Artigo de método

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

DOI:

10.3791/52224

⸱

25 de setembro de 2016

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1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Neste artigo

Resumo

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A regulação de nutrientes usando alimentação ajustada ao crescimento contínuo melhora as taxas de crescimento de esferoides de células de mamíferos em comparação com a alimentação em lote intermitente para culturas em biorreatores de suspensão agitada. Este estudo demonstra os métodos necessários para estabelecer culturas alimentadas com taxa ajustada simples.

Resumo

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Nesta demonstração, esferoides formados a partir da linhagem celular de insulinoma β-TC6 foram cultivados como um modelo de fabricação de um produto de célula de ilhota de mamífero para demonstrar como a regulação dos níveis de nutrientes pode melhorar o rendimento celular. Em estudos anteriores, os biorreatores facilitaram o aumento dos volumes de cultura em relação às culturas estáticas, mas nenhum aumento no rendimento das células foi observado. Limitações em nutrientes essenciais, como a glicose, que foram consumidos entre as alimentações em lote, podem levar a limitações na expansão celular. Foram observadas grandes flutuações nos níveis de glicose, apesar do aumento das concentrações de glicose na mídia. O uso de sistemas de alimentação contínua eliminou as flutuações nos níveis de glicose e melhorou as taxas de crescimento celular quando comparado com os métodos de cultura estática e SSB alimentados em lote. Aumentos adicionais nas taxas de crescimento foram observados ajustando a taxa de alimentação com base no consumo calculado de nutrientes, o que permitiu a manutenção da glicose fisiológica ao longo de três semanas em cultura. Este método também pode ser adaptado para outros tipos de células.

Introdução

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A fim de gerar grandes números de células humanas viáveis ​​e funcionais para transplante, a regulação das condições de cultura é imperativo. O esgotamento de nutrientes, juntamente com a acumulação de resíduos metabólicos são importantes contribuintes para a senescência e alterações metabólicas que reduzem a qualidade do produto celular 1-3. Este procedimento demonstra um método para cultura de células de mamífero em esferóides utilizando um biorreactor agitado combinado com um sistema de alimentação de perfusão taxa ajustada para regular a glucose numa gama fisiológica 4 durante toda a duração da cultura. Para a finalidade destes estudos, a gama fisiológica foi definida como entre 100 e 200 mg / dl. Os mesmos métodos podem ser utilizados para regular outros nutrientes e resíduos metabólicos, tais como lactato.

culturas estáticas em pequenos volumes (1 - 30 ml) são normalmente utilizados no ambiente de laboratório para manter e diferenciar linhas celulares para experimefins ntal. Passaging celular é realizada com as mudanças de meio completo, conforme necessário, em intervalos regulares. Mais meio de cultura "convencional" tem uma concentração de glucose elevada (450 mg / dl para DMEM utilizado nestes estudos) para permitir as mudanças de meio menos frequentes, sem o risco de limitações nutricionais. No entanto, esse método de alimentação de lote ainda requer manipulação frequente, introduz variabilidade no ambiente celular, e aumenta o risco de contaminação 5-9. Biorreatores suspensão agitada (SSB) fornecer uma melhor mistura e diminuição da manipulação de 3,10 - 20, mas como culturas estáticas, exigir mudanças médias manuais que contribuem para flutuações potencialmente prejudiciais nos níveis de produtos nutricionais e de resíduos. alimentação perfusão de culturas SSB reduz esses problemas por infusão contínua e remoção do meio, mas grandes mudanças nos níveis de nutrientes devido ao crescimento celular continuam a ser um problema. A utilização de uma alimentação adequada rate a partir de cálculos de uso de nutrientes com base em requisitos de células estimados podem proporcionar o ambiente celular estável necessário para otimizar a viabilidade celular e funcionar 21-24.

