Artigo de método
Apresentamos um procedimento experimental de desenvolvimento de biofilme de Candida albicans em um modelo subcutâneo de camundongo. Os biofilmes fúngicos foram quantificados pela determinação do número de unidades formadoras de colônias e por uma imagem de bioluminescência não invasiva, onde a quantidade de luz produzida corresponde ao número de células viáveis.
Candida albicans desenvolvimento de biofilmes em superfícies bióticos e / ou abióticos representa uma ameaça específica para os pacientes hospitalizados. Até agora, C. albicans biofilmes foram estudadas in vitro, mas predominantemente existe uma necessidade importante para uma melhor compreensão deste processo dinâmico em condições in vivo. Desenvolvemos um modelo de rato in vivo subcutânea para estudar C. formação de biofilme albicans. No nosso modelo, múltiplo (até 9) infectados com Cândida dispositivos são implantados para a parte de trás do animal. Isso nos dá uma grande vantagem sobre o sistema modelo de cateter venoso central, uma vez que nos permite estudar vários biofilmes independentes em um animal. Recentemente, nós adaptamos este modelo para estudar C. albicans desenvolvimento de biofilmes em ratinhos BALB / c. Neste modelo, amadurecer C. biofilmes albicans desenvolver dentro de 48 horas e demonstrar a arquitetura típica biofilme tridimensional. A quantificação de biofilme fúngicaé tradicionalmente analisada post mortem e exige sacrifício host. Uma vez que este requer o uso de muitos animais para realizar estudos cinéticos, aplicou-se a bioluminescência de imagem não invasiva (BLI) longitudinalmente para acompanhar amadurecem in vivo C. albicans biofilmes em desenvolvimento em nosso modelo subcutâneo. C. albicans células foram manipuladas para expressar o gene da luciferase princeps Gaussia (GLIC) ligado à parede celular. O sinal de bioluminescência é produzido pela luciferase que converte o substrato coelenterazina adicionada a luz que pode ser medida. O sinal BLI se assemelhava a contagem de células obtidas de cateteres explantados. Imagem não invasivo para a quantificação da formação de biofilme vivo fornece aplicações imediatas para a triagem e validação de drogas antifúngicas em condições in vivo, bem como para estudos baseados em interações patógeno-hospedeiro, vem contribuindo para uma melhor compreensãoing da patogenia das infecções associadas ao uso de cateter.
Cândida albicans é um organismo comensal, que pode ser encontrada em diferentes locais de indivíduos saudáveis, por exemplo sobre a pele ou como uma parte do tracto gastrointestinal e a flora vaginal. No entanto, em hospitalizados, e especialmente pacientes imunocomprometidos, pode causar uma grande variedade de infecções 1. Nesses indivíduos, o sistema imunológico enfraquecido permite que as células de Candida de divulgar para a corrente sanguínea e invadir tecidos mais profundos causando infecções potencialmente fatais. Além disso, a presença de substratos abióticas, tais como cateteres venosos centrais e urinários, válvulas cardíacas a....
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NOTA: Todas as experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética da KU Leuven (número do projeto 090/2013). Manter animais em conformidade com as orientações de cuidados de animais KU Leuven.
1. C. Crescimento albicans
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Neste estudo, nós mostramos o procedimento cirúrgico de implante do cateter e explante durante in vivo C. albicans desenvolvimento de biofilme em um mouse. Além disso, exibimos a quantificação dos biofilmes maduros não só por classical UFC enumeração, mas também por BLI.
Como mostrado na Figura 1A, não fosforescentes peças cateter de poliuretano foram cortadas em dispositivos 1 cm e subsequentemente revestidas com soro. Esta etapa é muito importante, pois permite qu.......
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O uso de modelos animais, e modelos especialmente roedores, para estudos dedicados a biofilmes microbianos é muito importante porque o sistema imune do hospedeiro é um fator essencial na formação de biofilme que modelos in vitro não pode dar conta. Neste estudo, descrevemos um C. subcutânea relativamente simples albicans modelo biofilme rato, que pode ser facilmente adotada em um laboratório de pesquisa e não requer habilidades técnicas fortes. Este modelo foi inicialmente desenvolvido para es.......
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Este trabalho foi apoiado pelo KU Leuven PF 'IMIR', a comunidade de pesquisa FWO em biologia e ecologia de biofilmes bacterianos e fúngicos (FWO: WO.026.11N) e pelo projeto FWO G.0804.11. A SK agradece à KU Leuven pela bolsa PDMK 11/089 e à FWO pela bolsa de pós-doutorado. Somos gratos a Nico Vangoethem por sua ajuda na preparação das figuras. Agradecemos a Celia Lobo Romero pela assistência técnica durante os procedimentos experimentais in vivo.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Extrato de levedura granulado | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Peptona bacteriológica | Oxoid | LP037B | |
| Ágar granulado | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glicose | Fluka | 49159-5KG | |
| Fosfato tamponado salino | Preparado em laboratório | para 1L de PBS 10x: 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4 | |
| RPMI1640 com L-glutamina e sem carbonato de sódio | Sigma | R6504-1L Prepare-se | de acordo com o protocolo para teste de suscetibilidade a medicamentos de Candida albicans |
| Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS é usado para ajustar o pH do meio RPMI (pH 7.0) |
| soro fetal bovino (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Peça de cateter intravenoso de poliuretano tripe-lúmen (2.4 mm de diâmetro, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Parte de poliuretano cortada em pedaços de 1 cm |
| Dexametasona | Fagron SAS, França | 611139 | Imunossupressor (solução estoque 10 mg/ml) |
| Ampicilina | Duchefa Biochemie, Holanda | A0104 | Profilaxia antibacteriana |
| Cetamina 1000 | Pfizer | 804 119 | Anestésico |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anestésico |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversão da anestesia |
| Gel de xilocaína (2%) - este é o Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Anestésico local para a pele |
| Pomada oftálmica de terramicina/ polimixina-b | Para prevenir o ressecamento e infecção dos olhos | ||
| Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Agente sensível à luz (deve ser mantido no escuro) | |
| Iodo isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Desinfetante para a pele | |
| 0,5% de clorexidina em álcool 70%. | Desinfetante Cedium | para a pele | |
| Equipamento | |||
| Câmara | |||
| Seringas de insulina (0,3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | Para injeção de celenterazina |
| Barbeador | Para pequenos animais | ||
| Ferramentas cirúrgicas | Tesouras, 2 pares de pinças, bisturi | ||
| Almofada de aquecimento | Leica | 14042321474 | |
| Sutura de pele | Johnson& Johnson | K890H | Fio cirúrgico, agulha |
| Sonicador de banho-maria | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Software de imagem viva | Perkin Elmer, Alameda | (versão 4.2) |
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