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Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

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DOI:

10.3791/52227

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30 de novembro de 2015

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1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma metodologia para o processamento de sangue total para obter uma variedade de componentes para análise posterior. Otimizamos um protocolo simplificado que permite o processamento simultâneo rápido e de alto rendimento de amostras de sangue total em um ambiente não clínico.

Resumo

Coleta e processamento de amostras de sangue total em um ambiente não-clínica oferece uma oportunidade única para avaliar indivíduos residentes na comunidade com e sem condições pré-existentes. Transformação rápida destas amostras é essencial para evitar a degradação dos componentes celulares principais. Incluem-se aqui métodos para simultânea de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), DNA, RNA e isolamento de soro a partir de uma única coleta de sangue realizados nas casas dos consentindo participantes através de uma área metropolitana, com o processamento iniciado no prazo de 2 horas da coleta. Temos usado essas técnicas para processar mais de 1.600 amostras de sangue produzindo, materiais de alta qualidade consistente, o que foi posteriormente utilizado na metilação do DNA, genotipagem, expressão gênica bem sucedido e citometria de fluxo analisa. Alguns dos métodos empregados são padrão; No entanto, quando combinados da maneira descrita, permitem um processamento eficiente das amostras a partir de participantes de populacional e / ou comunitáriaestudos baseados que normalmente não seriam avaliadas em um ambiente clínico. Por conseguinte, este protocolo tem o potencial de se obter amostras de dados (e, posteriormente), que são mais representativas da população geral.

Introdução

Vários estudos têm caracterizado diferenças na expressão genética, a metilação do DNA e subconjunto de células no sangue entre os indivíduos com e sem mental (ou outras) doenças 1-4. Esses estudos, no entanto, foram obtidos a partir de situações clínicas em que as diferenças associados à doença podem ser ampliadas devido à natureza geralmente mais grave das doenças para as quais os pacientes procuram tratamento. Devido aos avanços na "ómicas" abordagens, a última década assistiu a uma explosão de interesse em obter amostras biológicas de comunidade e / ou contextos epidemiológicos 5-7, a fim de fornecer estimativas populacionais de prevalência da doença e um quadro mais amplo do determinantes ambientais destas doenças mentais e / ou físicas.

Um desafio fundamental a este respeito é a exigência de um rápido processamento dos espécimes coletados. Degradação de células mononucleares, os componentes do sistema imunológico que são fundamentais frequently utilizado para avaliar a saúde de um indivíduo, começa imediatamente após a colheita de sangue com uma diminuição significativa na recuperação após 2 horas de recolha de 8-10. Para enfrentar esse desafio, apresentamos um protocolo otimizado em que vários componentes do sangue humano são simultaneamente isolado a partir de amostras obtidas nas casas de indivíduos que vivem em uma grande área metropolitana. O protocolo é baseado em nossa compilação e modificação das técnicas atuais, incluindo o armazenamento de todas as frações "extra" em caso futuras técnicas permitem um maior isolamento / análises. Enquanto os métodos alternativos ou estojos podem ser utilizados no lugar dos métodos descritos aqui individuais, aqueles descritos provaram ser um meio fiável e eficiente para o processamento de amostras de um modo de alto rendimento. Frações de alta qualidade (PBMC, DNA, soro e RNA) de sangue fresco pode ser produzido dentro de 2 horas de coleta e todos os espécimes de ensaio-pronto pode estar disponível dentro de 2 dias (Figura 1).

Este protocolo foi desenvolvido para permitir o processamento eficiente de amostras coletadas de comunidade-moradia, adultos residentes na cidade de Detroit para testes no Estudo de Saúde Bairro Detroit (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) uma base populacional, estudo dos determinantes sociais e biológicas do transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) e outras doenças mentais. A prevalência de TEPT em Detroit é mais do que o dobro da média nacional 11,12. Identificar os determinantes biológicos de PTSD nesta população pode ajudar a desenvolver farmacológico adequado e / ou intervenções cognitivo-comportamentais para ajudar aqueles que sofrem de transtorno, tanto na população urbana, e em outras populações de alto risco (por exemplo, retornando veteranos militares). Nosso laboratório, anteriormente localizado na Wayne State University, em Detroit, Michigan, foi selecionado para o processamento com base em nossa experiência em lidar com amostras de tecido fresco derivadas de uma variedadede fontes, a necessidade de começar a processar as amostras no prazo de 2 horas da coleta, e nossa proximidade com os locais de coleta. Com esta oportunidade única na mão, o nosso objetivo foi otimizar o processamento para maior rendimento de DNA, RNA, soro e células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de cada amostra (de um total de n = 1.639 amostras ao longo de 5 ondas de coleta de amostra). Os procedimentos descritos aqui podem ser realizadas simultaneamente num ambiente não-clínica, produzindo, assim, o material (ver Tabela 1 para os rendimentos médios) a partir de um grande número de aplicações a jusante, incluindo microarrays, epigenética, em tempo real de RT-PCR, e a citometria de fluxo análises.

