As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.
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Artigo de método
Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nenhuma cura foi descoberta para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de perda de visão em pessoas com mais de 55 anos. A DMRI é uma doença multifatorial complexa com etiologia desconhecida, embora se acredite que ocorra devido à morte ou disfunção do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada de células subjacente à retina e fornece suporte crítico para os fotorreceptores. As estratégias de substituição de células RPE podem ser muito promissoras para fornecer alívio terapêutico para um grande subconjunto de pacientes com DMRI, e células RPE que se assemelham fortemente às células humanas primárias (hRPE) foram geradas em vários laboratórios independentes, incluindo o nosso. Além disso, os usos do iPS-RPE não se limitam a terapias baseadas em células, mas também têm sido usados para modelar doenças de EPR. Esses tipos de estudos podem não apenas elucidar as bases moleculares das doenças, mas também servir como ferramentas inestimáveis para o desenvolvimento e teste de novos medicamentos. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para diferenciação direcionada de EPR de células-tronco. A adição de nicotinamida e ativina A ou IDE-1, uma pequena molécula que imita seus efeitos, em pontos de tempo específicos, aumenta muito o rendimento das células RPE. Usando essa técnica, podemos derivar um grande número de RPE de baixa passagem em até três meses.
Introdução
Os vários tipos de células que ocupam a retina são organizados em uma arquitetura funcional. Os fotorreceptores na parte posterior da retina são responsáveis por converter a luz em impulsos elétricos por meio da fototransdução. No entanto, a fototransdução não pode ocorrer sem os esforços coordenados de outros tipos de células vizinhas, incluindo a glia de Mueller e as células do epitélio pigmentar da retina (RPE). Uma monocamada de células RPE separa a retina sensorial da coriocapilar, o suprimento sanguíneo primário para os fotorreceptores, e está idealmente situada para controlar múltiplas funções importantes para a homeostase dos fotorreceptores. Na verdade, o EPR....
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Protocolo
1. Directed Diferenciação de Stem RPE derivado-Cell
NOTA: Todos os passos de incubação são realizadas a 37 ° C em 5% de CO 2
- Manter as linhas-tronco embrionárias humanas ou quadris (alimentação diária) em meio de manutenção (MM; Tabela 1). Uma vez que as linhas de ter atingido os padrões de controle de qualidade suficientes, mantê-los numa camada de células alimentadoras de rato embrionário (MEFs) semeadas a uma densidade de 250.000 / poço de uma placa de seis bem. Culturas isentas de Xeno também podem ser gerados seguindo o protocolo estabelecido por Tucker et ai.....
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Resultados
Os passos descritos neste manuscrito, como representado na Figura 1, pode ser facilmente utilizada para gerar a partir de células estaminais do EPR como relatado anteriormente 10,12. Após manter as linhas de iPS para várias semanas, as colónias pigmentadas começam a aparecer nas colônias após 5-7 semanas (sete semanas culturas antigas são mostrados na Figura 2A-C). Estas colónias podem continuar a crescer durante semanas como as culturas são mantidas. Uma vez atingida a tam.......
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Discussão
Nesse artigo, procuramos traçar os passos para gerar de forma eficiente um grande número de culturas puras iPS-RPE. Nós mostramos anteriormente que utilizam este protocolo diferenciação dirigido com Activin A que podemos gerar iPS-RPE que assemelham-se fortemente hRPE baseado em transcriptomics, proteômica, metabolômica e funcionalidade, e que retardar a degeneração da retina quando implantados em ratos RCS 12,31,32 . O processo de geração de iPS-EPR é demorada, trabalhosa, mas não (Figura 1).
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Divulgações
Nenhum dos autores tem qualquer divulgação comercial a declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos seguintes indivíduos: Drs. Tim Krohne e Eyal Banin (junto com a Dra. Mandy Lehmann e David Friedlander) pela generosa ajuda no desenvolvimento dos protocolos de diferenciação. A Dra. Felicitas Bucher forneceu assistência na diferenciação das células RPE usadas neste estudo. Também agradecemos ao National Eye Institute (NEI grants EY11254 e EY021416), ao California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219) e ao Lowy Medical Research Institute (LMRI) pelo financiamento muito generoso para este projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Faca de córnea | Faca Surgipro | SPOI-070 | x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca ou Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Soro Fetal Bovino, Regular (Inativado pelo Calor) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Proteína Humana Recombinante | Life Technologies | PHG0021 | 100 µ g x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamina 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinante Humano/Murino/Rato Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µ g x 2 |
| Placas de 6 Poços de Superfície Synthemax-T | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| Enzima TrypLE-Express (1X), sem vermelho de fenol | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Sistema de Filtro a Vácuo/Garrafa de Armazenamento, 0.1µ M poro, 500ml | Caixa | 431475 | Corning(12) x 1 |
Referências
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S.
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Reimpressões e permissões
