Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo aceito pela comunidade em formato multimídia para injeção sub-retina de um bolus de células RPE em ratos e camundongos. Essa abordagem pode ser usada para determinar potenciais de resgate, perfis de segurança e capacidades de sobrevivência de células RPE enxertadas após implantação em modelos animais de degeneração retiniana.

Resumo

A conversão de luz em impulsos eléctricos ocorre na retina exterior e é feito em grande parte por bastonetes e cones da retina e fotorreceptores células epiteliais de pigmento (RPE). RPE oferecer apoio crucial para fotorreceptores e morte ou disfunção de células RPE é característica da relacionada com a idade degeneração macular (DMRI), a principal causa de perda permanente da visão em pessoas com 55 anos ou mais velhos. Enquanto nenhuma cura para a AMD tenha sido identificado, o implante de RPE doentes saudáveis ​​em olhos pode provar ser um tratamento eficaz, e um grande número de células EPR pode ser prontamente gerado a partir de células estaminais pluripotentes. Várias questões interessantes em relação à segurança e eficácia da distribuição de célula EPR podem ainda ser examinados em modelos animais, e protocolos bem aceites utilizados para injectar RPE foram desenvolvidos. A técnica descrita aqui tem sido utilizado por vários grupos em vários estudos e envolve a criação de um primeiro furo no olho com uma agulha fina. Em seguida, uma seringa com um blunt agulha carregada com células, é inserido através do orifício e passado através do vítreo até tocar suavemente o RPE. Usando este método de injecção, o que é relativamente simples e requer um equipamento mínimo, que a integração coerente e eficiente de células derivadas de células RPE em tronco entre a EPR hospedeiro que impede quantidade significativa de degeneração de fotorreceptores em modelos animais. Embora não faça parte do protocolo real, que também descrevem a forma de determinar a extensão do trauma induzido pela injecção, e como para verificar que as células foram injectados no espaço sub-retiniano através de modalidades de imagiologia in vivo. Finalmente, a utilização deste protocolo não está limitada a células RPE; ele pode ser utilizado para injectar qualquer composto ou célula para o espaço sub-retiniano.

Introdução

A retina sensorial é organizada em camadas funcionais de neurônios, glia e células endoteliais. Os fotorreceptores na parte de trás da retina são ativados pela luz; Por meio da fototransdução, eles convertem fótons em sinais elétricos que são refinados pelos interneurônios e transmitidos ao córtex visual no cérebro. A fototransdução não pode ocorrer sem os esforços coordenados das células da glia de Mueller e do epitélio pigmentar da retina (EPR). Os EPR são organizados em uma monocamada diretamente atrás dos fotorreceptores e desempenham funções múltiplas e diversas integrantes da função e homeostase dos fotorreceptores. Na verdade, o EPR e os fotorreceptores são tão co-dependentes que são considerados uma unidade funcional. A morte ou disfunção do EPR resulta em efeitos secundários devastadores nos fotorreceptores e está associada à degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira em idosos^1,2.

Embora não tenha sido descoberta cura para a DMRI, vários estudos clínicos mostraram que a substituição de células RPE pode ser uma opção terapêutica promissora^3-13. Com o advento da tecnologia de células-tronco, agora é possível gerar um grande número de células RPE in vitro a partir de células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas (hES e hiPS) que se assemelham fortemente às suas contrapartes somáticas funcional e anatomicamente^14-26. O RPE derivado de células-tronco também demonstrou funcionar in vivo por vários grupos independentes, incluindo o nosso, para retardar significativamente a degeneração da retina em linhagens de ratos e camundongos com degeneração espontânea^{da retina 16,18,21,22,25,28,29}. Essa combinação de evidências de suporte clínico e pré-clínico é tão convincente que vários ensaios clínicos para prevenir a degeneração da retina usando células-tronco derivadas de células RPE estão em andamento^30,31.

