Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

Resumo

A injeção direta no nervo óptico do rato é útil para a pesquisa regenerativa. Demonstramos uma técnica minimamente invasiva para injeção direta em um nervo óptico de rato que não envolve a abertura do crânio. Usando este método, as complicações cirúrgicas são minimizadas e a recuperação é mais rápida.

Resumo

O nervo óptico do rato é um modelo útil para a pesquisa de regeneração de células-tronco. A injeção direta no nervo óptico do rato permite a entrega ao sistema nervoso central em uma cirurgia minimamente invasiva sem remoção óssea. Esta técnica descreve uma abordagem para visualização e injeção direta do nervo óptico após uma pequena dissecção fascial da crista orbital, usando uma sutura de tração conjuntival para puxar suavemente o olho para baixo e para fora. Exemplos representativos de um nervo óptico injetado mostram injeção bem-sucedida de contas tingidas.

Introdução

O nervo óptico oferece uma localização ideal para o sistema nervoso central (SNC) de pesquisa regenerativa incluindo condições oftalmológicas como a neurite óptica, glaucoma e trauma. As injecções de uma variedade de células estaminais quer demonstraram eficácia ou mostraram-se promissores na substituição de mielina perdido, aumentando a contagem axonal e / ou prevenção de doenças degenerativas. ^1,2

O nervo óptico humano contém aproximadamente 1,2 milhões de axónios que viajam paralelas da retina para o quiasma com um diâmetro de cerca de 3,0-3,5 mm. ³ Para modelar doenças humanas em laboratório, o rato tem sido utilizado frequentemente. O nervo óptico de rato adulto contém cerca de 100.000 axónios dentro de um diâmetro de aproximadamente 0,5 mm. ⁴ Uma das principais limitações na pesquisa no SNC regenerativo é desossada acesso directo. As complicações e riscos cirúrgicos para o animal são maiores quando o crânio ou vértebras são removidos. Similar aos benefícios deabordagens minimamente invasivas da coluna vertebral, ⁵ injeções diretas do nervo óptico sem abrir o crânio de oferta reduzida complicações e uma recuperação mais rápida.

Esta técnica tem sido utilizada em estudos anteriores. ⁶ Neste manuscrito e vídeo acompanhante, que demonstram um procedimento minimamente invasivo para injectar células estaminais no nervo óptico de rato.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Johns Hopkins. Aparelhos de anestesia exigir uma inspecção anual e calibração, se necessário.

1. Anestesia e Posicionamento

1. Anestesia.
   1. Execute todos os procedimentos cirúrgicos sob anestesia com isofluorano 2-3%. Confirme nível adequado de anestesia por pitada dedo do pé e taxa de respiração. Verifique se o rato não se mexe em resposta a uma pitada dedo do pé.
      NOTA: Um vacilo indica anestesia que é tarde demais e pode exigir anestesia mais longos antes de iniciar ou uma concentração de isofluorano superior. A taxa de respiração inferior a 1 respiração cada 2 s é muito lento o que indica anestesia é demasiado elevada e pode exigir um aligeiramento da concentração de isofluorano.
   2. Prenda o animal como necessário para evitar o movimento da cabeça durante o procedimento. Coloque uma gota de lidocaína no olho cirúrgico. Use lágrimas artificiais a cada 10 minutos para evitar a secura sob anestesia. Daruma injecção de buprenorfina a 0,01 mg / kg SC pré-operatório e em seguida cada 6-8 horas, conforme necessário.
2. Posicionamento.
   1. Coloque ratos em um quadro estereotáxico e manter aquecido com uma almofada de aquecimento. Molhar a pele do couro cabeludo com álcool tendo o cuidado de evitar a exposição sobre os olhos. Use ferramentas estéreis e técnica estéril para minimizar o risco de infecções pós-operatórias.

2. Controle dos olhos

1. Coloque um fio de sutura 4-0 na conjuntiva lateral e amarrá-lo com sutura suficiente para permitir tração suave.

3. Dissecção

1. Dissecção inicial.
   1. Adicione uma incisão ~ 1 polegada na pele que recobre o cume orbital usando um bisturi tamanho 10, como mostrado na Figura 1. Retirar a pele e fáscia subjacente e cuidadosamente dissecar longe do painel frontal. Para evitar sangramento excessivo no cirúrgico, evitar o corte vasos sanguíneos enquanto dissecando a fáscia. Use estrategicamente placed pontas de algodão para proporcionar hemostase.
2. Dissecção mais profundo.
   NOTA: Com tração suave na conjuntiva puxando o olho para baixo e para fora do soquete, o músculo orbital superior entrará em vista. A fim de expor o nervo óptico, este deve ser cortado do músculo e gordura retro-orbital removido. A gordura pode ser descartado e não deve ser substituído após a injecção. A partir deste ponto, a fáscia nervo óptico deve ser visível como um feixe do nervo óptico em si, juntamente com os vasos sanguíneos envolvidos na dura-máter (Figura 1).
   1. Fazer uma pequena incisão na dura usando o bisturi ou com uma agulha de calibre 31 chanfrada para fazer a perfuração menos traumática.

