Artigo de método

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

DOI:

10.3791/52214

⸱

8 de março de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Lowy Medical Research Institute

Neste artigo

Resumo

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As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Resumo

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Nenhuma cura foi descoberta para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de perda de visão em pessoas com mais de 55 anos. A DMRI é uma doença multifatorial complexa com etiologia desconhecida, embora se acredite que ocorra devido à morte ou disfunção do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada de células subjacente à retina e fornece suporte crítico para os fotorreceptores. As estratégias de substituição de células RPE podem ser muito promissoras para fornecer alívio terapêutico para um grande subconjunto de pacientes com DMRI, e células RPE que se assemelham fortemente às células humanas primárias (hRPE) foram geradas em vários laboratórios independentes, incluindo o nosso. Além disso, os usos do iPS-RPE não se limitam a terapias baseadas em células, mas também têm sido usados para modelar doenças de EPR. Esses tipos de estudos podem não apenas elucidar as bases moleculares das doenças, mas também servir como ferramentas inestimáveis para o desenvolvimento e teste de novos medicamentos. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para diferenciação direcionada de EPR de células-tronco. A adição de nicotinamida e ativina A ou IDE-1, uma pequena molécula que imita seus efeitos, em pontos de tempo específicos, aumenta muito o rendimento das células RPE. Usando essa técnica, podemos derivar um grande número de RPE de baixa passagem em até três meses.

Introdução

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Os vários tipos de células que ocupam a retina são organizados em uma arquitetura funcional. Os fotorreceptores na parte posterior da retina são responsáveis por converter a luz em impulsos elétricos por meio da fototransdução. No entanto, a fototransdução não pode ocorrer sem os esforços coordenados de outros tipos de células vizinhas, incluindo a glia de Mueller e as células do epitélio pigmentar da retina (RPE). Uma monocamada de células RPE separa a retina sensorial da coriocapilar, o suprimento sanguíneo primário para os fotorreceptores, e está idealmente situada para controlar múltiplas funções importantes para a homeostase dos fotorreceptores. Na verdade, o EPR e os fotorreceptores são tão co-dependentes que são amplamente considerados como uma única unidade funcional. (Para uma revisão de todas as diversas funções do RPE, ver Strauss, 2005,1.) A morte ou disfunção das células do epitélio pigmentar da retina pode induzir degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de perda permanente da visão nos países industrializados2-4.

DMRI é uma doença multifatorial do EPR, dos fotorreceptores e da vasculatura coroidal; os fatores de risco são diversos e incluem combinações de influências ambientais e genéticas5,6. Os tratamentos para DMRI são muito limitados, mas uma terapia potencial promissora é a reposição de células RPE7,8. Embora os resultados tenham sido mistos, o transplante de células EPR em pacientes com DMRI (e em outros pacientes com degeneração retiniana) e também em modelos de roedores de degeneração retiniana, tem o potencial de prevenir transitoriamente a atrofia significativa dos fotorreceptores9-23. (O modelo animal comumente usado para esses estudos são ratos do Royal College of Surgeons (RCS), que abrigam uma mutação no gene MerTK. Essa mutação torna as células RPE incapazes de fagocitar segmentos externos dos fotorreceptores e promove a degeneração da retina24.) Embora as taxas de sobrevivência relatadas de EPR implantado no espaço sub-retiniano de ratos e camundongos RCS variem muito, há potencial para que eles sobrevivam por vários meses ou anos9,10,12,20.

As células RPE podem ser obtidas em número suficiente para transplante,derivando-as de células-tronco pluripotentes 9-14,25-28. Vários grupos independentes demonstraram que essas células funcionam de maneira semelhante às suas contrapartes somáticas, e estudos de longo prazo sugerem que elas são seguras após a implantação em modelos de doenças de ratos e camundongos9,10,12,14,19,20,25,29-32. O uso de células-tronco pluripotentes induzidas em vez de células-tronco embrionárias pode ser vantajoso, uma vez que questões éticas e desafios imunológicos associados ao EPR alogênico podem ser evitados33,34. Outra aplicação interessante para a tecnologia iPS é a modelagem de doenças35. A capacidade de interrogar um grande número de células RPE derivadas de pacientes com doenças RPE pode ser inestimável para a compreensão de suas bases moleculares. Esse tipo de estudo foi realizado recentemente com o EPR de pacientes com a doença de Best e pode abrir caminho para estudos semelhantes de maculopatias hereditárias36.