RPE pode ser facilmente derivado de hES e/ou hiPS e implantado no espaço sub-retiniano de roedores usando várias técnicas de derivação e injeção^32,33. (Veja Westenskow et al. para um artigo de métodos em formato multimídia demonstrando o protocolo de diferenciação direcionada que empregamos)³⁴. Existem questões críticas remanescentes sobre a segurança, sobrevivência e capacidade funcional de células RPE entregues exogenamente após a implantação, portanto, a capacidade de realizar injeções sub-retinianas em roedores é uma habilidade crítica^{16,18,21,29,36,37}. A entrega de EPR não é trivial e o campo é dividido quanto à técnica de injeção mais eficaz. O protocolo que descrevemos aqui é uma maneira simples e eficaz de fornecer bolus de células RPE por via sub-retinal e foi usado no primeiro ensaio clínico para transplante de RPE derivado de células-tronco³¹. (O leitor também pode consultar outro artigo do JoVE de Eberle et al. para uma representação alternativa de injeções sub-retinianas em roedores. ³⁸)

A técnica descrita neste manuscrito não pode ser visualizada e o trauma é inevitável (como acontece com qualquer técnica de injeção sub-retiniana). É realizado fazendo um orifício logo abaixo dos vasos do limbo e inserindo uma agulha romba ao longo de uma rota transescleral para injetar um bolo de células sob a retina diametralmente oposta. A pessoa que faz a injeção sentirá resistência quando a agulha romba tocar a retina. As células podem ser visualizadas diretamente após a injeção, no entanto, e o grau do descolamento de retina induzido pode ser determinado marcando as células RPE com um marcador fluorescente transitório e detectando-as com um oftalmoscópio de varredura confocal (cSLO). Um sistema de tomografia de coerência óptica (OCT) também pode ser usado para monitorar o trauma e identificar facilmente o local da injeção.

Protocolo

NOTA: Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps.

1. Elaboração de Materiais para Injecção (~ 20 min)

1. Solução de dissociação de células pré-aquecida (de preferência um que é inactivado através da diluição, não com soro), PBS estéril e meio de cultura (Tabela 1).
2. Esteriliza-se a seringa com uma agulha romba de desmontá-lo e ferver as peças em água durante 15 min.

2. Preparação das células de RPE para Injecção (~ 30 min a 1 h)

1. Separar as células RPE usando solução de dissociação de células pré-aquecido para 5-8 min a 37 ° C.
2. Raspe as células suavemente para liberar qualquer que ainda estão presos.
3. Dilui-se as células com um grande volume de meios de cultura (encher um tubo de 15 ml) para inactivar a solução de dissociação e contá-las.
4. Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar as células.
5. Ressuspender as células em 200.000 células / ul (para entregar 100.000 células num volume de 0,5 ul) em PBS estéril pré-aquecida e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Opcionalmente, adicionar um marcador fluorescente transiente de células vivas e incubar a 37 ° C durante 30-45 min.
7. Carregar a seringa com uma agulha romba com 0,5 ul de células. Injectar as células mais rapidamente possível.

3. Sub-retinal Injection (~ 5 min por Injection)

NOTA: Se possível, aprender a técnica com ratos albinos adultos vez que os navios límbicas são muito mais fáceis de visualizar. Injetar solução Verde Rápido quando aprender (antes de tentar injetar células) para facilitar mais facilmente a visualização do local da injeção.