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Figura 1. fluxo geral de trabalho. O processo global descrito aqui inclui a logística de obtenção das amostras de sangue de identificar consentindo participants para o sangue desenhar a si próprio. De alta qualidade, as fracções (células mononucleares do sangue periférico; PBMC, ADN, soro, ARN) e de sangue inteiro fresco pode ser produzido dentro de 2 horas de recolha e todas as amostras de ensaio prontos podem estar disponíveis no prazo de 2 dias. Além disso, as fracções preparadas por este método são adequados para armazenamento a longo prazo se as amostras não são para ser testada imediatamente. Todo o cronograma descrito aqui pode ser concluído em um único dia (~ 5 horas total). No entanto, um tal dia seria extremamente trabalhoso, especialmente para um único técnico com experiência substancial com as técnicas. Assim, recomendamos dividindo os procedimentos no dia 1 entre pelo menos dois técnicos e concluir o processamento do RNA no dia 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

O Estudo de Saúde Detroit Neighborhood foi revisado e aprovado pela Universidade de Institutional Review Board do Michigan. Todos os participantes forneceram consentimento informado antes de sua participação no estudo.

1. Visão Geral

  1. Documentado corretamente todas as fases de recrutamento através da análise de dados do nó de extremidade. Executar os protocolos no dia 1 simultaneamente, alternando fases e sobrepondo o tempo permitir. A sequência de estágios é escrito para otimizar a eficiência de desempenho. A Figura 1 fornece uma visão geral de todo o processo.
    Nota: O termo "participante" é usada em toda a significar a amostra de sangue identificou-de colher de um indivíduo consentir. Os tempos entre parênteses indicam abaixo hands-on tempo. Exemplos de acompanhamento e a folha de registo da amostra pode ser encontrada nas tabelas suplementares S1 e S2, respectivamente. As amostras são coletadas por phlebotomists em casasde indivíduos identificados como consentindo participantes pelo coordenador do estudo e transportados para o laboratório por um mensageiro (ver Informações Suplementares (SI) 1 Para mais detalhes de pré-processamento).

2. Dia 1 Setup

  1. Preparar solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS).
  2. Pré-aqueça um bloco de calor a 56 ºC.
  3. Prepare a protease (ver SI 2) por alíquotas de 20 ul para o número apropriado de tubos de microcentrífuga para as entregas do dia (2 por participante).
  4. Assegurar buffers AW1 e AW2 (tampões de lavagem fornecidas com o kit de isolamento de ADN que aumentam a pureza do DNA) estão prontas para uso, a adição de etanol a 100%, conforme indicado no rótulo, se necessário.
  5. Arrefecer centrífuga refrigerada a 4 ° C.
  6. Recoloque a tampa do frasco de 1x PBS com a tampa de septo de borracha fornecida e perfurar a membrana de borracha com um bico de transferência, mantendo a tampa de rosca no topo do spi transferênciake para evitar a evaporação. Repita com a garrafa de solução de estabilização RNA.
  7. A seguir à preparação do bloco de tampões, centrífuga e de calor, registar o tempo de entrega Vacutainer na folha de rastreamento da amostra (ver Tabela SI).