A derivação de RPE de células-tronco é um processo relativamente simples e pode ser feito inteiramente em condições livres de xeno. A estratégia mais simples é derivar monocamadas de células RPE espontaneamente, no entanto, o rendimento pode ser significativamente melhorado usando técnicas de diferenciação direcionada. Mas essas técnicas envolvem o uso de fatores proteicos exógenos que podem ser caros e muitas vezes gerados em bactérias ou outras fontes não humanas10,12,37. Em nossos estudos, seguimos um protocolo estabelecido10 que utiliza nicotinamida e ativina A, um fator de sinalização que se mostrou suficiente para a especificação de EPR38. Aqui demonstraremos que a pequena molécula IDE-1 pode substituir adequadamente a Activina A, reduzindo custos e aliviando as preocupações associadas ao uso de proteínas recombinantes39. Além disso, utilizamos reposição de soro sem xeno e cultivamos as células RPE diferenciadoras em um substrato sintético livre de xeno. As células RPE demonstraram anteriormente se diferenciar de forma muito eficaz usando essa abordagem40.

Quando diferenciados como uma monocamada, visualizamos colônias pigmentadas contendo células RPE após cinco semanas12. Quando atingem tamanho suficiente, podem ser extirpados manualmente e transferidos para outro prato para expansão. As células RPE são notórias por se desdiferenciarem a cada passagem, e o uso de qualquer coisa com mais de cinco passagens deve ser evitado (descobrimos que um número suficiente de células para caracterização e transplante em modelos animais pode ser facilmente gerado após duas ou três passagens). Uma vez totalmente diferenciados, empregamos várias técnicas para caracterizar as células anatômica e funcionalmente para garantir que elas sirvam como substitutos adequados para o EPR doente. A descrição dessas técnicas e o protocolo para implantação do iPS-RPE no espaço sub-retiniano de roedores estão além do escopo deste artigo de métodos e foram publicados anteriormente12,32,41.

Embora o desenvolvimento de protocolos padronizados para derivação efetiva de iPS-RPE seja claramente importante para as clínicas, também há um trabalho pré-clínico significativo a ser feito em modelos animais. Existem preocupações em relação à imunogenicidade das células derivadas de iPS, e várias técnicas de implantação diferentes, incluindo a implantação de células em substratos artificiais, estão sendo exploradas42,43. Por essas razões, sentimos que a publicação de protocolos padronizados é benéfica para facilitar estudos clínicos e pré-clínicos. Especialmente se forem feitas comparações diretas de células iPS-RPE derivadas em diferentes laboratórios por diferentes grupos de pesquisa.

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Protocolo

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1. Directed Diferenciação de Stem RPE derivado-Cell

NOTA: Todos os passos de incubação são realizadas a 37 ° C em 5% de CO 2

  1. Manter as linhas-tronco embrionárias humanas ou quadris (alimentação diária) em meio de manutenção (MM; Tabela 1). Uma vez que as linhas de ter atingido os padrões de controle de qualidade suficientes, mantê-los numa camada de células alimentadoras de rato embrionário (MEFs) semeadas a uma densidade de 250.000 / poço de uma placa de seis bem. Culturas isentas de Xeno também podem ser gerados seguindo o protocolo estabelecido por Tucker et ai. 40.
  2. Permitir que as colônias de células-tronco para a confluência.
  3. Mudar para a mídia diferenciação com nicotinamida (DM / NIC; Tabela 1); alimentar diária.
  4. Depois de três semanas em cultura, mudar para mídia diferenciação com nicotinamida e quer Activin-A ou IDE-1 (DM / NIC / AA ou DM / NIC / IDE1; Tabela 1) para aumentar a diferenciação RPE.
  5. Depois de cinco semanas em cultura, voltar para DM / NIC. Mamadas diárias não são mais necessárias uma vez que os indicadores de pH na parada de mídia amarelados o dia após a alimentação.
  6. Espere por ilhotas de células pigmentadas a parecer que são grandes o suficiente para ser cortado e removido (Ver Figuras 2D-F e 3A).

2. Isolando pigmentadas Ilhotas

  1. Revestir os poços de uma placa de 24 poços com uma matriz que imita o ambiente de células natural (livre de xeno é preferível).
    NOTA: lâminas de córnea e afiados, pinças de ponta fina são muito úteis para a colheita. Toda a folha de células diferenciadas pode separar ao escolher. Evite isso, trabalhar com cuidado e, inicialmente, escolher colônias no centro do prato.
  2. Preencha como muitos poços da placa de 24 poços com media diferenciação (DM; Tabela 1), conforme necessário. Esta decisão irá depender do número de colónias pigmentadascoletado.
  3. Em uma capa de cultura de células com um escopo de dissecação, corte manualmente ilhotas pigmentadas. Pique cada ilhota na parte inferior da placa original, utilizando um bisturi em cerca de 2-6 peças e agarrar as partes pigmentadas com uma pinça afiada.
  4. Transferir 1-2 peças pigmentados em cada um de 24 poços.
  5. Não mude de mídia por 3-5 dias até que as células aderir, então começar a mudar media três vezes por semana. (Se eles não aderem após este tempo, a probabilidade é bom que eles nunca será).
  6. Expandir células durante 3-4 semanas em meio de diferenciação (DM; Tabela 1) - Uma imagem de uma cultura típica é mostrada na Figura 3B. As células podem ainda não preencher todo o bem, mas espera mais não parece ajudar. Alimentar as células três vezes por semana.
  7. Depois de cerca de 3 semanas, remover manualmente grupos de células brancas em grupos, se necessário, com uma pinça afiada. Não faça esta etapa a menos que seja necessário - é fácil introduzir contaminantes. É ideal paratentar obter mais puras populações de RPE das colônias pigmentadas originais no passo 1.6.