Há um grande corpo de literatura métodos para culturas escaláveis SSB de células de mamíferos, especificamente para a cultura e expansão de células pluripotentes 25 descrevendo - 32, com os outros focados em (beta) células 17,33,34 ilhota, ou a produção de produtos biológicos 24, 35-38. Muitos destes tipos de células investigadas podem ser cultivadas em culturas de esferóides, e procedimentos específicos para o tipo de célula a ser utilizado deve ser optimizado antes da implementação de um sistema de alimentação contínuo. Nesta demonstração, um método de alimentação de perfusão foi usada para expandir uma linha celular cultivada como beta esferóides num biorreactor agitado 39-43. O método aqui descrito proporciona umaimplementação direta de alimentar ajustes de taxa com base em medições de glicose no off-line para alcançar condições de cultura alvo. Ajustando a taxa de alimentação com este método para manter um nível de glucose fisiológica é mostrado para colheitas de células aumenta. As células de mamíferos são dependentes de um nutriente essencial, glucose, para a produção de energia, de modo que o uso desta linha de células representa um modelo para muitas células de mamíferos em cultura 44. Além disso, esta linha exemplifica a complexidade adicional de células beta, que são sensíveis a níveis elevados de glicose 45 crónicas. Para este estudo, as células beta-TC6 permissão para formar esferóides em cultura para aproximar o tamanho médio das ilhotas de Langerhans in vivo. O sistema de bioreactor de perfusão 17 - 19,21,46 com uma taxa de alimentação ajustada ao consumo de glicose, resultou na manutenção de condições fisiológicas e rendimentos mais elevados de células, sem alterações na viabilidade.

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Protocolo

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1. Linha de Células e manutenção

  1. Obter células-p TC6 (ou outra linha de células de mamífero aderente desejada). Em preparação para o estudo, a cultura, a passagem, e criopreservação de células de acordo com as instruções do provedor.

2. Montar o sistema de alimentação contínua

NOTA: O design do sistema de alimentação contínua no método a seguir foi baseado em sistemas semelhantes aos descritos na literatura 17 - 19,21,47 - 49. Montagem do sistema utilizado aqui é descrito em pormenor na publicação anterior 3.