3. Dia 1: Processamento de amostra de sangue total para o DNA, RNA PBMC e leucócitos (2 h)

  1. Visão geral
    1. Alocar tempo suficiente para minimizar o atraso entre a coleta de sangue e hora de início o processamento. Iniciar o processamento dos Ficoll contendo vacutainers dentro de 2 horas de coleta de sangue para evitar um aumento da contaminação de glóbulos vermelhos e uma diminuição na recuperação de células mononucleares.
    2. Suponha recolha de 2 vacutainers contendo gel de gradiente de Ficoll, 2 K 2 ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), e 1 vacutainers Vacutainer soro por participante adulto. Após a entrega das vacutainers para o laboratório, têm um técnico de assinar a aceitação significando folha de rastreamento das amostras. Implorarno processamento imediatamente com a hora de início documentado em uma base por Vacutainer no registo de amostra.
  2. Soro Isolamento Fase 1 (1 min)
    1. Documentar a hora de início no registro da amostra (ver quadro SI 2). Centrífuga (com freio e aceleração OFF) o vacutainer 7,0 ml de soro (vermelho) (1 por participante) usando um rotor de caçamba móvel com tampas de aerossóis (nível de biossegurança 2; BSL2 autenticada) por 20 min, 1300 xg, 4 ºC.
  3. Isolamento de DNA Fase 1 (15 min)
    Nota: Para mais detalhes sobre este procedimento de isolamento, consulte o protocolo do fabricante 13.
    1. Documentar a hora de início. Num capuz de cultura de células BSL2, inverter os vacutainers contendo o gel de Ficoll 5 vezes, em seguida, adicionar 200 uL de sangue total a partir do topo de um dos vacutainers em cada uma das duas aliquotas de 20 ul de protease (400 mL no total) por participante. Deixando os protease + microcentrífuga sangue tubos na capa, continue para a centrifugation do Ficoll contendo vacutainers no passo 3.4.1.
      Nota: Utilizar o Vacutainer com o maior volume de recolha, tendo em mente a necessidade de equilibrar a centrifugadora (isto é, pode ser necessário remover a 200 ul a partir de cada um dos dois vacutainers) ao girar a vacutainers no passo 3.4.1. Além disso, para assegurar uma separação adequada durante o processamento dos vacutainers azul, o nível de sangue que permanece no recipiente sob vácuo não deve ser inferior a 2,5 polegadas acima da camada de Ficoll.
  4. Isolamento de PBMC Fase 1 (1 min)
    1. Documentar a hora de início (deve estar dentro de 2 horas de coleta de sangue para evitar um aumento da contaminação de glóbulos vermelhos e uma diminuição na recuperação de células mononucleares) .Invert o Ficoll contendo vacutainers 8-10 vezes. Centrífuga (com freio e aceleração OFF) os vacutainers (2 por participante) usando um rotor de caçamba móvel com tampas de aerossóis (BSL2 certificado) para 30 min, 1600 xg, 22 ° C.
  5. Isolamento de ADN Fase 2 (20 min)
    1. Retornar para a capa e adicionar 200 mL de buffer AL a cada um dos tubos de protease + sangue microcentrífuga (etapa 3.3.1). Cap, retire do capô, vortex 15 seg e rotação flash.
    2. Incubar 56 ºC em um bloco de aquecimento, 10 min.
    3. Retirar os tubos do bloco de calor. Rotação Flash. Voltar para o capô BSL2. Adicionar 200 ul de etanol a 100%. Cap, retire do capô, vortex 15 seg e rotação flash. As demais etapas pode ser concluído fora do capô.
    4. Aplicar lisado (dentro de 30 minutos do passo 3.5.3) para uma coluna de centrifugação marcado (num tubo de recolha de 2 mL). Feche a tampa para evitar a contaminação cruzada através de aerossóis. Centrífuga 6000 xg, 1 min.
    5. Descarte o tubo de recolha que contém o filtrado e coloque a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.
    6. Adicionar 500 mL de buffer AW1 para a coluna sem umedecendo o aro, feche a tampa, e centrifugar 6000 xg, 1 min.
    7. Descarte o tubo de coleta contendo a filtrate e colocar a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.
    8. Adicionar 500 mL de buffer AW2 para a coluna sem umedecendo o aro, feche a tampa, e centrifugar 20.000 xg, 3 min.
    9. Rejeitar o tubo de recolha que contém o filtrado e colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 1,5 ml (não incluída no kit), e centrifuga-se 20.000 xg, 1 min.
    10. Rejeitar o tubo de recolha que contém o filtrado e colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 1,5 ml (não incluído no estojo).
    11. Adicionar 200 ul de tampão AE ou água para cada coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min. Centrífuga 6000 xg, 1 min.
