Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para analisar as interações RNA/proteína. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) é baseado na migração diferencial de complexos de RNA/proteína e RNA livre durante a eletroforese em gel nativo. Usando uma sonda de RNA radiomarcada, os complexos RNA/proteína podem ser visualizados por autorradiografia.

Resumo

Interações RNA / proteínas são fundamentais para vias de regulação pós-transcricional. Entre as proteínas de ligação a ARN citosólicos melhor caracterizados são proteínas reguladoras de ferro, e IRP1 IRP2. Eles ligam-se a elementos responsivos de ferro (IRES) dentro das regiões não traduzidas (UTRs) de vários mRNAs alvo, controlando assim a tradução de mRNAs ou estabilidade. Interações IRE / PIA têm sido amplamente estudados pela EMSA. Aqui, nós descrevemos o protocolo de EMSA para analisar a actividade de ligação de IRE-IRP1 e IRP2, que pode ser generalizado para avaliar a actividade de outras proteínas de ligação a ARN, bem. Um lisato de proteína bruto contendo uma proteína de ligação de ARN, ou uma preparação purificada desta proteína, é incubado com um excesso de ³² sonda de ARN marcada com P, para permitir a formação do complexo. A heparina é adicionado para impedir a proteína não específica para sondar ligação. Subsequentemente, a mistura é analisada por electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida. A sonda livremigra rapidamente, enquanto que o ARN / proteína apresenta complexos de mobilidade retardada; daí, o procedimento também é chamado de "retardamento em gel" ou ensaio "bandshift". Depois de completada a electroforese, o gel é seco e complexos de ARN / proteína, bem como sonda livre, são detectados por auto-radiografia. O objetivo geral do protocolo é para detectar e quantificar IRE / IRP e outras interações RNA / proteína. Além disso, a EMSA também pode ser utilizado para determinar a especificidade, a afinidade de ligação, e a estequiometria da interacção de ARN / proteína sob investigação.

Introdução

A EMSA foi originalmente desenvolvido para o estudo da associação de proteínas de ligação de DNA com sequências de ADN alvo ^1,2. O princípio é semelhante para as interacções de ARN / proteína ^3, o que é o foco deste artigo. Resumidamente, o ARN é negativamente carregado e irá migrar em direcção ao ânodo durante a electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (ou géis de agarose). A migração dentro do gel depende do tamanho do ARN, que é proporcional à sua carga. De ligação específica de uma proteína de ARN altera a sua mobilidade, e as complexo migra mais lenta em comparação com o ARN livre. Isto é devido principalmente a um aumento na....

Protocolo

Os procedimentos experimentais com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da McGill University (protocolo 4966).

1. Preparação de extratos de proteínas a partir de células cultivadas

1. Lavar as células cultivadas duas vezes com 10 ml de fosfato de gelo-solução salina tamponada (PBS).
2. Raspe células aderentes quer com um polícia de borracha ou um raspador de células de plástico em 1 ml de suspensão de PBS, arrefecido com gelo transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Centrifugação numa microcentrífuga durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C. Aspirar PBS.
4. Adicionar 100 ul de t....

Resultados

Uma sonda IRE radiomarcada foi preparada, conforme descrito nas seções 3 e 4 do protocolo. A sequência da sonda foi 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'; os nucleotídeos em negrito representam um resíduo C não pareado e o loop, que são características críticas da IRE. A radioatividade específica da sonda foi de 4,5 x 10⁹ cpm/μg de RNA.

Para avaliar os efeitos de perturbações no ferro sobre a atividade de ligação ao I.......

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo que foi desenvolvido para estudar as atividades de ligação IRE de IRP1 e IRP2, e mostramos dados representativos. Usando diferentes sondas, este protocolo também pode ser ajustado para o estudo de outras proteínas de ligação ao RNA. Uma etapa crítica é o tamanho da sonda. O uso de sondas longas, que é comum quando o local exato de ligação é desconhecido, pode resultar em complexos de RNA/proteína que não migram de forma diferente do RNA livre. Neste caso, é aconselhável remover o RNA não li.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
leupeptina	SIGMA	L2884
PMSF	SIGMA	78830
Ensaio de proteína BioRad	BIORAD	500-0006
T7 RNA polimerase	Termocientífico	EPO111
Inibidor de RNase	Invitrogen	15518-012
UTP [alfa-32P]	Perkin-Elmer
Líquido de cintilação	Beckman Coulter	141349
heparina	SIGMA	H0777
Rnase T1	Thermoscientific	EN0541
Nome do equipamento
Tecido Ruptor	Qiagen	9001271
Contador de cintilação	Beckman Coulter	LS6500
Protean II xi Cell	BIORAD	165-1834
Pentes de 20 poços	BIORAD	165-1868	1,5 mm de espessura
e 1,5 mm	BIORAD	165-1849
PowerPac	BIORAD	164-5070

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