1. Anestesiar o roedor. Use injecções intraperitoneais de 100 mg / ml de cetamina e 10 mg / ml de xilazina (20 mL / 10 g de corpo woito) ao longo de inalação de isofluorano, uma vez que é difícil de manobrar o roedor e injectar no olho com o focinho no inalador.
   1. Certifique-se de que o animal é anestesiado profundamente por beliscar uma das suas patas. Se ele se encolhe, esperar mais alguns minutos e tente novamente antes de iniciar a injeção sub-retiniana.
2. Posicionar o roedor para o lado, de modo que o olho que vai ser injectado é virado para o tecto.
3. Sob um microscópio de dissecação esticar suavemente a pele de modo que o olho aparece ligeiramente para fora do socket (proptose temporária) e torna-se mais acessível, segurando sua cabeça com apenas dois dedos acima da orelha e por sua mandíbula e se estendem suavemente a pele paralelo às pálpebras de modo que o olho aparece ligeiramente para cima para fora do soquete (Figura 1C). Não segure o roedor muito perto da garganta.
4. Com uma agulha afiada pré-esterilizadas descartáveis ​​30 G, faça um buraco logo abaixo do limbo (se os vasos são atingidos, o sangramento vai bum e significativa e que seja difícil encontrar o buraco mais tarde) e a um ângulo para evitar tocar na lente com a agulha (Figura 1D). Evite tocar na lente com a agulha fina (ou cega) ou formação de catarata imediato ocorrerá.
   NOTA: Injeções trabalhar melhor com duas pessoas. Desta forma, uma pessoa pode passar a seringa com a agulha romba para a pessoa que executa a injeção depois de terem criado o primeiro buraco com a agulha descartável afiada para manter o foco no que o buraco é.
5. Retirar a agulha afiada descartável do olho, mantendo o controle sobre a cabeça. Lembre-se exatamente onde o buraco é.
6. Depois de tanto montagem da seringa pré-carregada com uma agulha cega em um micromanipulator ou segurando-o pela mão, insira a ponta da seringa com a agulha romba através do buraco, tendo o cuidado de novo para não tocar na lente, e empurre suavemente através do olho muito delicadamente até sentir resistência (Figura 1D).
7. Keeping todos os movimentos a um mínimo, cuidadosamente injectar as células RPE lentamente no espaço sub-retiniano.
   NOTA: RPE / retina desapego será induzida; isso é inevitável. No entanto, uma injeção de mais limpo minimiza o desprendimento e melhora consideravelmente as chances de reinserção (Figura 1E). Quaisquer movimentos exagerados podem mover a agulha de volta para a retina, e movimentos laterais pode danificar a retina. A utilização de uma bomba de injecção é opcional, mas permite uma entrega muito preciso.
8. Retirar a seringa lentamente. Aplicar hidratante colírio para manter o olho hidratado.
9. Continue a acompanhar o animal até que ele recupere decúbito esternal. Não deixe animais autônoma ou voltar para uma gaiola com outros animais de alerta até que ele recupere a decúbito esternal.

Resultados

Podemos fornecer uma suspensão de células de RPE para o espaço sub-retiniano de roedores rapidamente e de forma consistente utilizando a técnica descrita neste manuscrito. Embora não seja obrigatório, traumas pode ser bastante minimizado utilizando a configuração mostrada com uma micromanipulator na Figura 1A & B. Segurar o roedor tal como mostrado na Figura 1C para a proptose temporária. Os passos são os mesmos se realizado com a micromanipulator ou à mão; estes estão representados...

Discussão

Neste artigo vamos descrever um método relativamente simples para a realização de injecções subretinal de células EPR em suspensão em ratos e camundongos. O protocolo é fácil de aprender e mais experiências com a técnica irá traduzir em menos trauma (Figura 3, o que representa um dos melhores injecções), especialmente se for usado um micromanipulador (Figura 1A). Qualquer trauma pode ser monitorizada in vivo com um sistema cSLO e outubro (Figura 2) se disponíve...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µ g x 20
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Colírio Lubrificante Moderado a Grave	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringa x 1
Agulha Hamilton 33 G, 0.5", ponto 3 (aço inoxidável 304)	Agulhas Hamilton	7803-05	x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
Substituição de Soro KnockOut	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Suporte Magnético	Leica Biosystems	39430216	Suporte x 1
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulador	Leica Biosystems	3943001	Manipulador x 1
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	Ponta Deslizante 100 ml x 1
sem Agulhas BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Agulhas de Uso Especial BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Caixa x 1
enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol	Gibco	12604013	100 ml x 1

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