  1. Recolher os componentes necessários para o sistema de alimentação que consiste de cinco componentes principais: um reservatório médio, bomba peristáltica, biorreatores agitados, reservatório de resíduos, e projetado conjunto de tubos / amostragem.
    1. Estabelecer o reservatório meio utilizando uma garrafa de 1 L de vidro, o reservatório de resíduos usando uma garrafa de vidro de 2 L, eo stirred biorreator utilizando um reactor de vidro de volume de 250 ml (off a versão de prateleira).
    2. Use uma bomba peristáltica digital ou bomba semelhante com uma cabeça de bomba de 8 canais para controlar troca de meio.
    3. Fabricação do reservatório e tampas de biorreatores modificados a partir de plástico duro e autoclavável com tubo de aço inoxidável de passagem portas para assegurar a ventilação através de filtros estéreis, e permitir a transferência de meio entre reservatórios e biorreatores. Em alternativa, comprar tampas especializadas com portas de fluxo de vários fornecedores.
      NOTA: A tampa biorreator podem conter portas repasse adicional para instrumentação opcional e sondas de monitoramento (por exemplo, monitor de oxigênio).
    4. Anexar um tubo de saída (OT) fabricados a partir de tubos de arejamento de vidro poroso com uma gama média de tamanho de poro de 40 um a 60 um, e uma densidade de poros de 40% para a tampa SSB modificado. Alternativamente, escolha outro tubo de saída com base nos requisitos específicos da cultura.
      NOTA: Escolha oTamanho dos poros OT para remover apenas médio e restos celulares, deixando agregados de células em cultura (como descrito na seção 6 e publicação 3 para mais detalhes).
  2. Montar conjuntos de tubos de perfusão autoclaváveis ​​de fluoreto de polivinilideno (PVDF) conectores de tubos e tubos de bomba peristáltica durável. O comprimento da secção é dependente da distância entre os diferentes componentes.
    NOTA: Tome especial cuidado ao selecionar variedade tubulação para garantir a durabilidade e confiabilidade para experimentos de longa duração.
  3. Montar o tubo de definir a partir de três partes: a linha de alimentação, uma linha de resíduos, e uma linha de amostra.
    1. Monte a linha de alimentação com dois diâmetros de tubulação (l / s 14 e L / S 13). Utilizar a relação L / S 14, para a tubagem principal que irá transpor a distância a partir do bio-reactor para o reservatório de meio, e inserir um curto comprimento de L / S 13 no meio do comprimento do tubo para a parte de bomba usando os adaptadores de PVDF adequadas.
    2. Use PVDF padrão mangueira de farpado tubing adaptadores para unir duas peças de tubo de L / S 14, de cada lado da secção de bomba mais curto (relação L / S 13) do tubo.
      NOTA: Como alternativa, todo o comprimento da tubagem pode ser de menor diâmetro L / S 13 tubos, e todo o comprimento da tubagem pode ser substituída quando a integridade-parte de bomba está em questão.
  4. Monte a segunda seção tubulação para remoção dos resíduos utilizando maior diâmetro (L / S 16) tubos e inserir uma seção curta de L tubulação / S 14 no meio da seção de bombeamento. Isso é feito da mesma maneira como a linha de alimentação de montagem usando PVDF adaptadores de mangueira farpada, ou, alternativamente, utilizando um comprimento contínuo do tubo da bomba de tamanho desejada, e substituindo, conforme necessário.
    NOTA: Se a mesma bomba e cabeça da bomba são usados ​​para o circuito de alimentação e circuito de resíduos, a parte de bomba das linhas de tubulação de remoção de resíduos deve ser um diâmetro maior do que a secção da bomba da linha de alimentação. Isto assegura que a taxa de bombagem de remoção é mais rápida do que a taxa de alimentação, e vai evitar a potenteial para grandes alterações no volume da cultura, e reduzir o risco de transbordamento.
  5. Monte o componente final do conjunto de tubos: um conjunto de coleta de amostras.
    1. Este procedimento descreve um costume montados amostragem sistema portuário; Em alternativa, uma porta de amostragem estéril pode ser adquirido a partir de vários fornecedores.
    2. Construir o conjunto de três curtas (~ 6 cm) L / S 14 comprimentos de tubos ligados entre si com um conector PVDF tipo T, e duas braçadeiras das mangueiras pequenas em dois dos comprimentos de tubulação.
    3. Coloque um filtro de gás estéril para ventilação de gás para um dos comprimentos bloqueada, e a outra é usada para ligação a uma seringa de amostragem estéril (filtros de gás estéril pode necessitar de ser adicionada num armário de bio-segurança após a esterilização tantos filtros estéreis não são autoclavável).
    4. Ligue o terceiro extremidade a um conector de amostra de aço inoxidável ligado na tampa do bioreactor.
    5. Autoclave a montagem de amostragem, enquanto conectado ao biorreator antes do inícioo experimento (consulte a etapa 3 abaixo).
    6. Utilize este conjunto para coletar amostras estéreis do biorreator, conforme necessário, sem perturbar o processo de alimentação contínua.