3. Passaging-tronco derivadas de células RPE

  1. Separar as células com 200 uL com uma solução de dissociação de células (de preferência não-tripsina um reagente que pode ser inactivada por meio de diluição é preferível) para 5-8 min a 37 ° C, e inactivar que por diluição com o DM. Use uma pipeta de 200 mL para lavar todas as células e para voltar a suspender-los (se o bem selecionada contém apenas algumas células, considere reunir as células a partir de duas de 24 poços).
  2. Centrífuga (800 xg durante 5 min), descartar o sobrenadante e ressuspender em 3 ml de meio MS.
  3. As células re-placa de um (ou dois) de 24-poços numa única matriz revestido de 6 poços em 3 ml de DM por poço (1: 5 de expansão).
  4. Expandir durante 1-2 semanas, até que as células estão 90% confluentes ~; uma imagem de uma cultura pura totalmente diferenciada é mostrado na Figura 3C.
  5. Retire as células com 1 ml de células dissociation solução para cerca de 5-8 min a 37 ° C, inactivar que por diluição com DM, usar 1000 ul pipeta para lavar todas as células e ressuspender-los.
  6. Centrifugue (800 xg durante 5 min), descartar o sobrenadante e ressuspender em 18 ml de meio MS.
  7. As células re-placa de 6 poços um em cada seis matriz revestido de 6 poços em 3 ml de DM por poço (1: 6 de expansão) ou de um balão de 2 75 centímetros revestida (1: 7,5 expansão).
  8. Repita os passos de 3,4-3,8 que for necessário até células suficientes são obtidos.
    NOTA: Tente recolher o maior número possível de colónias de expansão em vez de planejar para amplificar as culturas via passaging uma vez que cada passagem induz RPE desdiferenciação.

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Resultados

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Os passos descritos neste manuscrito, como representado na Figura 1, pode ser facilmente utilizada para gerar a partir de células estaminais do EPR ​​como relatado anteriormente 10,12. Após manter as linhas de iPS para várias semanas, as colónias pigmentadas começam a aparecer nas colônias após 5-7 semanas (sete semanas culturas antigas são mostrados na Figura 2A-C). Estas colónias podem continuar a crescer durante semanas como as culturas são mantidas. Uma vez atingida a tam...

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Discussão

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Nesse artigo, procuramos traçar os passos para gerar de forma eficiente um grande número de culturas puras iPS-RPE. Nós mostramos anteriormente que utilizam este protocolo diferenciação dirigido com Activin A que podemos gerar iPS-RPE que assemelham-se fortemente hRPE baseado em transcriptomics, proteômica, metabolômica e funcionalidade, e que retardar a degeneração da retina quando implantados em ratos RCS 12,31,32 . O processo de geração de iPS-EPR é demorada, trabalhosa, mas não (Figura 1).

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Divulgações

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Nenhum dos autores tem qualquer divulgação comercial a declarar.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer aos seguintes indivíduos: Drs. Tim Krohne e Eyal Banin (junto com a Dra. Mandy Lehmann e David Friedlander) pela generosa ajuda no desenvolvimento dos protocolos de diferenciação. A Dra. Felicitas Bucher forneceu assistência na diferenciação das células RPE usadas neste estudo. Também agradecemos ao National Eye Institute (NEI grants EY11254 e EY021416), ao California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219) e ao Lowy Medical Research Institute (LMRI) pelo financiamento muito generoso para este projeto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Faca de córnea Faca SurgiproSPOI-070x 1
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032500 ml x 4 
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca ou MgVWR45000-434500 ml x 6
Soro Fetal Bovino, Regular (Inativado pelo Calor)VWR45000-736500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Proteína Humana RecombinanteLife TechnologiesPHG0021100 µ g x 1
IDE-1Stemgent04-00262 mg x 1
Knockout DMEMLife Technologies10829-018500 ml x 1 
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM Life Technologies25030-081100 ml x 1
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais 100X Life Technologies11140-050100 ml x 1
NicotinamidaSigma-AldrichN0636-100G100 g x 1
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)Life Technologies15140-14820 ml x 1
Recombinante Humano/Murino/Rato Activin A PeproTech120-14E10 µ g x 2
Placas de 6 Poços de Superfície Synthemax-TCorning3877Case(12) x 1
Enzima TrypLE-Express (1X), sem vermelho de fenol Life Technologies12604-021500 ml x 1 
Sistema de Filtro a Vácuo/Garrafa de Armazenamento, 0.1µ M poro, 500ml Caixa431475Corning(12) x 1 

Referências

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