Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

Resumo

Os macrófagos são as células-chave envolvidas na patogenicidade do hospedeiro. Os macrófagos apresentam diversidade fenotípica e funcional que pode ser analisada e detectada por análise proteômica. Este artigo descreve como realizar eletroforese 2D de culturas primárias de macrófagos humanos diferenciados em fenótipo M1 ou M2.

Resumo

O objetivo do protocolo de eletroforese bidimensional (2D) descrito aqui é mostrar como analisar o fenótipo de macrófagos cultivados em humanos. O papel fundamental dos macrófagos tem sido demonstrado em vários distúrbios patológicos, como doenças inflamatórias, imunológicas e infecciosas. Neste protocolo, usamos culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos humanos que podem ser diferenciados no fenótipo M1 (pró-inflamatório) ou M2 (antiinflamatório). Este modelo in vitro é confiável para estudar as atividades biológicas de macrófagos M1 e M2 e também para uma abordagem proteômica. As técnicas proteômicas são úteis para comparar o fenótipo e o comportamento dos macrófagos M1 e M2 durante a patogenicidade do hospedeiro. A eletroforese em gel 2D é uma técnica proteômica poderosa para mapear um grande número de proteínas ou polipeptídeos simultaneamente. Descrevemos o protocolo de eletroforese 2D usando corantes fluorescentes, denominado Eletroforese Diferencial em Gel 2D (DIGE). As proteínas dos macrófagos M1 e M2 são marcadas com corantes de cianina antes da separação por focalização isoelétrica, de acordo com seu ponto isoelétrico na primeira dimensão, e sua massa molecular, na segunda dimensão. Proteínas separadas ou manchas polipeptídicas são então usadas para detectar diferenças nos níveis de expressão de proteínas ou polipeptídeos. As abordagens proteômicas descritas aqui permitem a investigação das alterações na proteína dos macrófagos associadas a vários distúrbios, como patogenicidade do hospedeiro ou toxinas microbianas.

Introdução

Os macrófagos são células heterogéneas e de plástico que são capazes de adquirir fenótipos funcionais distintos. In vivo, estas células respondem a uma grande variedade de micro signalssuch ambiental como produtos microbianos, citoquinas, etc. ^1. In vitro, o fenótipo pró-inflamatória (M1) de macrófagos pode ser induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e o fenótipo anti-inflamatória (M2) por algumas citocinas tais como a interleucina-4 (IL-4). Além disso, os macrófagos podem alternar de um M1 M2 activado para fenótipo, e, inversamente, mediante sinais específicos ^2.

Dependendo do fenótipo, os macrófagos possuem diferentes funções. M1 macrófagos são células que produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral α (TNF-α), para matar os microorganismos ou células tumorais ^3. Em contraste, os macrófagos M2 evitar estes resposta inflamatória como na cicatrização de feridas e fibrose através da produção de anti-inflammatory factores, tais como TGF-β ^3,4.

As células mononucleares do sangue periférico humano a partir de dadores saudáveis ​​foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll como previamente descrito ⁵ utilizando uma técnica adaptada de Boyum ^6. Os macrófagos em cultura podem ser diferenciadas em M1 ou M2 fenótipo após 6 dias de cultura primária ^7.

Análise da expressão de proteínas ou mudanças de proteína entre os dois subtipos de macrófagos sob vários estímulos controlados, tais como patogenicidade hospedeiro ou toxinas microbianas, será útil para decifrar a funcionalidade do pro- macrófagos e anti-inflamatórios.

Proteômica são ferramentas exclusivas para o monitoramento direto de proteínas que são especificamente para cima ou para baixo-regulado em macrófagos cultivados humanos sob vários estímulos. Corantes fluorescentes resolveu algumas das limitações de eletroforese em gel 2D, como a baixa sensibilidade e análise de imagem ^{de 8 <} / Sup>. Os corantes que reagem com resíduos de cisteína aumentou a sensibilidade de detecção em comparação com aqueles reagir com ⁹ resíduos de lisina. Em um estudo anterior, demonstramos a utilidade de rotulagem saturação DIGE para a análise de amostras de escassos ¹⁰ em comparação com o 2D eletroforese manchada de prata clássica ^11. Esta tecnologia é útil para analisar rapidamente modificações de proteína entre os dois subtipos de macrófagos ou entre os macrófagos não tratados e tratados do mesmo subtipo.

