Membro Remoto Pré-Condicionamento Isquêmico: A Técnica neuroprotetor em roedores

Summary

Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP) é um método de tecidos condicionado contra o stress prejudicial. Nós estabelecemos um método de isquemia remoto no membro posterior, inflando um manguito de esfigmomanômetro para 5-10 min. As capacidades neuroprotectoras de PIR foi demonstrada num modelo de degeneração da retina em roedores.

Abstract

Isquemia subletal protege os tecidos contra subsequente isquemia, mais severa a regulação positiva através de mecanismos endógenos no tecido afectado. Isquemia subletal também tem sido demonstrado que regulam positivamente os mecanismos de protecção nos tecidos remotos. Um breve período de isquemia (5-10 min) na pata traseira dos mamíferos induz respostas de auto-proteção no cérebro, pulmão, coração e retina. O efeito é conhecido por pré-condicionamento isquémico remoto (PIR). É uma maneira terapeuticamente promissora de proteger os órgãos vitais, e já está em fase de testes clínicos para o coração e cérebro lesões. Esta publicação mostra, um método minimamente invasivo controlada de fazer um galho - especificamente o membro posterior de um rato - isquêmica. Um medidor de pressão desenvolvido para uso em recém-nascidos humanos está ligado a um medidor de tensão manual e usado para aplicar pressão de 160 mmHg, em torno da parte superior do membro posterior. Uma sonda concebida para detectar a temperatura da pele é utilizado para verificar a ischemium, por registo da queda de temperatura da pele causado pela oclusão induzida por pressão das artérias das pernas, e o aumento da temperatura que segue libertação da braçadeira. Este método de RIP proporciona proteção a retina de ratos contra brilhante dano induzido por luz e degeneração.

Introduction

A sobrevivência da maior parte, talvez todos, os tecidos do rosto de stress metabólico podem ser melhoradas por condicionamento prévio com um período de isquemia subletal ^1,2. Pré-condicionamento isquêmico (IP), em termos práticos é a exposição dos tecidos à isquemia sub-letal, antes de as experiências de tecido estressores mais graves, como um insulto isquêmico subseqüente. Em modelos animais, IP fornece protecção notável para o cérebro, retina, coração e pulmões ^3-6. Do mesmo modo, observações em pacientes com AVC mostrou uma ligação entre os ataques isquêmicos transitórios anteriores e melhores resultados clínicos ^7,8. IP também protege fotorreceptores da retina de lesões não-isquêmica ^9.

A eficácia de IP em diversos tecidos e lesões sugere que está a activar um mecanismo inato de sobrevivência de células presente em todo o tecido. Pré-condicionamento isquémico do miocárdio foi sugerido ter efeitos protectores, através da regulação positivado factor de hipóxia indutível (HIF), conhecido para regular muitos processos metabólicos através da libertação de adenosina ou através da abertura de canais de potássio ATP mitocondriais ^10,11. Canais de liberação de adenosina e ATP potássio estão envolvidos na isquemia cerebral, mas, as investigações sobre os mecanismos neuroprotectores de condicionamento isquêmico até à data têm sido focados na modificações anti-excitotoxicity, vias anti-apoptóticos e anti-inflamatórios ^12,13. Em geral, a compreensão do processo molecular de condicionamento isquémico para protecção dos neurónios é limitada.

Tentativas de pré-condicionamento isquêmico remoto para condicionar órgãos distantes criticamente importantes (coração, cérebro, pulmão), gerando isquemia em tecidos menos críticas. Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP), usando o membro posterior foi demonstrado ser neuroprotectores, em modelos de roedores de acidente vascular cerebral ^14-17. O método descrito por nós proporciona um prot simples, fiável e não-invasivaOCOL para induzir PIR.

A grande maioria dos protocolos RIP envolvem o membro posterior, presumivelmente porque a artéria femoral localizado no membro posterior superior pode ser facilmente identificado e o acesso para fixação cirúrgica e aplicação torniquete. Em estudos de isquemia dos membros invasivo para o estudo do cérebro e de protecção da pele, isquemia é induzida através da separação da artéria femoral dos ligamentos na virilha e aperto da artéria femoral ^2,15,18.

A isquemia resultante do aperto ou da artéria femoral ou cuffing membro foi confirmada por alterações no membro, incluindo uma perda de pulso, diminuição da oxigenação e uma queda na temperatura da pele. Isquemia remoto pode ser confirmada pela perda de pulso através da utilização de Doppler a laser ou ultra-som Doppler ^17-19. A temperatura da pele pode ser utilizada como alternativa ao Doppler embora a relação não é linear ^20,21. Gravações de temperatura precisas são comuns em laboratórios e lataser facilmente incorporado em estudos isquémicos remotos.

