Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Resumo

Apresentamos um protocolo para gerar culturas primárias de células estromais esofágicas murinas e humanas com fenótipo de miofibroblastos. As células cultivadas têm morfologia fusiforme, expressam α-SMA e vimentina e carecem de marcadores de superfície celular epitelial, hematopoiética e endotelial. As células estromais caracterizadas podem ser usadas em estudos funcionais de interações epitelial-estromal.

Resumo

De murino e humano esofágicas miofibroblastos são geradas através de digestão enzimática. Neonato (8-12 dias de idade) de murino esófago é colhida, triturada, lavada, e submetidos a digestão enzimática com colagenase e dispase durante 25 min. Espécimes ressecção do esôfago humanos são despojados de muscular própria e adventícia ea mucosa restante é picada, e submetido a digestão enzimática com colagenase e dispase por até 6 horas. As células cultivadas expressar α-SMA e vimentina e desmina expressa fracamente ou não em todos. Condições de cultura não são favoráveis ​​para o crescimento de células epiteliais, hematopoiético, ou células endoteliais. A pureza da cultura é ainda confirmada pela avaliação de citometria de fluxo de superfície celular expressão do marcador do potencial de contaminação da hematopoiético e células endoteliais. A técnica descrita é simples e resulta na geração consistente de não-hematopoieitc, células estromais não endoteliais. As limitações desta técnica são inerentes ao uso deculturas primárias em estudos de biologia molecular, ou seja, a variabilidade inevitável encontrou entre as culturas estabelecidas em diferentes ratos ou de seres humanos. As culturas primárias, porém, são uma reflexão mais representativo do estado in vivo em comparação com as linhas celulares. Estes métodos também fornecer aos investigadores a capacidade de isolar e cultura de células estromais de diferentes condições clínicas e experimentais, permitindo comparações entre os grupos. Células estromais esofágicas caracterizados também pode ser usado em estudos funcionais investigando interações epiteliais-estromal em doenças do esôfago.

Introdução

Interações epitélio-estromal estão envolvidos na regulação de uma variedade de funções do trato gastrointestinal, incluindo a regeneração das mucosas, reparação, fibrose e carcinogênese ^1,2. Estas interacções têm sido melhor estudada no intestino delgado e cólon, e pode desempenhar um papel semelhante nos distúrbios da mucosa esofágica ^3. Uma subpopulação de células de miofibroblastos do estroma e intestinais do cólon denominados foi demonstrada para participar na mediação de lesão dos tecidos, inflamação e reparação de ^4,5. No tracto GI distal, estas células fusiformes estão localizadas adjacentes à membrana basal, na interface entre o epitélio e da lâmina própria e são definidos como α-SMA positivos e vimentina, citoqueratina pan-negativo, e fracamente positivo ou negativo ⁵ desmina.

O estroma da dor não foi rigorosamente caracterizado ao nível celular ou molecular. Nosso trabalho no esôfago murino minimizarammonstrou α-SMA células e vimentina no estroma de esôfago, ocasionalmente subjacentes ao epitélio escamoso ^6. Interacções epiteliais-estromal têm sido implicados em perturbações da mucosa esofágica, tais como lesão mediada gastro-esofágico e esofagite eosinofílica ^{6 3.} Estenoses fibróticas também são uma complicação conhecida de células estromais de lesões esofágicas e têm sido implicados na patogénese da fibrose gastrointestinal. O isolamento dessas células vai ajudar a realizar os estudos necessários para investigar vias de sinalização dementes.

Esta apresentação fornece as técnicas necessárias para estabelecer culturas primárias de α-SMA, myofibroblasts positivos vimentina positivos tais que as lacunas existentes no conhecimento sobre as vias de sinalização que medeiam estas interações podem ser abordados. A técnica descrita foi utilizada com sucesso pelos autores para estabelecer miofibroblastos do cólon de murino primários ⁷ e further adaptado para o estabelecimento de murino ⁶ e células estromais esôfago humano miofibroblastos.

Descrevemos as condições necessárias para estabelecer e caracterizar essas culturas estabelecidas a partir do mouse ou no esôfago humano antes do uso em futuros estudos funcionais. As culturas podem ser cultivadas e utilizou-se para a 15 passagens. O isolamento e estabelecimento de culturas primárias através dos métodos descritos abaixo gera células do estroma com um fenótipo de miofibroblastos; α-SMA, vimentin positivo e fracamente positivo ou negativo para desmina e citoceratina negativo. Este fenótipo é diferente do fenótipo do fibroblasto esofágica que é predominantemente positiva vimentina, α-SMA negativo ³ ou o α-SMA positivos, vimentina fenótipo negativo da mucosa muscularis ^6.