    12. Repita o passo 3.5.11 eluição no mesmo tubo de coleta.
    13. A piscina do DNA fluido das 2 colunas por participante. Rendimento total ~ 800 ul por participante.
    14. Quantificar as amostras usando um espectrofotômetro quando o tempo permite.
    15. Aliquota de ADN tal como desejado em 2 ml criotubos, que documentam a concentração de cada um na specimelog n. Transferência para criotubos e um cryobox lugar à temperatura de -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Documentar a hora de início congelador.
  6. Isolamento de ARN de leucócitos Fase 1 (30 min)
    Nota: Executar em uma capa de cultura de célula certificada Nível de Biossegurança 2. Para mais detalhes sobre esse isolamento veja as instruções do fabricante 15.
    1. Perfurar a membrana de borracha do K 2 EDTA vacutainer com um bico de transferência. Reter a bainha e tampa de rosca para uso na etapa 3.6.11. Seguindo práticas padrão BSL2, ter o cuidado de evitar a exposição a patógenos.
    2. Ligue o conector deslizamento branca ao topo do bico de transferência.
    3. Rotular o filtro com o ID participante correspondente em seguida, ligue a entrada (extremidade alargada) do filtro ao conector de deslizamento branco.
    4. Anexar uma agulha com bainha 25⅝ G para a saída (extremidade cónica) do filtro. Preparando o conjunto do filtro antes da entrega acelera consideravelmente e, por conseguinte, o processo,fixar o conector de deslizamento branco para o bico de transferência, a adição do filtro, em seguida, a agulha embainhada e ajustando a montagem num suporte de tubos de cultura até à sua utilização, é recomendado.
    5. Após montagem do sistema de tubos EDTA K 2, unsheathe com segurança a agulha (utilize a extremidade de uma espátula de metal). Esfaquear a agulha num 10 ml tubo vazio coleta de sangue evacuados (tubo de receptor de soro) e inverter o conjunto do tubo de K 2 EDTA vacutainer / filtro / receptor. Seguindo práticas padrão BSL2, ter o cuidado de evitar a exposição a patógenos.
    6. Permitir que o sangue para filtrar através até que as secções em forma de cunha de o filtro ter limpo de sangue. A filtração leva cerca de 2 min e pode ser colocado num suporte de tubos de ensaio durante a filtração.
    7. Retire o filtro do conjunto. Deixe a agulha no tubo que contém o filtrado e descartar todo o conjunto em um recipiente Sharps.
    8. Anexar uma seringa de 5 ml para o bico de transferência no frasco de 1x PBS, emverter o frasco, e retirar-se 3 ml.
    9. Introduzir a seringa com PBS para a entrada do filtro e lavar o filtro (3-5 gotas por segundo). Recolher o flow-through em um recipiente de resíduos biológicos. Retire a seringa do filtro sem retrair o êmbolo.
    10. Após filtração e uma lavagem com PBS, 3 ml de retirar o agente de estabilização de RNA usando uma nova seringa de 5 ml e o método descrito no passo 3.6.8. Lave o filtro como no passo 3.6.9. O agente de estabilização de ARN deve permanecer no filtro. Retire a seringa do filtro sem retrair o êmbolo.
    11. Selar a entrada do filtro e saída com a tampa da bainha e parafuso retidos a partir do bico de transferência deixando o filtro saturado com o agente de estabilização de RNA. O filtro pode ser armazenado neste ponto. Guarde o filtro a -80 ºC até que o tempo permitir (~ 2 h) para completar os passos 5.3 a 5.4.7.
      Nota: Filtros armazenadas a -80 ºC por até um ano após a coleta foram processados ​​sem uma reduSE na qualidade de ARN.
  7. Isolamento de PBMC Fase 2 (30 min)
    1. Remova os Ficoll contendo vacutainers da centrífuga (passo 3.4.1) e continuar em uma capa BSL2. Vacutainers deve exibir separação como na Figura 2. Se não, ver Tabela 2.
    2. Uma vez que o vacutainer é devolvido para a capa BSL2, retire a tampa e retire 1,5 ml de topo, amarelado, camada de plasma (Figura 2) utilizando uma pipeta sorológica sem ficar perto da mononuclear (branco claro /) camada. Transfira o plasma para a 5 ml cryovial - (Pool de 2 vacutainers - 1 participante). Registrar o volume coletado. Veja o passo 3.7.6 para instruções de armazenamento.
      Nota: O melhor separação e maiores rendimentos PBMC vêm de participantes que tenham em jejum, pelo menos, 12 horas antes da coleta de sangue.
    3. Transfira o plasma remanescente e a camada esbranquiçada, mononuclear (tudo acima da camada de gel - A figura 2) ucantar uma pipeta serológica, para um tubo cónico de 15 ml, juntando a camada de células mononucleares a partir de cada um dos dois Ficoll contendo vacutainers por participante num tubo cónico.