As vantagens desta técnica são proteómica ter acesso às informações do tamanho da proteína e modificações pós-tradução através da análise do gel 2D ^12. Deve ser tomado em consideração que esta não é uma técnica de alto rendimento, o que limita o número de amostras que podem ser analisadas. O desenvolvimento de ensaios de alto rendimento com base em espectrometria de massa como revisto recentemente ¹³ pode melhorar esta.

_content "> Aqui apresentamos como realizar análise 2D DIGE da extração de proteínas de macrófagos em cultura através dos processos de eletroforese, isoelectrofocusing e SDS-PAGE, bem como informações sobre a utilidade do software 2D adequada.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes da nossa humana comitê de ética em pesquisa das instituições. Buffy coat de dadores humanos saudáveis ​​foram obtidos a partir do Centro Regional de Sangue Transfusion (Lille, França). As amostras obtidas a partir dos casacos de Buffy são declaradas como uma coleção Inserm (n ° DC2010-1209).

1. Material e Meios de Cultura Preparação

1. Diluir 10x de Tampão Fosfato Salino (PBS) em água destilada estéril para obter 1x PBS.
2. Adicione meio RPMI 1640 suplementado com gentamicina (40 ug / ml) e L-glutamina (2 mM), com e sem 10% de soro humano reunido.

2. As culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos (MDM)

1. Diluir buffycoat (25 ml) com 1x PBS. Encher cuidadosamente num gradiente de Ficoll tubo de centrífuga e / Leucosep a 1.600 xg durante 20 min, à temperatura ambiente.
2. Recolhe monócitos na interface para um novo tubo. Lavar 3x com 10 ml de 1x PBS contendo 0,1% etilenodiaminotetraácido acético (EDTA) por centrifugações sucessivas a 1.000 xg, 370 xg e 160 xg durante 10 min cada, e depois uma vez em 1x PBS sozinho a 160 xg durante 10 min.
3. Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de meio RPMI-1640 sem soro e semear as células em pratos de 35 mm a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células por prato.
4. Após sedimentação durante 90 minutos na incubadora, desprezar o sobrenadante contendo as células não aderentes. Lavam-se as células aderentes, que consiste de monócitos, 3x com 1 ml de PBS; em seguida adicionar 1 ml de meio fresco contendo 10% (v / v) de soro humano para as células livres de soro anteriormente.
5. Após 6 dias de cultura, para se obter os macrófagos diferenciados alternativos (M2), adicionar recombinante humana IL-4 (15 ng / ml) e manter durante 6 dias. Em seguida, o tratamento de macrófagos diferenciados com lipopolissacárido (100 ng / mL) no dia 12 durante 4 horas para se obter os macrófagos M1.

3. Extração de macrófagos M1 e M2 Proteínas para 2D Eletroforese

1. Wash macrophidades três vezes com Tris 25 mM, pH 7,4, e resíduos em tampão contendo 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), 2 M tioureia e 7 M de ureia.
2. Lisar células utilizando um misturador adequado para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para 5 min em gelo e armazenar a -20 ° C.
3. Determinar a concentração de proteína usando um reagente de Bradford comercial. Armazenar aliquotas de 100 ul das proteínas à temperatura de -20 ° C até à sua utilização.

4. Isoelectrofocusing

NOTA: Realizar todos os procedimentos de rotulagem no escuro.

1. Reduzir a 5 ug de cada amostra (M1 e M2 macrófagos) ajustado para 9 mL com tampão de lise com Tris 2 mM (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 1 hora a 37 ° C.
2. Adicionar cianina 3 (Cy3) de extracto de M1 e M2 extracto corante sulfidrilo reactivo, a uma concentração de 0,8 nM de proteína / ug. Adicionar cianina 5 (Cy5) a M1 e M2 extrai a uma concentração de 0,8 nM / mg de proteína e incubardurante 30 min a 37 ° C.
3. Pare a reacção com a adição de um volume igual de tampão de amostra contendo 7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 130 mM de ditiotreitol (DTT) e 2% pharmalytes.
4. Mix Cy3 marcado amostras M1 com amostras M2 Cy5-rotulados em uma mão e Cy3 marcado amostras M2 com amostras M1 Cy5-rotulados em outro lado.
5. Reidratar um gradiente de pH imobilizado (IPG) faixa (240 milímetros, pH 3-10 gradiente linear) com 450 mL de amostras misturadas marcados em tampão contendo 7 M uréia, 2 M de tiouréia e 4% CHAPS em uma focalização isoelétrica (IEF) sistema de célula para 24 horas, sem aplicar qualquer corrente.
6. Realizar concentrando a 300 volts (V) durante 3 horas, e, em seguida, em um gradiente a 1.000 V durante 6 h, em um gradiente a 8000 V durante 3 horas e, finalmente a 8000 V durante 3 horas.