Uma alternativa para a fixação femoral cirurgia é a indução de isquemia através de um torniquete. Garroteamento produz isquemia comparável ao obtido com pinçamento navio; Kutchner et ai. em comparação artéria femoral invasivo de aperto para um torniquete não-invasivo e encontrou os dois métodos interrompido o fluxo de sangue para o membro e reduziu os danos da pele em um modelo de cirurgia plástica de retalho de pele isquemia ^18. Cuffing ou a perna ou o braço e aumentar a pressão da braçadeira para acima da pressão arterial sistólica foi encontrada para ser protetor contra o dano isquêmico em suínos e humanos ^17,19,22.

Torniquete diferentes abordagens para induzir remoto isquêmico incluem o uso de um manguito de pressão arterial ou um ^17,22,23 elástico. No entanto, o uso de uma faixa elástica para induzir isquemia é um método inseguro, potencialmente dar origem a uma quantidade não regulada de pressão nomembro, com aumentos de pressão acima de 500 mmHg a ser gravado em humanos ^24. Além disso, a isquemia do membro utilizando uma banda elástica conduz a lesão muscular em ratos, após a remoção da banda ^23, como avaliado por Evans Blue Dye, um marcador in vivo de células musculares permeabilidade ^25. Em contraste, a entrega de uma pressão controlada para o torniquete pode ser conseguido usando um medidor de pressão ligado a um ^17,19,22,26 esfigmomanómetro.

Neste estudo, um modelo de lesão de luz de degeneração de fotorreceptores foi usada para demonstrar a eficácia neuroprotectora de pré-condicionamento isquémico remoto. Remoto isquemia foi induzida imediatamente antes da lesão luz, e impediu subsequente degeneração de fotorreceptores como confirmado por testes de função da retina. O vídeo que acompanha irá demonstrar a aplicação de isquemia remoto não-invasiva.

Protocol

Declaração de ética: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais de University of Sydney, AEC # 5657. A anestesia foi aprovado pelo comitê de ética animal (Universidade de Sydney, AEC # 5657).

1. Equipamentos Preparação

1. Use rastreamento em tempo real temperatura da pele. Ligue computador e hardware de aquisição de dados.
2. Software de gravação de temperatura aberto e ajustar ajuste de temperatura a entre 30-35 ° C e a frequência da amostragem para cada 100 ms.
3. Opcional: termômetro retal Inserir para garantir que a temperatura do núcleo permanece estável a 37,5 ° C.

2. Calibração do Manual Sphygmomanometer

1. Conecte neonatal braçadeira para sphygmomanometer.Use um manguito de tamanho 2 para um 250-550 g de rato. Um adaptador pode ser necessário ligar o tubo de manguito para o esfigmomanômetro.
2. Desinflar o manguito por qualquer afrouxamento da válvula de liberação de ar ou desligar o tubo de manguito da adaptaçãoou. Garantir que não haja pressão permanece na tubulação e a agulha do manômetro repousa em zero dentro do oval / retângulo.
3. Verifique a pressão entre tubos, manómetro e braçadeira. Inflar o manguito com bombas suaves do bulbo inflação até que ele lê 100 mmHg no manômetro. Assegurar a pressão permanece constante. Desinflar o manguito abrindo lentamente o valor da liberação do ar.

3. Preparação de animais

Nota: Os animais que devem ser submetidos a lesão luz requerem adaptação escuro a noite antes da isquemia remoto. Animais submetidos a danos leves exigem escuro criação (12 hr luz: ciclo escuro (5 lux))

