Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.
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Artigo de método
Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo da biologia dos linfócitos T humanos geralmente envolve o exame das respostas aos ligantes ativadores. As células T reconhecem e respondem aos antígenos peptídicos processados apresentados pelas moléculas de MHC (ortólogo HLA humano) através do receptor de células T (TCR) de maneira altamente sensível e específica. Enquanto a função primária das células T é mediar respostas imunes protetoras a antígenos estranhos apresentados pelo auto-MHC, as células T respondem de forma robusta a diferenças antigênicas em tecidos alogênicos. As respostas das células T aos aloantígenos podem ser descritas como aloreatividade direta ou indireta. Na aloreatividade, a célula T responde por meio do reconhecimento altamente específico do peptídeo apresentado e da molécula de MHC. A resposta oligoclonal robusta das células T à estimulação alogênica reflete o grande número de aloantígenos potencialmente estimulatórios presentes nos tecidos alogênicos. Embora a amplitude das respostas aloreativas das células T seja um fator importante no início e mediação da patologia associada a respostas alorreativas biologicamente relevantes, como doença do enxerto contra o hospedeiro e rejeição do aloenxerto, ela pode impedir a análise das respostas das células T aos ligantes alogênicos. Para este fim, este protocolo descreve um método para gerar células T aloreativas a partir de leucócitos do sangue periférico humano (PBL) virgens que respondem a aloantígenos peptídicos-MHC (pMHC) conhecidos. O protocolo aplica marcação de multímero pMHC, enriquecimento de esferas magnéticas e citometria de fluxo a métodos de cultura in vitro de célula única para a geração de clones de células T específicos para aloantígenos. Isso permite estudos da bioquímica e função das células T que respondem à estimulação alogênica.
Introdução
Os linfócitos T são componentes críticos do sistema imunitário adaptativo. As células T são responsáveis não só para mediar directamente respostas imunitárias protectoras para agentes patogénicos através de uma variedade de mecanismos efectores, mas também manter activamente auto-tolerância imunológica e dirigir as respostas de outras células do sistema imunológico. Estas funções são dirigidos através de um número de sinais integrados, incluindo o receptor de células T (TCR) de ligação, citocinas e quimiocinas, e metabolitos 1. Destes sinais, o TCR é de particular importância, uma vez que proporciona a especificidade característica que define o papel de ....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo requer a utilização de amostras de sangue periférico de voluntários humanos. Todas as pesquisas com seres humanos deve ser revisado e aprovado por um Estudos Humanos Institutional Review Board para assegurar a conformidade com a Declaração de Helsinque (2013) e do Seguro de Saúde Portabilidade e Responsabilidade Act de 1996.
1. Isolamento das células T a partir de Sangue Total
- Antes da partida, aquecer o meio de gradiente de densidade até à temperatura ambiente. Aliquota de 4 ml de meio de gradiente de densidade de 2-4 em tubos estéreis de 15 ml de centrífuga cónicos (1 tubo serão utilizados para cada 10 ml....
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Resultados
Este protocolo descreve a geração de culturas de células T humanas clonal com aloantigénio especificidade definida por meio de um cordão de enriquecimento magnética e fluxo de uma única célula citometria de triagem estratégia. A Figura 1 apresenta um esboço do processo.
Figura 1: Vista geral Protocolo O protocolo aqui descrito proporciona um.......
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Discussão
A aloreatividade das células T é um fenômeno há muito estudado e clinicamente relevante. As respostas proliferativas e efetoras robustas das células T à estimulação alogênica permitiram análises extensivas das respostas das células T humanas in vitro por meio de reações linfocitárias mistas relativamente diretas de células T do sangue periférico contra células alogênicas inativadas. No entanto, essas respostas primárias de células T alorreativas são oligoclonais, compostas por um grande número de células T indiv.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O autor gostaria de agradecer ao NIH Tetramer Core Facility pela produção de tetrâmeros. O autor também gostaria de agradecer a E.D. O'Connor e K.E. Marquez do laboratório de citometria de fluxo da UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility pela assistência na classificação de células. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health grant K08AI085039 (GPM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de coleta de sangue venoso de heparina sódica 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Kit de Enriquecimento de Células T Humanas | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x sem Ca ou Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Albumina | de soro bovinoSigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Tetrâmero pMHC marcado com fluoróforo | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Kit de Seleção de Biotina | Stemcell Technologies | 18553 | |
| Ímã de seleção | EasySep Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Solução de bloqueio de Fc humano | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, sem b-ME ou L-glutamina | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Sulfato de gentamicina (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Soro AB humano, doador masculino | Omega Scientific | HS-30 | |
| IL-2 humano recombinante | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Tecnologias | 11131D | |
| Mídia | |||
| Tampão | |||
| PBS, pH 7,4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0,5 M) | 2 ml | ||
| cultura de células T humanas | |||
| DMEM | 351,6 ml | da Iscove | |
| Soro AB humano inativado pelo calor | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicina (50 mg/ml) | 0,4 ml | ||
| b-mercaptoetanol (14,3 M) | 1,4 ml | ||
| IL-2 humana recombinante (1 mg/ml) | 1 ml |
Referências
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
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Reimpressões e permissões