Protocolo

O protocolo para realizar experimentos com animais, a lógica e os objetivos da pesquisa, foram submetidos e aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e do Comitê Use.

O protocolo para estabelecimento de culturas primárias de identificados de-esofagectomia espécimes humanos foi aprovado pela University of Southern California Institutional Review Board.

1. Obtenha Mouse ou Esôfago Humano

1. Obter Rato Esôfago:
   1. Eutanásia do rato velho 8-12 dias com 2% de isoflurano sobredosagem inalante seguido por deslocação cervical.
   2. Pin o animal para baixo com a barriga voltada para cima e molhar a superfície ventral com etanol 70%. Com uma pinça, agarrar e levantar a pele anterior à abertura da uretra com uma pinça. Use uma tesoura cirúrgica retas padrão para cortar ao longo da linha média ventral a partir da abertura da uretra até o queixo. Tenha cuidado para cortar somente a pele.
   3. Fazer uma incisão da abertura uretral para baixo para o joelho em ambos os lados do animal, que formam uma cabeça para baixo "Y". Fazer uma outra incisão em ambos os lados do animal ao longo da caixa toráxica.
   4. Retire cuidadosamente a pele em ambos os lados, fora do peritônio subjacente e da caixa torácica, e se deitou para os lados. Examinar a caixa torácica que se sobrepõe à cavidade torácica e o peritoneu que se sobrepõe à cavidade abdominal.
      1. Levante o peritônio com uma pinça e cortar por ele até a gaiola diafragma e costela, apontando uma tesoura para cima para evitar danos ao conteúdo abdominal. Suavemente levantar o lobo esquerdo do fígado, do estômago expor subjacente, a junção esôfago-gástrica e a porção abdominal do esófago.
   5. Use uma tesoura cirúrgica autoclavados para cortar o esterno e costelas ao longo da linha média até a cintura cervical. Ponto de tesoura para cima, para evitar danos ao conteúdo torácicos. Totalmente expor o conteúdo docavidade torácica, puxando a caixa torácica para os lados.
   6. Suavemente remover o coração e os dois lobos dos pulmões. Absorve o excesso de sangue com cotonetes. O esôfago torácico é uma, tubo deitado posterior estreito flexível para a traquéia e anterior à vértebra torácica.
      NOTA: O esôfago pode ser difícil de identificar em recém-nascidos de murino. Localização da junção esôfago-gástrica torna a identificação do esôfago simples.
   7. Siga cuidadosamente o esôfago acima do estômago, dissecando a vasculatura, gordura ao redor e do mesentério todo o caminho até a origem da dor na cavidade cervical. Tesouras cirúrgicas com ponta romba funcionam melhor para esta finalidade.
   8. Ressecção de todo o comprimento do esófago e do lugar em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) para posterior processamento descrito abaixo. Retirar uma porção do estômago para fins de orientação, se desejado.
      NOTA: Devido ao tamanho pequeno tecido, a separação das muscular própria do muscularé mucosa não é viável dentro murino esôfago recém-nascido e de todo o esôfago é submetido ao processamento descrito abaixo.
2. Obter Esôfago Humano:
   1. Lave espécimes ressecção do esôfago (tipicamente 5 cm ou menos) com HBSS e remover qualquer anexo do tecido conjuntivo, tecido adiposo, ou vasculatura.
   2. Ressecção de uma porção da amostra e colocam-se em formalina para exame histológico futuro, se desejado.
   3. Separe os mucosa restantes do subjacente muscular própria dissecadas.
   4. Corte mucosa em fragmentos centímetros sub e sujeito com o protocolo descrito abaixo.
      NOTA: ressecções esófago humanos podem ser armazenadas em PBS durante até 6 h antes do processamento descrito abaixo. Fonte de espécimes esofagectomia vai ditar o tamanho da amostra e será laboratório dependente.