1. Execute isquemia remoto em ambos os roedores acordado ou anestesiados. Certifique-se de que os animais têm um tônus ​​muscular saudável. Garantir isso por beliscar a pata traseira superior para confirmar que não está presente muscular adequado. Proteção induzida por RIP contra a lesão leve foi testado em ratos sedentários até 6 meses de idade.
2. Preparação anestesiados para RIP
   1. Injectar ratos com uma injecção intraperitoneal de 60 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina. Verifique a profundidade da anestesia através da extensão da perna e que comprime a pele na parte inferior do pé. O animal não tem reflexo se ele está profundamente anestesiado. Aplicar lágrimas artificiais para evitar o ressecamento da córnea, enquanto sob anestesia.
   2. Coloque ratos em cada uma almofada de calor ou tubos do aquecedor de água de circulação para manter a temperatura corporal constante de 37,5 ° C. Posicione o rato em decúbito ventral com pés de apoio dos membros inferiores para cima. Direito ou membro esquerdo pode sofrer isquemia remoto.
3. Awake preparação para RIP
   Nota: Awake experimentação animal requer duas pessoas. Uma pessoa restringe o animal ea segunda pessoa opera o esfigmomanômetro manual. Os experimentadores devem estar confiantes para realizar o procedimento de restrição aumenta o risco de ferimentos para os tratadores. Os ratos submetidos a isquemia remoto deve ser condicionada to contenção manual. Dependendo orientações intuitivas contenção manual deve ser progresso de 30 segundos a um máximo de 5 minutos ao longo de um número de semanas. Animais tímidos que não conseguem se aclimatar à contenção manual deve ser excluído da experimentação acordado. Por último, a contenção manual é susceptível de causar estresse (e potencialmente introduzir fatores de confusão para o estudo) para animais e um grupo sham (colocação de manguito sem inflamação) deve ser usado para interpretar com precisão os resultados do estudo RIP.
   1. Cortar uma toalha em uma 15 cm x 30-50 cm de peça e colocar a borda curta perpendicular à lombada do rato, que cobre a cabeça ao topo dos membros posteriores.
   2. Dobre a borda curta sob o dorso do rato com força e começar a embrulhar o rato com a borda longa remanescente de toalha. Fixe o animal enrolado embaixo do braço em posição supina. Se o rato é realizada sob o braço esquerdo, libertar membro direito do rato a partir da toalha.

4. Aplicação of Temperatura Pele Probe

1. Estender a perna do rato, que é submetida a isquemia e colocar a sonda na pele da planta da pata. Posicionar a sonda de pele para maximizar o contacto entre a sonda de temperatura e a pele. Empurre firmemente a sonda na pata e apor a sonda com fita de papel.
2. Verifique a colocação da sonda pele, controlando a temperatura no software de gravação de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da pele fica entre 30-34 ° C e mantém-se estável. Acompanhe a temperatura da pele por 1-2 min. Ajustar a sonda na pele, se a temperatura é instável ou abaixo de 30 ° C.

5. A isquemia remoto

1. Esvaziar a manga e assegurar a válvula de pressão de ar é fechada. Estenda a perna e vagamente cercar a braçadeira no membro posterior superior. Use o dedo indicador e polegar para estender a perna e os dígitos mais baixos para manter a manga na posição afrouxada.
2. Aumentar a pressão cuff do animal anestesiado a 160 mmHg, e em animais acordados increase a pressão da braçadeira a 180 mmHg.
   Nota: A pressão arterial de ratos anestesiados varia 120-140 mmHg e sobe para 160 mmHg quando estiver consciente. Começar as gravações temporizadas e temperatura pé uma vez que a pressão correcta seja alcançada.
   Nota: A temperatura do pé deve cair de 2 ° C após 5 min de pressão constante.
3. Manter a posição da manga de cima "joelho" do animal durante todo o isquemia. Pressão do balonete começará a cair depois de alguns minutos, ou se o membro do rato está se movendo.
4. Repetidamente bombear o bulbo inflação em rajadas curtas para manter a pressão do balonete desejado repetitivo breve explosão de bombeamento
5. Isquemia remoto pode ser libertado continuamente para entre 5 e 15 min. O protocolo de reperfusão de isquemia inclui dois períodos de 5 minutos de isquemia com um interveniente 5 min de reperfusão.
6. Esvaziar a pressão do balonete, desapertando a válvula de pressão de ar. Verifique a mudança de temperatura ao longo da isquemia prótocol. Solte a braçadeira.
7. Continuar com a experimentação lesão. Animais sob o efeito de anestesia terá de ser colocado sobre uma almofada de calor. Continue a acompanhar os animais até ambulatorial. Os animais não podem ser devolvidos à habitação até caminhar.

6. Lesão Light - Degeneração Retinal Modelo

1. Escuro adaptar os animais durante a noite (12-15 horas). Imediatamente após isquemia condicionado remoto ou isquemia remoto sham (contenção animal) animais lugar na habitação Perspex com comida e água.
2. Ligue iluminação fluorescente (1.000 lux) localizado acima habitação perspex, às 9 horas, durante 24 horas. Após a exposição de luz, retornar os animais para escurecer iluminação cíclico durante 7 dias.