5. Segunda Dimensão

NOTA: Execute todos os procedimentos de eletroforese no escuro.

1. Incubar as tiras de IPG em tampão de equilíbrio contering 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M de ureia, 2% (w / v) de dodecil sulfato de sódio (SDS) e 30% (v / v) de glicerol durante 10 min.
2. Transferem-se as tiras de IPG equilibradas para a segunda dimensão (electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE)) em 12,5% PAGE e selar com baixo ponto de fusão de agarose.
3. Levar a cabo a electroforese a 20 ° C utilizando um sistema Ettan-Daltsix a uma voltagem constante de 70 V durante a noite seguido de 300 V até o azul de bromofenol a frente atinge o fundo do gel.

6. Aquisição de Imagem e Análise Bioinformatic

1. Geles de digitalização expressos entre as duas placas de vidro de baixa fluorescência com um scanner DIGE Imager em comprimentos de onda de excitação / emissão de 532/580 nm para Cy3 e Cy5 para 633/670 nm para se obter imagens com um tamanho de pixel de 100 um.
2. Realizar análise de imagem com software comercial, como anteriormente descrito ^12.
3. Calcule e normalizar volumes pontuais em cada imagem. Atribuir um volume local normalizada como um suporteortion do valor total de cada mancha detectada no gel.
4. Analise as diferenças de volumes pontuais de proteína para cada tipo de macrófagos por comparação do valor de volume normalizado local entre os dois grupos (M1 e M2). Considere a diferença entre os volumes pontuais para ser significativa se a mudança é de 1,5 vezes (p <0,05, de um modo análise ANOVA).

Resultados

Para realizar a análise proteômica diferencial adequado, o processamento de amostras a serem analisadas devem ser verificadas.

No exemplo apresentado, a qualidade de cultura de células de macrófagos é necessário para os aspectos morfológicos e moleculares, tal como publicado anteriormente ^5. A diferenciação de monócitos em macrófagos e a homogeneidade da cultura foi seguido por microscopia de fase. A Figura 1 mostrou um exemplo de culturas primárias de M1 e M2 mac...

Discussão

O protocolo aqui descrito detalha um método para analisar o impacto de vários estímulos dos dois subtipos de macrófagos, M1 (pró-inflamatória) e M2 (anti-inflamatório). As culturas primárias de M1 e M2 macrófagos foram obtidos a partir da diferenciação de monócitos como publicado anteriormente ^7.

O procedimento de eletroforese em gel 2D DIGE requer materiais e equipamentos especializados, como o IEF celular para placas isoelectrofocusing, baixa fluorescência para a SDS-PAGE, a fim...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-glutamina-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
gentamicina 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
soro humano	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1,077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
Placa de 6 poços PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolissacarídeo	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Research Organics	3.00E+01
Filtro 0.22 µ m	Millipore	SCGPTORE
100 ml cilindro	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford reagente	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-corante reativo	GE Healthcare	25-8009-83
tira IPG 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean Célula IEF	Bio-Rad	165-4000
Agarose de baixo ponto de fusão	Invitrogen	15517-014
Sistema Ettan-Daltsix	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Dinâmica
Tubos de 50 ml	qualquer fornecedor	n/a
Tubos de 15 ml	qualquer fornecedor	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
seué e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	114391
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
Acrilamida 40%	Bio-Rad	161-0148
2D limpam	GE Healthcare	80-6454-51
Glicina	Sigma-Aldrich	G7126
Dimé tilformamida	Sigma-Aldrich	22705-6
mechas de eléctrodo	Bio-Rad	165-4071

não linear