    4. Adicionar 1x PBS para perfazer o volume total no tubo cónico de 15 ml. Tape o tubo e inverta 5 vezes. Centrífuga (com freio e aceleração OFF) 15 min, 300 x g, 22 ° C.
    5. Voltar à Ficoll contendo vacutainers na capa e recolher as células vermelhas do sangue (RBC), utilizando um "pipeta de Pasteur 5¾ a girar em torno e soltar a parte externa da camada de gel de Ficoll e removê-lo, se possível. Usar uma pipeta serológica para recolher e transferir a RBCs (~ 4,5 ml) para um frasco de congelação 5 ml. Registrar o volume coletado.
    6. Transferir ambos os 5 ml de plasma em criotubos (passo 3.7.2 e glóbulos vermelhos no passo 3.7.5) para um recipiente de congelamento controlado e colocar a -80 ° C durante pelo menos 24 horas, após o que eles podem ser transferidos para um cryobox e voltou a -80 ºC para armazenamento a longo prazo.
    7. Retorne o conica para o tubo exaustor, quando a centrifugação no passo 3.7.4 está completa, e aspirar todo mas ~ 500 ul de PBS sem perturbar o sedimento. Rendimento de PBMC é maior se ~ 200 ul de PBS é deixado acima da pelete, nesta fase.
    8. Adicionar PBS 1x fresco para levar o volume até 10 ml. Delicadamente ressuspender o sedimento. Tape o tubo e inverta 5 vezes. Centrífuga (com freio e aceleração OFF) 10 min, 300 x g, 22 ° C.
  8. Soro andar de isolamento 2 (10 min)
    Nota: Executar em uma capa BSL2.
    1. Alíquota da camada superior do soro Vacutainer soro, após a centrifugação (passo 3.2.1), em 2 ml criotubos como desejado. Rendimento típico é de 2,5 ml (Tabela 1). Registrar o volume. Por exemplo, usar 4 cryovials alíquotas de 200 ul em cryovial 1, 1.000 ul em cryovial 2 e, em seguida, dividir o restante em cryovials 3 e 4.
    2. Transferir os criotubos para um cryobox lugar e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Documente o início congeladorTempo.
  9. Isolamento de PBMC Fase 3 (15 min)
    1. E volta para o capuz, após a centrifugação (passo 3.7.8), e aspirado tanto sobrenadante / PBS quanto possível, sem perturbar o sedimento. Ressuspender pellet por pipetagem em 2,5 ml PBMC Congelamento Médio 1 (ver SI 2).
    2. Adicionar 2,5 ml de meio de congelação 2 de PBMC (ver SI 2) para o / solução de meio de células no passo 3.9.1. Vortex suavemente.
    3. Alíquota de 10 ul da solução de células para um tubo de microcentrífuga de 0,65 ml (diluição adicional pode ser necessário). Adicionar 10 ul de tripano a 0,4% apresentam uma coloração azul para dentro do tubo de microcentrífuga de 0,65 ml e misturar por pipetagem várias vezes. Para mais detalhes veja o manual do fabricante 16.
    4. Pipetar 10 ul da mistura numa célula de contagem corrediça câmara lugar e deslize para o contador de células dentro de 3 minutos de mistura. Zoom e foco as células. Pressione o botão "Contagem de Células" para obter contar PBMC.
    5. Alíquota, se o viávelNúmero de PBMC é superior a 3 milhões de células por mililitro (mc / ml), conforme se desejar em criotubos e continuar para o passo 3.9.9. Armazenar as CMSPs em criotubos até 5 a uma concentração de pelo menos 3 mc / ml cada.
    6. Se o número de PBMC viáveis ​​é inferior a 3 mc / ml, calcular o número total de células através da multiplicação da viável mc / ml com 5 ml. Dividir esse número por 4, 3, 2 ou 1 ml, de modo que haverá pelo menos um tubo com 3 mc / ml.
    7. Centrifugar o tubo cónico contendo as células / solução de meio de congelamento durante 5 minutos a 300 xg (freio e aceleração OFF). Após centrifugação, aspirar o volume apropriado de meio de congelação (sobrenadante), deixando o volume calculado acima (4, 3, 2 ou 1 mL).
    8. Ressuspender o sedimento no sobrenadante restante alíquota e, pelo menos, 3 mc / ml para o número apropriado de criotubos (1-4) em 1 ml / frasco de congelação. Meio de congelação final é 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) / 20% de Soro Fetal Bovino (FBS) / 70% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Document a contagem de células por frasco de congelação. Transferir os criotubos para um recipiente de congelamento controlado e colocar a -80 ° C durante pelo menos 24 h depois do que os criotubos pode ser transferido para um cryobox e colocar em um tanque de azoto líquido (fase vapor) para o armazenamento a longo prazo. Documento congelador a hora de início.

