Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Resumo

Apresentamos um protocolo para gerar culturas primárias de células estromais esofágicas murinas e humanas com fenótipo de miofibroblastos. As células cultivadas têm morfologia fusiforme, expressam α-SMA e vimentina e carecem de marcadores de superfície celular epitelial, hematopoiética e endotelial. As células estromais caracterizadas podem ser usadas em estudos funcionais de interações epitelial-estromal.

Resumo

De murino e humano esofágicas miofibroblastos são geradas através de digestão enzimática. Neonato (8-12 dias de idade) de murino esófago é colhida, triturada, lavada, e submetidos a digestão enzimática com colagenase e dispase durante 25 min. Espécimes ressecção do esôfago humanos são despojados de muscular própria e adventícia ea mucosa restante é picada, e submetido a digestão enzimática com colagenase e dispase por até 6 horas. As células cultivadas expressar α-SMA e vimentina e desmina expressa fracamente ou não em todos. Condições de cultura não são favoráveis ​​para o crescimento de células epiteliais, hematopoiético, ou células endoteliais. A pureza da cultura é ainda confirmada pela avaliação de citometria de fluxo de superfície celular expressão do marcador do potencial de contaminação da hematopoiético e células endoteliais. A técnica descrita é simples e resulta na geração consistente de não-hematopoieitc, células estromais não endoteliais. As limitações desta técnica são inerentes ao uso deculturas primárias em estudos de biologia molecular, ou seja, a variabilidade inevitável encontrou entre as culturas estabelecidas em diferentes ratos ou de seres humanos. As culturas primárias, porém, são uma reflexão mais representativo do estado in vivo em comparação com as linhas celulares. Estes métodos também fornecer aos investigadores a capacidade de isolar e cultura de células estromais de diferentes condições clínicas e experimentais, permitindo comparações entre os grupos. Células estromais esofágicas caracterizados também pode ser usado em estudos funcionais investigando interações epiteliais-estromal em doenças do esôfago.

Introdução

Interações epitélio-estromal estão envolvidos na regulação de uma variedade de funções do trato gastrointestinal, incluindo a regeneração das mucosas, reparação, fibrose e carcinogênese ^1,2. Estas interacções têm sido melhor estudada no intestino delgado e cólon, e pode desempenhar um papel semelhante nos distúrbios da mucosa esofágica ^3. Uma subpopulação de células de miofibroblastos do estroma e intestinais do cólon denominados foi demonstrada para participar na mediação de lesão dos tecidos, inflamação e reparação de ^4,5. No tracto GI distal, estas células fusiformes estão localizadas adjacentes à membrana basal, na interface entre....

Protocolo

O protocolo para realizar experimentos com animais, a lógica e os objetivos da pesquisa, foram submetidos e aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e do Comitê Use.

O protocolo para estabelecimento de culturas primárias de identificados de-esofagectomia espécimes humanos foi aprovado pela University of Southern California Institutional Review Board.

1. Obtenha Mouse ou Esôfago Humano

1. Obter Rato Esôfago:
   1. Eutanásia do rato velho 8-12 dias com 2% de isoflurano sobredosagem inalante seguido por deslocação cervical.
   2. Pin o animal para ....

Resultados

Células estromais esofágicas isoladas usando a digestão mecânica e enzimática são inicialmente banhado e cultivadas em placas de 6 poços. O exame de células com um microscópio invertido dentro de horas de plaqueamento demonstra uma suspensão mista de células fracamente aderentes à placa de fundo (Figura 1A). Durante o próximo 24 horas, as células em forma de fuso firmemente aderentes ao fundo da placa são observados de disparo a partir da suspensão de células mista (Figura 1B) .Estes cé.......

Discussão

As técnicas para a geração de cultura primária são geralmente semelhantes quando se utiliza tecido murino ou humano com Picadoras de carne e de digestão vezes adaptados para o tamanho do tecido. A nossa experiência com tecido murino sugere que utilizando os métodos descritos acima consistentemente resultar no estabelecimento bem sucedido de culturas primárias. As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem a esterilização de equipamentos cirúrgicos e seguindo técnicas estéreis padrão de cultura de tecidos. A idade do.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes para cultura de tecidos
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrina	Roche	10-652-202-001
tripsina / EDTA	Corning	25-052-Cl
Fator de crescimento epidérmico	Sigma-Aldrich	E9644
Reagentes para imunocoloração
de soro de cabra	Sigma Aldrich	G9023
Mouse mAB para α-SMA	abcam	ab7817
Coelho pAB para vimentina	abcam	ab45939
Cy2 conjugado Cabra anti Coelho	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 conjugado com eFluor 450 eBioscience		48-0319-41
CD90 conjugado com APC	eBioscience	17-0909-41
Anexina V e 7AAD	BD Pharmigen	559763
Mouse Fc block para CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Equipamento
Tubo de 5 ml	Eppendorf	30108310
Microscópio invertido	Motic	AE31
Gabinete de biossegurança e incubadoras	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4-well chamber slides	Thermo Scientific	177437
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5810R
Olympus Sistema de filtro acionado a vácuo	Genesee Scientific	25-227
Microscópio fluorescente	Nikon	Eclipse TE300
	Corning	3516
T25 Frascos	TRP	90026
T75 Tesouras	de
			dissecação
única	Kendall	540500
Software
Software Metamorph (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience

Placas de 6 poços dissecção Pinças de de ponta