Artigo de método

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

DOI:

10.3791/52259

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3 de janeiro de 2015

 ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

Neste artigo

Resumo

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Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.

Resumo

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Anos de pesquisa indicam que os cânceres de ovário abrigam uma mistura heterogênea de células, incluindo uma subpopulação das chamadas "células-tronco cancerígenas" (CSCs) responsáveis pela iniciação, manutenção e recidiva do tumor após quimioterapias convencionais. A identificação de CSCs ovarianos é, portanto, um objetivo importante. Um método comumente usado para avaliar o potencial de CSC in vitro é o ensaio de esferas no qual as células são plaqueadas em condições de cultura não aderentes em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento e a formação de esferas é pontuada após alguns dias. Aqui, revisamos os protocolos atualmente disponíveis para ensaios de esferas de câncer de ovário humano e realizamos uma análise lado a lado entre os ensaios baseados em várias células comumente usados e um sistema mais preciso baseado em placas de células únicas. Nossos resultados indicam que tanto os ensaios baseados em células múltiplas quanto os de esferas baseadas em células únicas podem ser usados para investigar a formação de esferas in vitro. Os ensaios baseados em células únicas, mais trabalhosos e caros, são mais adequados para a avaliação funcional de células individuais e levam a resultados gerais mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células podem ser fortemente influenciados pela densidade das células plaqueadas e requerem experimentos de titulação antecipadamente. A suplementação de metilcelulose para ensaios baseados em múltiplas células pode ser efetivamente usada para reduzir artefatos mecânicos.

Introdução

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Há evidências crescentes de que os carcinomas de ovário são compostos por misturas heterogêneas de células e abrigam as chamadas "células-tronco cancerígenas" (CSCs) responsáveis pelo início, manutenção e recidiva da doença após terapias citotóxicas convencionais1-3. Portanto, o desenvolvimento de estratégias moleculares direcionadas às CSCs de ovário é um objetivo importante e promete melhorar a terapia de pacientes com câncer de ovário.

Um pré-requisito para a compreensão das características moleculares das CSCs é seu isolamento confiável das não-CSCs. No entanto, a identificação de CSCs ovarianos parece desafiadora. Embora a expressão de CD133 e a atividade da aldeído desidrogenase (ALDH)4,5 tenham sido relatadas para marcar CSCs ovarianas, alguns dados indicam que esses marcadores são instáveis6. Consistentemente, no câncer de ovário, exceto, por exemplo, no carcinoma de mama7, a expressão de ALDH1 se associa a um resultado favorável8 e a expressão da variante CD44 do marcador de células-tronco proposto não tem valor prognóstico9. Mais recentemente, mostramos que a expressão da proteína de células-tronco embrionárias SOX2 confere estaminalidade às células de carcinoma de ovário10 e a alta expressão de SOX2 se associa a carcinomas de ovário e mama clinicamente agressivos11,12. Portanto, neste relatório, usamos uma construção repórter lentiviral contendo uma proteína de fluorescência vermelha (RFP) cuja expressão é controlada por uma região regulatória SOX2, como um método para isolar CSCs ovarianos putativos.

Por definição, as CSCs podem se auto-renovar e se diferenciar, dando origem a todos os tipos de células tumorais. As populações putativas de CSC precisam ser analisadas em ensaios funcionais realizados in vivo. Por razões óbvias, em células humanas, esses testes funcionais são confinados a ensaios de xenoenxerto, compreendendo principalmente o transplante de células tumorais humanas em camundongos imunocomprometidos10,13.

Um método alternativo in vitro foi oferecido por Brent Reynolds e Sam Weiss, que primeiro relataram o chamado ensaio da neuroesfera como um ensaio substituto avaliando o potencial da haste em células neurais14. Dontu e colegas confirmaram mais tarde o uso deste ensaio para avaliação do potencial de células-tronco em células mamárias15,16. Aqui, as células mamárias humanas foram plaqueadas em diferentes números em meio livre de soro suplementadas com fator de crescimento epidérmico (EGF), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), B-27 e heparina e cultivadas em condições não aderentes por sete a dez dias antes da formação da esfera ser pontuada por microscopia. Seguindo este protocolo com alguns ajustes no número de células, meio de crescimento e suplementos, vários grupos exploraram in vitro o potencial de células-tronco de vários tipos de câncer, como tumores de mama17, cérebro18, pâncreas19 e cólon20. No carcinoma de ovário, relatamos recentemente a viabilidade do ensaio em esferas e comparamos seus resultados com os coletados em modelos de xenoenxerto murino in vivo 10. Descobrimos que a superexpressão da proteína de células-tronco SOX2 aumentou tanto a formação de esferas in vitro quanto a tumorigenicidade in vivo de células de carcinoma de ovário humano10. No entanto, a frequência de células iniciadoras de esferas foi maior do que a frequência de células iniciadoras de tumor medidas in vivo10, sugerindo que o ensaio de esfera pode levar a resultados falso-positivos devido a razões técnicas ou, alternativamente, o ensaio in vivo pode ser ineficiente e resultar em resultados falso-negativos.

Neste relatório, analisamos ensaios de esferas ovarianas baseadas em múltiplas células com mais detalhes, revisamos os diferentes protocolos disponíveis na literatura e os comparamos com um único ensaio baseado em células. Mostramos que o ensaio baseado em células únicas fornece resultados mais precisos e reprodutíveis do que os ensaios baseados em várias células, que podem ser altamente influenciados pela densidade das células plaqueadas, a menos que a metilcelulose seja adicionada às culturas para imobilizar as células. No entanto, também em ensaios baseados em células únicas, o potencial de iniciação de esferas in vitro é observado com frequência mais alta do que o potencial de iniciação de tumor in vivo.

