isoladas podem ser used para uma ampla variedade de aplicações para obter mais conhecimentos sobre a função BBB, tais como ensaios de migração, gene e estudos de expressão de proteínas, eletrofisiológica ou experimentos de permeabilidade. Como mencionado acima, 3D sistemas de cultura de células de BMECs pode proporcionar novas oportunidades para estudar os complexos mecanismos envolvidos na regulação da certificação no âmbito do NVU. Por isso, o isolamento de células endoteliais primárias permanecerá uma técnica valiosa no campo da investigação certificação no futuro.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), células em movimento Cluster de Excelência (EXC 1003 - CIM), da Universidade de Muenster (a SB e SGM) e pela Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB e SGM). Agradecemos Heike Blum pelas excelentes ilustrações.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
bFGFPeprotech100-18BFator básico de crescimento de fibroblastos
BSASigma AldrichA9418Albumina sérica bovina
Colagenase CLS2WorthingtonLS004176Alto nível relativo de atividade da protease
Colagenase-dispaseRoche10269638001Colagenase de V. alginolyticus, Dispase de B. polymyxa
Collagen IVSigma AldrichC0543De Engelbreth-Holm-Swarm membrana basal de sarcoma murino
DMEMSigma AldrichD5030Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
DNAseSigma AldrichD4513Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino
FCSSigma AldrichF6178Soro fetal de bezerro (também chamado de soro fetal bovino)
HeparinaSigma AldrichH3393Anticoagulante
PDSFirst Link UK Ltd.60-00-850Soro derivado do plasma
PercollSigma AldrichP1644Quente à temperatura ambiente antes do uso
PirumicinaSigma AldrichP8833Deve ser usado apenas nos primeiros 2 dias de cultura

Referências

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