4. Dia 2 Setup

  1. Aquece-se uma alíquota (220 ul por filtro) de livre de nuclease 0,1 mM de EDTA num tubo livre de nuclease a 80 ° C num bloco de aquecimento.
  2. Preparar soluções de lavagem 1 e 2 (ver SI 2).

5. Dia 2: Long Term Amostra de armazenamento e processamento do filtro de leucócitos (3 hr)

  1. Visão geral.
    1. Execute este procedimento no prazo de 6 meses da aplicação dos leucócitos para o filtro.
      Nota: Em geral, Dia 2 processamento leva cerca de 3 horas e enquanto ele é rotulado de "Dia 2", a principal exigência é que a parte de processamento do filtro deve ser realizada em um dia quandonão há dia 1 de processamento que ocorrem no laboratório.
  2. Armazenamento de amostras a longo prazo (15 minutos)
    1. Execute este procedimento todos os dias, antes da entrega de novos vacutainers para o laboratório para o dia 1 de processamento. Transfira os criotubos que foram armazenados O / N em recipientes de congelamento controlado no Dia 1 em cryoboxes devidamente rotulados e devolvê-los aos -80 ºC ou nitrogênio líquido (fase de vapor) para o armazenamento de longo prazo. Organizar as criotubos com base no tipo de amostra (por exemplo, ADN, as PBMC, RBCs, etc.) para acelerar a localização da amostra de rastreamento para ensaios de ponto final.
  3. Leucócitos Filtros de ARN de processamento (45 min).
    Nota: Para mais informações sobre este procedimento ver as instruções do fabricante 17.
    1. Traga o filtro à temperatura ambiente (cerca de 5 min a descongelação).
    2. Remover a tampa de rosca e invólucro do filtro. Retrair o êmbolo de uma seringa de 5 ml e conectá-lo à entrada (extremidade alargada) do filtro, pressionar o êmbolopara expelir o agente de estabilização de RNA a partir dos portos filtrar para um recipiente de resíduos biológicos.
    3. Carregar uma nova seringa de 5 mL com 4 ml de uma solução de isotiocianato de f enol e de guanidina para o isolamento de ARN e coloque-o da entrada do filtro, pressionar o êmbolo para esvaziar a solução através do filtro, recolhendo o lisado num tubo de 15 mL cónico marcado (2 por participante).
    4. Desconecte a seringa do filtro, retrair o êmbolo, anexá-lo novamente para o filtro, e pressionar o êmbolo para expulsar amostra residual preso no disco de filtro para os mesmos 15 ml tubo cônico. Descarte o filtro ea seringa.
    5. Adicionar 800 ul BCP para o tubo cônico, fechar o tubo firmemente e agitar vigorosamente a preparação durante 30 segundos.
    6. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar durante 10 minutos a 2.000 x g.
    7. Transferir a fase (topo) aquosa para um recém-rotulados tubo de 15 ml (~ 2,5 mL).
    8. Adicionar 0,5 vezes o volume da fase aquosa de um livre de nuclease de águad misture bem. Em seguida, adicionar 1,25x o volume aquosa de etanol a 100% e misturar novamente.
      Nota: Para um volume aquoso 2,5 ml, adicionar 1,25 ml de água livre de nuclease, misture, em seguida, adicionar 4,7 ml de etanol a 100% (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml água livre de nuclease ENTÃO 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml novo volume aquoso ENTÃO 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml de etanol a 100%). Este passo permite que o isolamento de ARN total, que inclui a fracção de ARN pequenas. Um método para omitir os pequenos RNAs de isolamento podem ser encontrados no manual 17.
    9. Retirar o êmbolo de uma seringa de 5 ml e inserir um cartucho de rotação no seu lugar. Fixe o conjunto do cartucho / seringa para um tubo de vácuo. Para uma conexão mais segura para o colector de vácuo, coloque o conjunto do cartucho / seringa dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, com o fundo cortado.