Procedimentos Isquemia 7. Pós-remotos

1. Avaliação visão com Eletrorretinograma (ERG):
   Nota: O ERG set-up e protocolo de flash seguido Brandli e Pedra ^26.
   1. Escuro adaptar animais durante a noite (12-15 h). Debaixodim iluminação vermelha anestesiar os animais por injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina (60 mg / kg e 5 mg / kg, respectivamente). Midriático (sulfato de atropina, 1,0%), anestesia corneana (proxymetacaine 0,5%).
   2. Aplicar a hidratação da córnea (Carbomer polímero) colírio imediatamente na córnea. Aplique gel olho em intervalos de 20 min para manter a hidratação da córnea.
   3. Desenhar uma linha frouxamente amarrado ao redor do globo ocular para ajudar gravações ERG estáveis. Monitorar a temperatura usando uma sonda retal e manter a temperatura corporal do animal em 37-37,5 ° C.
   4. Posicionar a cabeça dentro de uma esfera de integração de Ganzfeld.
      Nota: O Ganzfeld é um estímulo de luz totalmente programável que fornece uniformes Whit pisca dos LEDs para o olho.
   5. Grave usando o electrorretinograma de 4 mm de platina do eléctrodo positivo feito por encomenda ligeiramente tocar na córnea e um eléctrodo de 2 mm de diâmetro sedimento de Ag / AgCl inseridos na boca. Referência ambos os eléctrodos a uma agulha de aço inoxidávelinserido por via subcutânea na garupa.
   6. Gravar sinais com ajuste passa-banda de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), com uma taxa de aquisição de 2 kHz (AD Instruments). Depois de uma gravação ERG estável é estabelecida assunto o animal a uma adaptação 10 min escuro antes de iniciar as gravações.
   7. Siga o protocolo de flash como previamente descrito por Brandli e Pedra ^26.
      1. Programar a duração do flash (que usamos flashes 1-2 ms de duração), e defina sua intensidade para -4,4 a 2,0 log scot cd.sm ^-2. Use flashes brilhantes (2,0 log scot cd.sm ^-2, 1 ms) para medir a função da retina. Neste estudo é a comparação entre o controle, lesão leve e lesão leve com RIP.

8. Ensaio TUNEL

1. Eutanásia animais por injecção intraperitoneal de sobredosagem fenobarbital (100 mg / kg). Enuclear os olhos e corrigir em paraformaldeído a 4%.
2. Lavar os olhos em PBS antes cyroprotectingolhos durante a noite em sacarose a 30% (w / v). Incorporar os olhos em composto outubro e corte em 20 mm cortes sagitais, utilizando um criostato.
3. Realizar o ensaio TUNEL em secções da retina com coloração DAPI seguindo o protocolo de Maslim et al. ²⁷
4. Use microscopia de fluorescência para a contagem de TUNEL da retina. Células TUNEL foram registados a partir de a camada nuclear externa (ONL); a camada mais externa da retina que contém núcleos fotorreceptoras. Neste estudo, as contagens de TUNEL foram feitas em triplicado para cada olho, com cinco olhos para cada grupo de tratamento.
5. Use one-way ANOVA para grupo estatística comparar os meios de controle, lesão leve, e de prejuízo + RIP ratos leves.

Results

Um manguito de pressão arterial elevada para acima de 160 mmHg interrompe o fluxo sanguíneo para o membro posterior como pode ser visto claramente na Figura 1B. A falta de oxigenação do tecido resultou numa redução da temperatura do pé do animal por um protocolo de isquemia-reperfusão (Figura 2). A temperatura do pé (33 ° C) foi menor do que a temperatura do núcleo e reduzida de forma fiável durante a elevação da pressão do balonete (31 ° C), aumentando quando a braçadeira foi esvaziado...

Discussion

Roedor membro posterior isquemia foi induzida com sucesso com um esfigmomanômetro e algemá entregar neuroproteção para os fotorreceptores da retina. Um achado consistente com o condicionamento induzido proteção isquêmico de fotorreceptores de uma lesão leve ^9,28.

Essencialmente, isquemia remoto faz com que a privação breve oxigênio aos tecidos. Assim, o pré-condicionamento isquémico remoto tem muitas semelhanças com o condicionamento isquémico ou alternativamente denominado tolerâ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Esfigmomanômetro aneróide manual DuraShock da série Gold	Welch Allyn	DS56	Esfigmomanômetro manual
Neonato [tamanho 2] 1 tubo, pacote com 10	Welch Allyn	5082-102-1	Manguito de pressão arterial de membro
Adaptador de trava Luer	Welch Allyn	5082-178	Adaptador para manguito neonatal
Pod termistor AD	Instruments	ML 309	unidade de temperatura da pele
Sonda de temperatura da pele	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, hardware de aquisição de 4 canais	AD Instruments	PL 35044
Sistema de manta homeotérmica com sonda flexível	Harvard Appartus	507222F
Toalha			opcional: isquemia remota acordada
Isoflo - 100% Isoflurano (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	opcional: isquemia remota de anestésico inalatório
Ketamil - cetamina 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opcional: isquemia remota de anestésico injetável
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opcional: isquemia remota de anestésico injetável