3. Autoclave Todos os Materiais

  1. Prepare todos os componentes de biorreatores para esterilização em autoclave.
  2. Recolha componentes individuais para a esterilização. reservatórios de médio e resíduos (montados a partir do passo 2.1.1), 250 ml balão rotativo (montado a partir de 2.1.1), tampas modificados necessários (montados a partir de 2.1.3), tubo de saída (descrito em 2.1.4), três conjuntos de tubos ( montadas em secções 2.2 through2.5), tubo de saída (conforme necessário para a alimentação contínua).
    1. Montar balão giratório, com todos os componentes e verifique se o tubo de saída está firmemente presa no interior do balão rotativo (descrito no ponto 2.1.4), e anexar o costume montados porta de amostragem (ponto 2.5), ou outra porta de amostragem para o topo da tampa .
    2. Enrole todo o conjunto do balão rotativo com automaterial de clave envoltório, e autoclave indicando fita. Certifique-se de que o envoltório hermético. NOTA: folha de alumínio ou material semelhante pode ser utilizado para cobrir as extremidades individuais de cada orifício de acesso na tampa biorreactor para preservar a esterilidade do conector / termina quando desempacota e, quando não ligado aos conjuntos de tubos no interior da incubadora.
    3. Monte as tampas modificadas dos reservatórios de médio e resíduos e, em seguida, anexar as respectivas garrafas de vidro. Cubra-os com folha de alumínio e autoclave indicando fita.
    4. Individualmente embrulhar os conjuntos de tubos (seção 2,2-2,5) com envoltório autoclave e fita adesiva para ajudar na montagem final. A folha de alumínio ou material semelhante pode ser usado para envolver as extremidades individuais de cada conjunto de tubos para preservar a esterilidade do conector / termina quando desenrole.
    5. Autoclave todos os itens envolvidos, utilizando um ciclo padrão de autoclave seca (por exemplo, "gravidade" configuração com ~ 15 psi a 121 ° C durante 30 min ou mais).
      NOTA: Não coloque estérilfiltros antes da autoclavagem a menos que sejam confirmadas para ser seguro autoclave.

4. Formação Spheroid

NOTA: esta técnica é semelhante à descrita na literatura 17 - 19,21,50 - 52 para outras culturas de células de mamíferos. Todos os procedimentos seguintes a esterilização deve ser feito de uma câmara de fluxo laminar utilizando luvas esterilizadas e para manter condições estéreis para cultura de células.

  1. Para todas as condições de cultura, e expandir células β-TC6 em culturas aderentes padrão (descritas pelo fornecedor), até quantidades de células suficientes são obtidos para semear o número desejado de biorreactores.
    1. Monte o biorreator de alimentação contínua com o tubo de saída, como mostrado na Figura 1 e descrita na secção 2, e conectar a porta de amostragem a tampa de amostragem. NOTA: O tubo de saída e o conjunto porta de amostragem deve ser adicionado ao bioreactou para uma alimentação contínua antes da formação de esferóides, e deve ser puxado para cima para fora do meio de cultura até que a alimentação contínua é iniciado.
    2. Esterilizar o conjunto SSB modificado por autoclave (descrito na seção 3).
    3. Anexar aberturas estéreis (0,22 m ou menores filtros estéreis) para os locais apropriados nas tampas do frasco com agitação, e em vasos de médio e de resíduos.
      NOTA: Isso é importante para evitar bloqueio de vapor, e para permitir a troca de gás entre a incubadora (2 5% CO) meio ambiente e do biorreator. A troca gasosa é necessário para manter o pH correto quando usando a mídia tamponada com bicarbonato.