    10. Aplicar a amostra a partir do passo 5.3.8 ao cartuxo giratório lentamente com o vácuo na, adicionando mais cuidadosamente amostra tal como é puxado através do cartucho.
      Nota: Se nenhum vácuo éActualmente, ver método de centrifugação a http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
    11. Transferir o cartucho de rotação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 750 ul de lavagem 1. Centrifugar o cartucho de rotação / conjunto do tubo de 5 - 10 segundos a 12.000 x g.
    12. Descartar filtrado a partir do tubo e devolver o cartucho de rotação para o mesmo tubo de microcentrífuga.
    13. Adicionar 750 mL de lavagem 2 e centrifugar o cartucho de rotação / tubo para 5 - 10 segundos a 12.000 x g. Descarte filtrado como no passo 5.3.12. Devolver o cartucho de rotação para o mesmo tubo de microcentrífuga.
    14. Repita com outros 750 mL de lavagem e centrifugação 2 como no passo 5.3.13. Filtrado descarte. Devolver o cartucho de rotação para o mesmo tubo de microcentrífuga. Centrifuga-se o cartucho de rotação / tubo à velocidade máxima durante 1 min para secar o filtro.
    15. Transferir o cartucho de rotação para um novo, rotulado tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    16. Adicionar 200 ul de EDTA mM livre de nuclease 0,1 (pré-aquecido a 80 & #176; C) para o centro do filtro de cartucho de rotação (por participante 2). Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
    17. Centrifugar durante 1 minuto a 12000 xg para eluir o ARN. Manter o filtrado. Descarte cartucho de rotação.
    18. Dividir cada filtrado 200 mL em duas, 100 mL alíquotas de 1,5 ml em frescos microtubos, rótulo e manter em gelo. Neste ponto, começando com 2 filtros por participante produzirá quatro alíquotas de 100 ul de ARN por participante.
  4. Tratamento de DNase (1 h)
    Nota: Para mais detalhes sobre este tratamento ver protocolo do fabricante 18.
    1. Criar uma mistura principal, combinando 10 ml de DNase I Tampão e 2 ul rDNase I por alíquota + 1 (a conta para a pipetagem de erro).
      Nota: Para as quatro amostras, alíquotas de 100 ul 50 ul utilizar ADNase I + 10 ul de tampão de rDNase I.
    2. Alíquota de 12 ul da mistura principal no passo 5.4.1 em cada uma das alíquotas de RNA a partir do passo 5.3.18 e misture delicadamente. Incubar a 37° C durante 30 min num bloco de calor.
    3. Vortex do Reagente de Inactivação DNase e adicionar 11,2 ul para cada alíquota, misture bem. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min vortex 2-3 vezes durante a incubação.
    4. Centrifugar a 10.000 xg durante 1,5 min.
    5. Transferir o sobrenadante (ARN) para um novo tubo de 1,5 ml. Aliquotas da mesma participante podem ser reunidas aqui.
    6. Executar cada amostra num espectros otómetro para obter a concentração. A análise do RNA de qualidade é recomendado utilizar um Bioanalyzer (veja o passo 5.5).
    7. Alíquota da RNA em criotubos como desejado. Se uma análise Bioanalyzer não irá ser realizada imediatamente, alíquota de 1,5 ul de amostra para um tubo de microcentrífuga para análise posterior. Documentar as concentrações ea hora de início congelador. Armazene as amostras a -80 ° C.
  5. Análise Bioanalyzer (1 hr)
    1. Siga o protocolo do fabricante 19. Quando a execução é concluída, os dados são automaticamente armazenados, mas salvá-lo novamente wom um menor, nome do arquivo mais reconhecível. Resultados esperados (Figura 3): a escada deve ter picos 6, as amostras devem ter picos de 3 (2 picos ribossomais em 44 seg e 50 seg, respectivamente, e um pico de marcador precoce a 25 seg).