2. Isolar Murino e esôfago humano células estromais

1. Isolar células estromais esofágicas fmurino rom e tecidos humanos por uma combinação de digestão enzimática e mecânica.
   1. Mecanicamente digerir picando o tecido com uma tesoura e múltiplas lavagens com HBSS. Enzimaticamente digerir o tecido, por incubação com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante 25 min (tecido de murino) ou de até 6 horas (tecido humano). Certifique-se de que os instrumentos utilizados para picar foram autoclavados e esterilizado.
      NOTA: As colagenases são enzimas que quebram o colágeno, uma proteína de matriz extracelular responsável pela realização de tecido animal juntos. Colagenase XI tem alta atividade da colagenase e tem visto o sucesso neste protocolo de isolamento. Dispase é uma enzima bacteriana com actividade proteolítica dissociação suave que preserva a actividade da membrana celular e é usada em combinação com uma enzima colagenase como secundário.
   2. Coloque fragmentos de mucosa obtidos a partir do mouse ou tecido humano em 1,7 ml micro-centrífuga ou tubos de 5 ml, respectivamente, contendo HBSS. Tecido Mince maisem 2-3 pedaços mm usando uma tesoura com uma largura de ponta aberta que se encaixam em seus respectivos tubos. Permitir tempo suficiente para permitir a fragmentos de mucosa esofágica para sedimentar para o fundo do tubo.
   3. Lentamente decantar HBSS, tomando cuidado para não inadvertidamente descartar o tecido. Substituir com HBSS seguinte por agitação suave. Como alternativa, remova HBSS com uma pipeta de 1 ml.
   4. Lave o tecido dessa forma um total de 8 vezes com agitação suave entre lavagens dar tempo aos fragmentos de esôfago para sedimentar entre cada lavagem.
      NOTA: O tecido humano vai exigir mais picados que o tecido recém-nascido mouse.
2. Incubar tecido murino com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante 25 min num agitador de balanço regulada para uma velocidade lenta, à temperatura ambiente.
   1. Incubar o tecido humano com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante até 6 horas, num agitador de balanço regulada para uma velocidade lenta, à temperatura ambiente.
      NOTA: A disponibilidade de esopha humanogus é variável. Mucosa esofágica Human incubadas com enzimas para até 6 horas resulta em uma geração bem sucedida de culturas primárias.
3. Após a digestão enzimática de tecido tritura ainda com uma tesoura e centrifugar a 200 xg durante 10 min.
4. Descartar o sobrenadante. Transferir o sedimento, que consiste de uma suspensão mista de células para um tubo de 5 ml e lava-se 5 vezes em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 2% de sorbitol para eliminar as células não viáveis ​​e detritos.
5. Semear as células em placas de 6 poços e cultura em DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), 10 mg / ml de insulina, 10 ng / ml de transferrina, 10 ug / ml de gentamicina, e factor de crescimento epidérmico 2 ng / ml (EGF) . Filtro de vácuo (0,22 mm) todos os componentes, com excepção de EGF que podem ser adicionados após a filtração. Distribuir as células obtidas a partir de amostras de ressecção humanos entre múltiplas placas de 6 poços, dependendo do tamanho da ressecção.
6. Depois de os poços são 80% confluentes, passagem células aderentes a T25 nos frascosção de 0,05% de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Neutralizar com a mídia e rotação a 400 x g.
   1. Para uma passagem de 6 poços para um frasco T25, as células de passagem na proporção de 1: 1. Frascos T25 confluentes podem ser passadas a uma proporção de 1: 3: 2 ou 1. Para a passagem de um frasco de T25 a um frasco T75, utilizar uma proporção de 1: 1. Troca de mídia a cada 2-3 dias, independentemente do navio.
   2. Crescer as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de _CO2 e cultura de miofibroblastos nos meios descritos acima.
      NOTA: As células epiteliais não sobrevivem sob estas condições de cultura ou de passagem. As células utilizadas para a caracterização e nos estudos descritos abaixo são passagens entre 5 e 15.
   3. Cryo-preservar células em N2 _líquido, adicionando 10% de dimetilsulfóxido à mídia myofibroblast.