  2. Recolher as células por tripsinização suave usando 0,25% (w / v) de solução de tripsina EDTA 0,53 mM, à temperatura ambiente, auxiliado por agitação mecânica durante 2-3 min, e semente em biorreactores a uma densidade de aproximadamente 1,3 x 10 6 células / ml em 200 ml de meio de cultura.
    1. Mover frascos designados para fora da incubadora eem um gabinete de Bio-Segurança.
      NOTA: Todos cultura de células e manipulações deve ser feito em um gabinete de Bio-Segurança usando técnica estéril adequada.
    2. Remova o meio de cultura a partir de frascos por aspiração.
    3. Lave as células por pipetagem de 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (sem Ca ++ ou Mg ++), para dentro do balão, e a lavagem entre as células sobre a superfície, e, em seguida, aspirar o PBS.
    4. Adicionar 3 ml de solução de Tripsina-EDTA a cada balão que vai ser recolhida (tipicamente cerca de 10x 175 centímetros 2 frascos-T).
    5. Permitir que as células colhidas a incubar à temperatura ambiente durante 2-3 min em armário bio-segurança.
    6. Agita-se suavemente com a mão para soltar as células da superfície balão, e recolher as células por adição de 6 ml de meio de cultura (com soro) para o balão, e transferência das células para um tubo de 50 ml. Quando um tubo de 50 ml é cheio, utilizar um outro tubo de 50 mL até que todas as células necessárias foram recolhidas (aproximadamente será necessário um tubo de 50 ml para cada 5 frascos T-175coletado).
    7. Suavemente centrifugação (aproximadamente 50 x gravidade) as suspensões de células colhidas para sedimentar as células.
    8. Aspirar o meio restante deixando o sedimento intacta.
    9. Recolha todas as células de um único tubo através de re-suspender as pelotas em meio de cultura (contendo soro), utilizando uma pipeta, e a transferência de todos os peletes no mesmo tubo.
    10. Contagem de a densidade de células utilizando um hemocitómetro padrão de coloração com azul de tripano, tal como descrito na literatura 53.
    11. Adicionar número desejado de células totais de estéril SSB para cada condição (1,3 x 10 6 células / ml foi a densidades celulares de partida para esta demonstração segmentados).
    12. Adicionar meio (com a concentração de glucose desejado, neste caso utilizou-se níveis de glucose no meio dentro do intervalo fisiológico) para SSB usando uma pipeta de alcançar (200 ml de volume de cultura foi utilizado para estes estudos) do volume total da cultura desejada.
      NOTA: Para estes alimentados contínua SSB estuda o cu ltures foram inoculadas usando uma versão modificada de "baixa-glicose" do meio de cultura (100 mg / dl). Isto permitiu que as culturas para iniciar a concentração de glicose no alvo desejado, em vez de começar com um meio de "alto teor de glucose-" e esperando que o consumo de glucose para trazer os níveis de glucose para dentro da gama fisiológica para começar a alimentação. Todos os outros meios para alimentar nesses estudos utilizaram o padrão "de alta de glucose" meio (500 mg / dl).
    13. Mover SSB com células de uma placa de agitação dentro de um incubador de cultura de células.
  3. Células de cultura em biorreatores sem alimentação durante 3 dias a 37 ° C, com 5% de CO 2, 100% de humidade relativa, e uma velocidade de agitação de 70 rpm para permitir esferóides para formar.
    NOTA: Não proliferação significativa devem ser observados durante o período de formação esferóide de três dias.
  4. Após a formação de esferóides, dividir entre esferóides biorreactores com condições de cultura desejadas.
le "> 5. Cultura alimentação contínua e ajustados taxa de alimentação