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Resultados

É essencial que o procedimento geral produzir material de alta qualidade, para análise num grande número de aplicações a jusante, incluindo a expressão do gene através de microarray e análise por RT-PCR, a detecção de modificações epigenética, e variações de subconjuntos de células. A Tabela 1 indica que o rendimento médio e qualidade de materiais a partir de cada um dos processos. A Figura 3 proporciona um exemplo de saída dos métodos de processamento de isolamento de ARN de leucócitos...

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Discussão

Nós descrevemos um protocolo simplificado que tem sido aplicado com sucesso para processar mais de 1.600 amostras de sangue total no Estudo de Saúde Detroit Neighborhood. Apesar de muitas destas técnicas estão disponíveis na literatura existente, a compilação passo-a-passo, incluindo alterações precisamente programado entre cada passo, reflecte, um protocolo optimizado eficiente que produz com sucesso uma variedade de amostras biológicas com uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo a metilação do DNA, expressão...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Henriette Mair-Meijers pela inestimável atenção aos detalhes e horas dedicadas ao processamento das coletas de sangue. Somos gratos pela experiência em design gráfico de Natalie Jameson Kiesling. Também agradecemos a aprovação dos fabricantes (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) aqui mencionados para publicar o uso de seus produtos conforme descrito. O financiamento para este trabalho foi generosamente fornecido pelos prêmios nacionais do National Institutes of Health números DA022720, RC1MH088283 e DA022720-05-S1.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mini Kit QIAamp DNA BloodQiagen51104Dia 1: Isolamento de DNA
Phosphate-buffered salina (PBS)SigmaP5493-1LDia 1: Isolamento PBMC
5 ¾ ” Pipetas PasteurFisher13-678-6ADia 1: Isolamento PBMC
Soro Fetal Bovino (FBS), inativado por calorLife Technologies10082147Dia 1: Isolamento PBMC
Dimetil Sulfóxido (DMSO)SigmaD8418-500mlDia 1: Isolamento PBMC
RPMI Medium 1640,Invitrogenlíquido 11875119Dia 1: Isolamento PBMC
0,4% mancha azul de tripano InvitrogenT10282Dia 1: Isolamento PBMC
Câmara de Contagem de Células CountessInvitrogenC10283Dia 1: Isolamento PBMC
Contador Automatizado de Células Countess ou dispositivo de contagem de células, como microscópio e hemocitômetroInvitrogenC10281Dia 1: Isolamento PBMC
Fracionamento LeucoLOCK & Kit de Estabilização Ambion1933Dia 1: Isolamento de RNA leucocitário
25  G x 5/8 pol. agulhasBecton Dickinson305122Dia 1: Isolamento de RNA de leucócitos
Seringas (5  ml)Becton Dickinson309646Dias 1 e 2: Isolamento de RNA de leucócitos
de lise desnaturante Ambion8540GDia 2: Isolamento de RNA leucocitário
5  M NaClLife Technologies24740011Dia 2: Isolamento de RNA de leucócitos
TRI Reagent Ambion9738Dia 2: Isolamento de RNA de leucócitos
Bromo-3-cloro-propano (BCP)SigmaB-9673Dia 2: Cartuchos de spin de isolamento de RNA de leucócitos
 Ambion10051GDia 2: Isolamento de RNA leucocitário
0,1  mM EDTAAmbion9912Dia 2: Isolamento de RNA leucocitário
Kit DNA-freeAmbionAM1960Dia 2: Tratamento DNase
RNA 6000 Ladder Agilent5067-1529Dia 2: Análise de bioanalisador
RNA 6000 Nano Series II Kit Agilent5067-1511Dia 2: Análise do bioanalisador
RNaseZAPAmbionAM8782Dia 2: Análise do bioanalisador
Etanol >99%SigmaE7023-500ml
Isopropanol >99% SigmaI9516-500ml
Água ultra pura sem nuclease Invitrogen9938
(sem nuclease)Eppendorf22491253
Pipetter (sorológica)Eppendorf2223020-4
Pipetters (para volumes abaixo de 1  ml)Eppendorf3120000-054
Pipetas (sorológicas)Fisher13-678-27E
Recipientes de congelamento de taxa controladaNalgene5100-0001
Cryoboxes (para comportar 2  ml e 5  ml criogeniais e 1,5  tubos de microcentrífuga ml)Fisher03-395-464
Suporte para tubos de ensaioThermo Scientific14-804-134
15  ml tubos de polipropilenoFisher14-959-49D
1.5  ml e 0,65 tubos de microcentrífugaFisher07-200-534 e 07-200-185
2  ml e 5  ml crioviaisFisher10-500-26 e 10-269-88F 
8  ml CPT vacutainerBD Biosciences3627612 tubos
6  ml K2 EDTA vacutainerBD Biosciences3678632 tubos
8.5  ml SST vacutainerBD Biosciences3679881 tubo
VortexerFisher2215365
Incubadora de banho seco com bloco de aquecimento para tubos de microcentrífugaFisher11-715-1250
Sistema de filtração/vácuo para uso dentro da capa de cultura de célulasFisher01-257-87
Rotor de ângulo fixo para tubos de microcentrífuga com tampaestanque a aerossóisEppendorf22637002
Centrífuga refrigerada com rotor de balde oscilante e tampas à prova de aerossóis para 16 x 125  mm vacutainers e 15  ml tubos de polipropilenoEppendorf226281572, não é necessário refrigerar
Nanodrop 2000 (recomendado para precisão de pequenos volumes) ou outro dispositivo espectrofotométricoFisher13-400-411
Agilent BioanalyzerAgilent TechnologiesG2940CA
Tanque de nitrogênio líquidoThermo Scientific11-676-56
Recipiente para objetos cortantesFisher22-037-970
Recipiente de resíduos biológicosThermo Scientific1223P52
Nível de Biossegurança 2  capuz de cultura de células certificadoThermo Scientific13-261-315
Solução Pontas de pipeta

Referências

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
  14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
  15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
  16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
  17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
  18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
  19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
  20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
  23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
  26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
  27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

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