Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo aceito pela comunidade em formato multimídia para injeção sub-retina de um bolus de células RPE em ratos e camundongos. Essa abordagem pode ser usada para determinar potenciais de resgate, perfis de segurança e capacidades de sobrevivência de células RPE enxertadas após implantação em modelos animais de degeneração retiniana.

Resumo

A conversão de luz em impulsos eléctricos ocorre na retina exterior e é feito em grande parte por bastonetes e cones da retina e fotorreceptores células epiteliais de pigmento (RPE). RPE oferecer apoio crucial para fotorreceptores e morte ou disfunção de células RPE é característica da relacionada com a idade degeneração macular (DMRI), a principal causa de perda permanente da visão em pessoas com 55 anos ou mais velhos. Enquanto nenhuma cura para a AMD tenha sido identificado, o implante de RPE doentes saudáveis ​​em olhos pode provar ser um tratamento eficaz, e um grande número de células EPR pode ser prontamente gerado a partir de células estaminais pluripotentes. Várias questões interessantes em relação à segurança e eficácia da distribuição de célula EPR podem ainda ser examinados em modelos animais, e protocolos bem aceites utilizados para injectar RPE foram desenvolvidos. A técnica descrita aqui tem sido utilizado por vários grupos em vários estudos e envolve a criação de um primeiro furo no olho com uma agulha fina. Em seguida, uma seringa com um blunt agulha carregada com células, é inserido através do orifício e passado através do vítreo até tocar suavemente o RPE. Usando este método de injecção, o que é relativamente simples e requer um equipamento mínimo, que a integração coerente e eficiente de células derivadas de células RPE em tronco entre a EPR hospedeiro que impede quantidade significativa de degeneração de fotorreceptores em modelos animais. Embora não faça parte do protocolo real, que também descrevem a forma de determinar a extensão do trauma induzido pela injecção, e como para verificar que as células foram injectados no espaço sub-retiniano através de modalidades de imagiologia in vivo. Finalmente, a utilização deste protocolo não está limitada a células RPE; ele pode ser utilizado para injectar qualquer composto ou célula para o espaço sub-retiniano.

Introdução

A retina sensorial é organizada em camadas funcionais de neurônios, glia e células endoteliais. Os fotorreceptores na parte de trás da retina são ativados pela luz; Por meio da fototransdução, eles convertem fótons em sinais elétricos que são refinados pelos interneurônios e transmitidos ao córtex visual no cérebro. A fototransdução não pode ocorrer sem os esforços coordenados das células da glia de Mueller e do epitélio pigmentar da retina (EPR). Os EPR são organizados em uma monocamada diretamente atrás dos fotorreceptores e desempenham funções múltiplas e diversas integrantes da função e homeostase dos fotorreceptores. Na verdade, o EPR e os fotorreceptores são tão....

Protocolo

NOTA: Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps.

1. Elaboração de Materiais para Injecção (~ 20 min)

1. Solução de dissociação de células pré-aquecida (de preferência um que é inactivado através da diluição, não com soro), PBS estéril e meio de cultura (Tabela 1).
2. Esteriliza-se a seringa com uma agulha romba de desmontá-lo e ferver as peças em água durante 15 min.

2. Preparação das células de RPE para Injecção (~ 30 min a 1 h)

1. Separa....

Resultados

Podemos fornecer uma suspensão de células de RPE para o espaço sub-retiniano de roedores rapidamente e de forma consistente utilizando a técnica descrita neste manuscrito. Embora não seja obrigatório, traumas pode ser bastante minimizado utilizando a configuração mostrada com uma micromanipulator na Figura 1A & B. Segurar o roedor tal como mostrado na Figura 1C para a proptose temporária. Os passos são os mesmos se realizado com a micromanipulator ou à mão; estes estão representados.......

Discussão

Neste artigo vamos descrever um método relativamente simples para a realização de injecções subretinal de células EPR em suspensão em ratos e camundongos. O protocolo é fácil de aprender e mais experiências com a técnica irá traduzir em menos trauma (Figura 3, o que representa um dos melhores injecções), especialmente se for usado um micromanipulador (Figura 1A). Qualquer trauma pode ser monitorizada in vivo com um sistema cSLO e outubro (Figura 2) se disponíve.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µ g x 20
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Colírio Lubrificante Moderado a Grave	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringa x 1
Agulha Hamilton 33 G, 0.5", ponto 3 (aço inoxidável 304)	Agulhas Hamilton	7803-05	x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
Substituição de Soro KnockOut	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Suporte Magnético	Leica Biosystems	39430216	Suporte x 1
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulador	Leica Biosystems	3943001	Manipulador x 1
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	Ponta Deslizante 100 ml x 1
sem Agulhas BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Agulhas de Uso Especial BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Caixa x 1
enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol	Gibco	12604013	100 ml x 1

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