  1. Autoclave ou gás esterilizar todos os componentes, e montar numa câmara de segurança biológica utilizando técnicas estéreis (passos 2-4).
  2. Após a formação de esferóides, remover o SSB da incubadora e montar os componentes do sistema para a alimentação contínua de uma câmara de segurança biológica.
    1. Primeiro encher o reservatório meio fresco com o meio de cultura desejada e, em seguida, conectar-se a um dos lados da linha de alimentação. Também garantir que o reservatório de meio fresco é adequadamente ventilado com um filtro estéril.
    2. Conectar um lado da linha de alimentação para a abertura de entrada de alimentação no biorreactor de forma estéril. Um filtro estéril deve ser instalado entre a linha de alimentação e a abertura de entrada biorreactor para filtrar o meio antes de entrar no biorreactor.
    3. Ligue a linha de resíduos ao tubo biorreator saída eo reservatório de resíduos médio, e garantir que o reservatório de resíduos está devidamente ventilado com um sterile filtro.
  3. Mova o conjunto para fora da cabine de segurança biológica (isto provavelmente irá requerer duas pessoas para transportar todos os vasos e tubos), e colocar todos os componentes para fora para a cultura de longo prazo.
    1. Coloque o SSB para a placa de agitação no interior da incubadora utilizando os mesmos parâmetros de cultura para a formação de esferóides (37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade e 70 rpm). Nota: Pode ser necessário desligar temporariamente os segmentos de tubagem a partir do biorreactor se as linhas necessário executar furos de passagem no lado da incubadora em vez de para fora através da junta de vedação na porta. Isto pode ser feito de uma forma asséptica enrolando as extremidades dos conjuntos de tubos com folha de alumínio antes da autoclavagem (passo 3), e em espera para conectar o lado biorreactor das secções de alimentação e de tubo de descarga até que o bioreactor está dentro da incubadora. As linhas de tubo pode ser colocado no lugar, e a folha de alumínio pode ser removido no interior da incubadora e rapidamente ligada ao biorreactor.
    2. Executar extremidades restantes conjuntos de tubos (aqueles que não estão ligadas à tampa biorreator) para fora através da porta de acesso incubadora (pass-through), ou através de um entalhe na junta porta da incubadora.
    3. Do lado de fora da incubadora (numa cabine de segurança biológica nas proximidades, se possível), rapidamente ligar a linha de alimentação para o reservatório de meio fresco, e a linha de resíduos para o reservatório de resíduos médio, e assegurar que o reservatório de resíduos está devidamente ventilado com um filtro estéril. NOTA: Para fazer isso de uma forma asséptica, retire a folha de alumínio dos conectores de tubos e vasos e se conectar aos respectivos navios o mais rapidamente possível (especialmente se essa ligação tem de ser feito fora da cabine de segurança biológica).
    4. Coloque reservatório de meio fresco (preenchido com meio de alimentação desejado) no interior nas proximidades mini-frigorífico. Verificar para assegurar que as linhas de alimentação de resíduos e são capazes de sair do incubador e entrar no frigorífico sem impedir que as portas em cada de fechar. É também crítico que a alimentação lines não fiquem presos fechado por portas, quer do refrigerador ou da incubadora.
      NOTA: O meio utilizado para estes estudos foi o meio de cultura padrão alto teor de glucose (500 mg / dl) recomendado pelo fornecedor para este tipo de células. Qualquer meio de glucose elevada poderia ser usado com base nas necessidades específicas do tipo de célula a ser cultivada. A concentração de glucose do meio de alimentação deve ser razoavelmente mais elevado (2x ou mais) do que a concentração desejada na cultura como o sistema de alimentação baseia-se no aumento da taxa de alimentação do meio de glucose elevada para manter os níveis de glicose adequados nas culturas enquanto se mantém as taxas de alimentação razoáveis .
    5. Em seguida, o reservatório de meio de resíduos podem ser colocados na bancada fora da incubadora em uma localização conveniente.
    6. Em seguida, coloque a seção "bomba" das linhas de alimentação e de resíduos para a cabeça da bomba assegurando a orientação adequada para que as linhas de alimentação bombeará meio do reservatório meio fresco para o SSB, e as linhas de resíduosbombeará meio do SSB e ao meio resíduos reservatório.
  4. Ligar a bomba para o avanço desejado.
    1. Calcula-se a taxa de alimentação utilizando a equação de taxa de alimentação ajustada descrito na literatura 3 e na secção de resultados representativos apresentados a seguir.
    2. Usar a informação mais recente contagem de células (procedimento descrito no passo 5) juntamente com a previsão do crescimento, e as medições médias de glucose para estimar a taxa de alimentação necessária para manter a desejada concentração de glucose na cultura.
      NOTA: As taxas de crescimento de células e as taxas de consumo de glucose terá de ser obtida antes de fazer estes procedimentos.
    3. Defina a velocidade da bomba com base na taxa de alimentação calculado.
  5. Repita o cálculo da taxa de alimentação e ajustar a velocidade da bomba para cada ponto de amostragem (a cada três dias para o método descrito).