4. Pipeta Injector

1. Retire uma micropipeta de vidro para um diâmetro de 50-100 um. Para garantir a estabilidade da montagem, a micropipeta em um micromanipulador e se ligar a uma seringa de Hamilton ligada a uma bomba de infusão.
2. Puxe as contas (ou células-tronco)reconstituída num volume de 0,5-1,0 mL na micropipeta retrógrada juntamente com o volume de 0,5 ul de uma solução de metil azul antes e depois.
   Observação: Uma taxa de infusão definida para 0,5-2 mL por min impede trauma para o nervo óptico.

5. Injeção

1. Diminuir a ponta da micropipeta para o nervo óptico logo acima da dura-máter entalhado.
   NOTA: Uma pequena, mas rápido movimento da ponta de vidro nos resultados do nervo óptico em menos danos. À medida que a bomba de infusão inicia, o corante azul de metilo deve destacar a área do nervo óptico injectado. O corante deve permanecer localizada dentro do nervo óptico sem vazando no espaço subaracnóide.
2. Seguir a segunda banda de azul de metileno para determinar quando a injecção de células estaminais é completa e ligar a bomba de infusão fora como a segunda dose de azul de metileno é injectado. Manter a micropipeta ainda dentro do nervo óptico durante 2 min para cada volume de 1 mL injectada no para prevenir altaejeção de pressão após a retirada da micropipeta.
   NOTA: Uma abordagem alternativa é conectar a ponta da pipeta a uma seringa cheia de ar que pode ser manipulado manualmente. De qualquer maneira, evitar força excessiva para minimizar o dano para os nervos ópticos. Recomendamos injetando não mais de 2 l de volume, em cada nervo óptico.

6. Acompanhamento

1. Immediate.
   1. Quando a injecção estiver concluída, remova a micropipeta, juntamente com todas as pontas de algodão usados ​​para fornecer hemostasia. Suturar a pele com seda 3-0 e remova o fio de sutura conjuntival.
   2. Mantenha ratos quente sobre uma almofada de aquecimento até que eles emergem da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
   3. Se o animal está exibindo sinais de dor excessiva, incluindo letargia, ataxia, ou trabalharam breathing, administrar analgesia adequada com buprenorfina intramuscular (0,05 mg / kg) até três vezes ao dia.
2. Longo prazo.
   1. Para a próxima 24-48 h, observe o rato por complicações da cirurgia, incluindo inchaço ou secreção da ferida ou outros sinais de dor, como vocalização, aparência curvada, não-aliciamento, ou não comer. Considere consulta com um veterinário ou a eutanásia ético, conforme necessário.

Resultados

Na conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados e perfundidos com paraformaldeído a 4%. Os nervos ópticos foram cuidadosamente dissecados e montados para seccionamento criostático. A Figura 2 mostra um exemplo de um nervo óptico de rato inteiro com baixa potência, em que o corante azul de Evans foi injectada a fim de visualizar o local. A seta identifica a localização precisa da injecção. Esta dissecção foi realizada dentro de alguns minutos da injecção, tal como indicado pela difusão restrita ...

Discussão

A injeção direta no nervo óptico de células-tronco ou outros produtos destinados a facilitar a regeneração fornece um modelo conveniente em comparação com outros meios de injeções no SNC. Essa técnica leva menos tempo, requer menos anestesia total, evita perfurar ou remover tecido craniano ou ósseo, reduz as taxas de complicações e permite uma recuperação mais rápida após a cirurgia.

As etapas mais críticas neste protocolo incluem: 1. Hemostasia adequada no campo cirúrgico para permitir uma v...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato Lewis	Charles River	4	Qualquer cepa de rato funcionará.
Máquina de anestesia	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 Máquina de anestesia para pequenos animais - Bomba de infusão de montagem em poste
	Stoelting	53129
Microscópio de dissecção	National Optical	409-411-1105
Fonte de luz de fibra óptica	Fisher Scientific	12-562-21
Dissecção e Armazenamento de Instrumentos Estereotáxicos		51400
Extrator de pipetas	Kopf	750
Pipetas	World Precision Instruments	18150-6
Lâminas de bisturi descartáveis	Harvard Apparatus	810-15-021
Tesoura de iridectomia	Ciências de Microscopia Eletrônica	Uniband LA-4XF