Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

Resumo

Os macrófagos são as células-chave envolvidas na patogenicidade do hospedeiro. Os macrófagos apresentam diversidade fenotípica e funcional que pode ser analisada e detectada por análise proteômica. Este artigo descreve como realizar eletroforese 2D de culturas primárias de macrófagos humanos diferenciados em fenótipo M1 ou M2.

Resumo

O objetivo do protocolo de eletroforese bidimensional (2D) descrito aqui é mostrar como analisar o fenótipo de macrófagos cultivados em humanos. O papel fundamental dos macrófagos tem sido demonstrado em vários distúrbios patológicos, como doenças inflamatórias, imunológicas e infecciosas. Neste protocolo, usamos culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos humanos que podem ser diferenciados no fenótipo M1 (pró-inflamatório) ou M2 (antiinflamatório). Este modelo in vitro é confiável para estudar as atividades biológicas de macrófagos M1 e M2 e também para uma abordagem proteômica. As técnicas proteômicas são úteis para comparar o fenótipo e o comportamento dos macrófagos M1 e M2 durante a patogenicidade do hospedeiro. A eletroforese em gel 2D é uma técnica proteômica poderosa para mapear um grande número de proteínas ou polipeptídeos simultaneamente. Descrevemos o protocolo de eletroforese 2D usando corantes fluorescentes, denominado Eletroforese Diferencial em Gel 2D (DIGE). As proteínas dos macrófagos M1 e M2 são marcadas com corantes de cianina antes da separação por focalização isoelétrica, de acordo com seu ponto isoelétrico na primeira dimensão, e sua massa molecular, na segunda dimensão. Proteínas separadas ou manchas polipeptídicas são então usadas para detectar diferenças nos níveis de expressão de proteínas ou polipeptídeos. As abordagens proteômicas descritas aqui permitem a investigação das alterações na proteína dos macrófagos associadas a vários distúrbios, como patogenicidade do hospedeiro ou toxinas microbianas.

Introdução

Os macrófagos são células heterogéneas e de plástico que são capazes de adquirir fenótipos funcionais distintos. In vivo, estas células respondem a uma grande variedade de micro signalssuch ambiental como produtos microbianos, citoquinas, etc. ^1. In vitro, o fenótipo pró-inflamatória (M1) de macrófagos pode ser induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e o fenótipo anti-inflamatória (M2) por algumas citocinas tais como a interleucina-4 (IL-4). Além disso, os macrófagos podem alternar de um M1 M2 activado para fenótipo, e, inversamente, mediante sinais específicos ^2.

Dependendo do fenótipo, os m....

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes da nossa humana comitê de ética em pesquisa das instituições. Buffy coat de dadores humanos saudáveis ​​foram obtidos a partir do Centro Regional de Sangue Transfusion (Lille, França). As amostras obtidas a partir dos casacos de Buffy são declaradas como uma coleção Inserm (n ° DC2010-1209).

1. Material e Meios de Cultura Preparação

1. Diluir 10x de Tampão Fosfato Salino (PBS) em água destilada estéril para obter 1x PBS.
2. Adicione meio RPMI 1640 suplementado com gentamicina (40 ug / ml) e L-glutamina (2 mM), com e sem 10% de soro humano reunido.

2. As cultur....

Resultados

Para realizar a análise proteômica diferencial adequado, o processamento de amostras a serem analisadas devem ser verificadas.

No exemplo apresentado, a qualidade de cultura de células de macrófagos é necessário para os aspectos morfológicos e moleculares, tal como publicado anteriormente ^5. A diferenciação de monócitos em macrófagos e a homogeneidade da cultura foi seguido por microscopia de fase. A Figura 1 mostrou um exemplo de culturas primárias de M1 e M2 mac.......

Discussão

O protocolo aqui descrito detalha um método para analisar o impacto de vários estímulos dos dois subtipos de macrófagos, M1 (pró-inflamatória) e M2 (anti-inflamatório). As culturas primárias de M1 e M2 macrófagos foram obtidos a partir da diferenciação de monócitos como publicado anteriormente ^7.

O procedimento de eletroforese em gel 2D DIGE requer materiais e equipamentos especializados, como o IEF celular para placas isoelectrofocusing, baixa fluorescência para a SDS-PAGE, a fim.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-glutamina-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
gentamicina 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
soro humano	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1,077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
Placa de 6 poços PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolissacarídeo	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Research Organics	3.00E+01
Filtro 0.22 µ m	Millipore	SCGPTORE
100 ml cilindro	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford reagente	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-corante reativo	GE Healthcare	25-8009-83
tira IPG 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean Célula IEF	Bio-Rad	165-4000
Agarose de baixo ponto de fusão	Invitrogen	15517-014
Sistema Ettan-Daltsix	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Dinâmica
Tubos de 50 ml	qualquer fornecedor	n/a
Tubos de 15 ml	qualquer fornecedor	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
seué e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	114391
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
Acrilamida 40%	Bio-Rad	161-0148
2D limpam	GE Healthcare	80-6454-51
Glicina	Sigma-Aldrich	G7126
Dimé tilformamida	Sigma-Aldrich	22705-6
mechas de eléctrodo	Bio-Rad	165-4071

não linear