6. contagens de células, viabilidade e as medições da concentração de glicose

  1. Recolher amostras de cada biorreactor de três em três dias, ou se o desejar.
  2. Tome amostras de cultura a partir de culturas SSB continuamente alimentado usando a porta de amostragem especializada descrito acima.
    1. Deixando o SSB continuamente alimentada dentro do biorreator, anexar uma seringa estéril (a seringa de 5 ml de volume foi utilizado para estes estudos) para conexão filtrada-un do porto de amostragem.
    2. Mover o tubo de recolha de amostras para dentro do meio de cultura.
    3. Soltar a secção do tubo vai da seringa, e retirar o volume da amostra total desejado.
    4. Mover o tubo de amostragem para cima de modo que já não se encontra submersa na cultura, e continuar a retirar a seringa até que o ar é removido.
    5. Prender o tubo que alimenta a seringa e retire a seringa contendo a amostra, e reserve.
    6. Pré-carregar uma segunda seringa estéril fresco com o ar, e anexar ao lado de filtro estéril do porto de amostragem.
    7. Soltar o tubo vai para o lado do filtro de seringa deo orifício de amostragem, e depois purgar o orifício de amostragem, por expulsão suavemente o ar na seringa através do filtro estéril. Isso garante que o orifício de amostragem será claro de qualquer meio residual.
    8. Re-apertar o tubo vai para o filtro, desconecte a seringa estéril e descartá-lo.
  3. Aqui a seringa que contém a amostra de células a partir da cultura, e expeli-lo para um tubo de 10 ml. Sub-amostras de volumes conhecidos podem ser tomadas directamente a partir deste tubo.
  4. Para contagem de células, remover um volume conhecido de células e transferir para um tubo de micro-centrifugação, e suavemente centrifugar durante 1-2 min (cerca de 50 x gravidade).
  5. Transferir o sobrenadante para um tubo separado para medições de glucose, e re-suspender o grânulo com o mesmo volume de solução de tripsina-EDTA (0,25% (w v) de tripsina / EDTA 0,53 mM), e contar em triplicado utilizando um hemocitómetro padrão com tripano azul coloração tal como descrito na literatura 53.
    1. Adicionar meio (com soro) paraa amostra de diluição conforme necessário.
    2. Contar as células, e calcular a viabilidade celular através da gravação de células vivas (não coradas), e células mortas (manchadas) de forma independente (de viabilidade% = células vivas / células totais).
  6. Medir os níveis de glicose médio em triplicado utilizando um medidor de glicose no sangue e de uso único tiras-teste.
    1. Tome as medições de glicose, conforme descrito nas instruções do medidor de glicose substituindo o meio de cultura de sangue.
    2. Mergulhe a tira de teste no médio a ser testado (recolhidos a partir de amostras de contagem acima), e repita para o número desejado de repetições (três repetições são recomendados).
    3. Testar tanto o meio fresco e médio resíduos para as concentrações de glicose.
      NOTA: Para alguns metros, medições menor do que 20 mg / dl (limite detectável do medidor), pode ser observada como um erro na saída do medidor.

7. Medidas Colonização Taxa Spheroid

  1. Para assegurar que CELclusters de l não estão sendo removidos pelo sistema de alimentação contínua, medir a taxa de sedimentação de esferóides beta-TC6, observando sua sedimentação em um grande pipeta de plástico de diâmetro.
  2. células de cultura de p-TC6 em biorreactores SSB para formar esferóides como descrito acima.
  3. Após 3 dias de cultura, levar 30 ml amostras da suspensão esferóide e coloque em um tubo de 50 ml.
  4. Suavemente pipetar para cima e para baixo usando uma grande diâmetro 25 ml de pipeta para distribuir uniformemente na suspensão, em seguida, parar pipetagem com a suspensão a um nível conhecido na pipeta (por exemplo, 20 ml de marca), e, em seguida, gravar o momento de todos os esferóides de contentar 5 cm.
  5. Repita este procedimento vezes suficientes para atingir confiança estatística (geralmente n> 3).
    NOTA: Para estudos biológicos, um valor de p menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo quando comparando as medições. O erro padrão da média foi utilizada para erros de reporte, e os dois cauda teste t de Student emparelhado-unfoi usado para comparar as condições para os dados apresentados.

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Resultados

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Níveis de glicose médio e flutuações Restringir Expansão celular em culturas SSB Padrão

Os níveis de glicose flutuar nas culturas estáticas e culturas SSB durante todo o período de cultura 3. Estas flutuações intensificar com o aumento do número de células durante o período de cultura de 21 dias e eram quase idênticas em ambas as culturas estáticas e SSB. Estas observações são apresentados na nossa publicação anterior 3. Os níveis de glicose pode ser su...