3. Caracterizar Murino e esôfago humano células estromais

1. Examinar a morfologia das células com um microscópio invertido. Observe a-fusiformesmorfologia de células aderentes (Figura 1).
2. Caracterizar células cultivadas pela avaliação dos seguintes marcadores do citoesqueleto: α-SMA, vimentina, desmina, e cytokeratin. As células estromais com um fenótipo myofibroblast-like expressam marcadores miofibroblastos do citoesqueleto α-SMA e vimentina (Figura 2).
   1. Para diferenciar ainda mais as células do estroma cultivadas a partir de células musculares, imunocoloração para desmina. Para realizar a imunocoloração em células cultivadas, placa 1,5 x 10 ⁴ células em lâminas de câmara de 4 cavidades e crescem em meios de miofibroblastos durante 24 h. As células estromais com um fenótipo myofibroblast-like terá fraco ou ausente expressão desmina. As células estromais não ter expressão do marcador pan-epitelial citoqueratina (dados não mostrados).
      NOTA: Avaliação de culturas inclui avaliação de marcadores do citoesqueleto por marcadores imunocitoquímica e da superfície celular por citometria de fluxo. A imunocitoquimica é utilizado como o principal método de caracterização como o expression perfil de proteínas do citoesqueleto é único para o fibroblasto, miofibroblastos ou células do músculo. A citometria de fluxo estabelece que a cultura de pureza por avaliação de expressão na superfície celular de células epiteliais, endoteliais e células hematopoiéticas marcadores. CD90 é útil como adjuvante de um método de identificação de células estromais humanas, uma vez que é expresso em ambos os fibroblastos humanos e miofibroblastos. CD90 não é útil na caracterização de células estromais de murino, uma vez que também expressa por células T de murideo.
3. Depois das células atingirem 60% de confluência, enxaguar as lâminas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixar-se com metanol. Incubar as células em metanol durante 10 min a -20 ° C e em seguida armazená em PBS a 4 ° C até à sua utilização.
4. Siga o protocolo immunostaining padrão.
5. Resumidamente, antes da aplicação do anticorpo primário, bloquear as células fixadas com 5% goatserum em PBS. Dilui-se anticorpos primários e secundários em 5% de soro de cabra bem.
   1. Para a detecção de α-SMA e vimentina, utilizar oOs anticorpos e as concentrações seguintes: mAb de murganho para α-SMA em 1: 250 de diluição e de coelho pAB para vimentina em 1: 500 de diluição.
   2. Incubar com anticorpo primário, à temperatura ambiente durante a noite a 4 ° C, lavar 3 vezes com PBS e adicionar anticorpos secundários rodamina cabra anti-ratinho conjugado a uma diluição de 1: 200 e Cy2 cabra anti coelho conjugado a uma diluição de 1: 1000 durante 1 hora à temperatura ambiente.
   3. Contracoloração núcleos com 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) a uma concentração de 1 ug / ml durante 1 min e, em seguida, lavar com PBS. Analisar slides com um microscópio invertido.
6. Estabelecer pureza das culturas através de exame das células esofágicas murinos e humanos para hematopoiéticas (CD45) e endotelial (CD31) marcadores de superfície celular por citometria de fluxo (Figura 3). Caracterizar as células humanas ainda pela expressão do marcador de superfície celular de estroma da CD90.
   NOTA: CD90 não pode ser utilizado para identificar as células de estroma murino como murino T cells também expressam CD90.
   1. Separar as células estromais esofágica do rato em cultura a partir de frascos de cultura por tratamento com celular não-enzimática de dissociação Solução a 37 ° C durante 10 minutos, foram lavadas duas vezes com tampão FACS, contadas e coradas com FITC-CD45 e CD31-APC com os controlos de isotipo correspondentes, de acordo para procedimentos de coloração padrão.
   2. Coletar células usando FACS Calibur e analisar os dados com software FlowJo. Antes de células marcadas, otimizar anticorpos e titular concentrações usando controles isotipo, baço normal do mouse, e as células da medula óssea.

Resultados

Células estromais esofágicas isoladas usando a digestão mecânica e enzimática são inicialmente banhado e cultivadas em placas de 6 poços. O exame de células com um microscópio invertido dentro de horas de plaqueamento demonstra uma suspensão mista de células fracamente aderentes à placa de fundo (Figura 1A). Durante o próximo 24 horas, as células em forma de fuso firmemente aderentes ao fundo da placa são observados de disparo a partir da suspensão de células mista (Figura 1B) .Estes cé...

Discussão

As técnicas para a geração de cultura primária são geralmente semelhantes quando se utiliza tecido murino ou humano com Picadoras de carne e de digestão vezes adaptados para o tamanho do tecido. A nossa experiência com tecido murino sugere que utilizando os métodos descritos acima consistentemente resultar no estabelecimento bem sucedido de culturas primárias. As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem a esterilização de equipamentos cirúrgicos e seguindo técnicas estéreis padrão de cultura de tecidos. A idade do...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes para cultura de tecidos
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrina	Roche	10-652-202-001
tripsina / EDTA	Corning	25-052-Cl
Fator de crescimento epidérmico	Sigma-Aldrich	E9644
Reagentes para imunocoloração
de soro de cabra	Sigma Aldrich	G9023
Mouse mAB para α-SMA	abcam	ab7817
Coelho pAB para vimentina	abcam	ab45939
Cy2 conjugado Cabra anti Coelho	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 conjugado com eFluor 450 eBioscience		48-0319-41
CD90 conjugado com APC	eBioscience	17-0909-41
Anexina V e 7AAD	BD Pharmigen	559763
Mouse Fc block para CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Equipamento
Tubo de 5 ml	Eppendorf	30108310
Microscópio invertido	Motic	AE31
Gabinete de biossegurança e incubadoras	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4-well chamber slides	Thermo Scientific	177437
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5810R
Olympus Sistema de filtro acionado a vácuo	Genesee Scientific	25-227
Microscópio fluorescente	Nikon	Eclipse TE300
	Corning	3516
T25 Frascos	TRP	90026
T75 Tesouras	de
			dissecação
única	Kendall	540500
Software
Software Metamorph (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience

Placas de 6 poços dissecção Pinças de de ponta