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Discussão

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Geração de produtos de células de mamíferos para a produção de agentes biológicos e para terapias celulares requer a cultura e monitorização de células de mamífero em grande escala 55-58. Além disso, estas aplicações requerem condições de cultura definidas e validadas. Simplesmente aumentar o volume de células usando tecnologias de pesquisa não vai atender a todos esses requisitos. Manual de alterações a médio causando flutuações em nutrientes e acúmulo de resíduos de produtos reduzir a ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a Michael Garwood e Sam Stein por seus comentários úteis e a Kristen M. Maynard pela ajuda na preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
β Células TC-6ATCC, Manassas, VACRL-11506Linha celular de insulinoma de camundongo (tipo de célula aderente)
DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAVeja abaixo os números do produto 
DMEM Glicose Alta (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM Glicose Baixa (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note que este meio já contém piruvato)
L-glutaminaInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product
Sodium PyruvateInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
Soro suíno inativado por calorGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Tripsina-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
T-150 Frascos tratados com cultura de tecidosCorning, Corning, NY430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
& categoryname=
NuAire Incubadora de cultura de célulasPrinceton, MNUS Autoflow. Qualquer incubadora de cultura de células reguladora de CO2 com camisa de água pode ser usada.
CentrífugaSorvall RT 7 (Qualquer centrífuga de bancada semelhante pode ser usada)
GeladeiraQualquer refrigerador de laboratório pode ser usado (uma pequena versão de mesa foi usada para esses estudos)
Garrafa de vidro de 1 LCorning, Corning, NY1395-1LQualquer fornecedor pode ser usado. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
& categoryname=
2 L Garrafa de VidroCorning, Corning, NY1395-2LQualquer fornecedor pode ser usado
biorreatores agitados de 250 ml Corning, Corning, NY4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
& categoryname=
Placa de AgitaçãoFisher Scientific11-496-104AQualquer placa de agitação segura para incubadora pode ser usada, qualquer fornecedor
Placas de Cultura de Tecidos 100 mm de DiâmetroNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 Qualquer fornecedor pode ser usado (encomendado através da Fisher Sci)
Tubos Cônicos FALCON 50 mlFalcon, San Jose, CA1256598Qualquer fornecedor pode ser usado
Plástico Delran Usado para Peças PersonalizadasMcMaster CarrVáriosQualquer material de escolha pode ser usado, mas Deran é escolhido porque é seguro para autoclave, não reativo e fácil de usinar. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Tubo de Aço Inoxidável para tampas personalizadasMcMaster CarrVáriosQualquer fornecedor pode ser usado. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Tampas de biorreator Delran modificadas personalizadas para alimentação contínuaNãotenho conhecimento de nenhum fornecedor que produza um produto similar
Tampas de garrafas de vidro modificadas personalizadas para alimentaçãocontínua FeitasAlguns fornecedores (e.g., Fischer Sci, Corning) fabricam produtos semelhantes nos links abaixo.
Bomba Peristáltica Digital Masterflex ColeParmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25Qualquer bomba peristáltica de precisão pode ser usada. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
Conectores de tubulação PVDF (vários)Cole Parmer, Vernon Hills, ILveja o linkQualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Tubulação BPT Pharmed L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Tubulação BPT Parmada L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Tubulação BPT Parmada L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Membrana Millipore Millex GP PES 0,22 µ l filtro de seringa estéril (usado para ventilação e filtração média)Fisher ScientificSLGP033RSQualquer fornecedor pode ser usado
Pipeta graduada de 25 ml FisherScientific13-678-11Qualquer fornecedor pode ser usado, e vários tamanhos podem ser usados
PipetterFisher Scientific13-681-15EQualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado
HemocitômetroFisher Scientific02-671-6Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
Microscópio de Luz InvertidaLeicaQualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado
Medidor de Glicose no Sangue One Touch UltraFisher Scientific22-029-293Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado (e.g., Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 Qualquer fornecedor ou produto similar pode ser usado (por exemplo, Bayer)
sob medida

Referências

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