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Protocolo

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1. Geração de células humanas de carcinoma de ovário OVCAR-3 estavelmente transduzidas com Lentiviruses Contendo o Reporter Construct SOX2 Região Regulatory

  1. Gerar partículas lentivirais por transfecção da linha celular 293T HEK-embalagem com uma construção repórter reconhecer uma região reguladora SOX2 como descrito 10,21.
    NOTA: O repórter construir contém ainda um domínio desestabilização do System Shield ProteoTuner à frente da proteína tdTomato fluorescência. Shield1 se liga ao domínio desestabilização impedindo assim o proteassoma para degradar a proteína de fluorescência 22.
  2. Transduzir células OVCAR-3 com partículas lentivirais durante um período de tempo de 24 horas. Em seguida, remover o sobrenadante viral e lavar as células com solução salina de fosfato tamponada (PBS) e cultivadas em meio completo (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina).
  3. 48 horas depois, 10 ug / ml puromicina foram adicionados às culturas e mantidas durante 5 dias para permitir a selecção de células transduzidas adequadamente.

2. Preparação de células de classificação e Galvanização

  1. Adicionar Shield1 a 1: 1000 de diluição 24 h antes da separação de células. Use estavelmente transduzidas OVCAR-3 em células sem tratamento Shield1 como controlos negativos (Figura 1). Aspirar meios de balão, lavar as células com PBS 1x e trypsinize células com 0,05% Tripsina-EDTA durante 3 min.
  2. Pare tripsina utilizando meio completo (ver acima), contar o número de células, as células de centrifugação a 300 xg à temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 5 min.
  3. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células cuidadosamente em 0,5-1 ml de PBS estéril.
  4. Use 40 um filtro cap filtro de células para obter a suspensão de uma única célula.
  5. Ajustar a contagem de células a 5 milhões de células por ml.
  6. Prepare baixa fixação placas ultra-96 poços com 100 ul esferas médio (MEGM suplementado com fatores de crescimento, citocinas e suplementos,B-27, heparina-sódio; ou DMEM / F12 suplementado com factores de crescimento, citocinas e suplementos, B-27, heparina-sódio, com ou sem adição de 1% de metilcelulose, ver também a Tabela 1). Opcionalmente adicionar antibióticos para o meio a uma concentração de 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina para minimizar o risco de possível contaminação.
  7. Ordenar as células em RFP- preparadas placas de 96 poços a partir de cima e RFP +, uma célula por cavidade (ensaio de esferas único baseado em células), e 100 células por poço (de ensaio de multi esferas baseados em células), respectivamente. Execute classificador de células tipo em comercialmente disponível (ver Materiais) usando o modo de única célula, Sort setup: 100 μ bocal, pressão do invólucro 20 psi, e rendimento de máscara 0, pureza máscara de 32, a máscara de fase 16.
  8. Avaliar a eficiência do plaqueamento por microscopicamente conseguir poços contendo células (para o ensaio de base celular único) e por contagem do número de células em poços individuais (para o ensaio baseado em células múltiplas; Figura 2 ).
  9. Incubar as células em condições normais médias em esferas (para a composição ver passo 2.6) a 37 ° C e 5% de CO 2. Suplemento de bFGF por dia (20 ng / ml) e EGF (20 ng / ml).
  10. Após uma semana, contar o número de esferas de tumor emergente usando um microscópio padrão com 4X ou ampliação de 10X e um microscópio de fluorescência para detectar o sinal de fluorescência a partir do sistema repórter integrada. Contagem de esferas com um diâmetro superior a 100 um, como esferas "grandes" e as esferas com um diâmetro de 50 - 100 mm como "pequenos" esferas (Figura 3). Tenha certeza de que você contar esferas reais e não celular clusters.
    NOTA: Em ensaios baseados em células individuais formação esfera é mais fácil para marcar microscopicamente após 10 (contra 7) dias de cultura.
  11. Calcular a proporção de células formadoras de esfera em RFP + e células, respectivamente RFP- em ensaios baseados em células individuais (uma placa de 96 poços para cada experiência individual) ou de multi-célula baesferas ensaios sed (um bem para cada experimento indivíduo), como apresentado por Shaw et al. 16
    NOTA: Proporção de células formando esfera (%) = (número de esferas) / (número de células semeadas) x 100

3. Passaging Serial de Esferas

  1. Colocar o conteúdo de cada cavidade dentro de um tubo estéril adequado e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Para baseados em células múltiplas esferas ensaios, reúna as esferas de um bem. Lava-se a bem 3 - 5 vezes com PBS e centrifugação mais 2 min. Para individuais baseados em células esferas ensaios, coletar esferas individuais. Devido ao baixo número de células, utilizar tubos de 1,5 ml para centrifugação e lavagem passos.
  2. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de 0,05% de tripsina-EDTA.
  3. A fim de conseguir a separação celular óptimo, incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 5 min num agitador suave. Otimizar tripsiniza�o tempo para a sua linha de células de menor taxa de morte celular: se nenhuma grandeesferas é triturado visível delicadamente com uma pipeta de ponta de 100 mL. No caso de grandes esferas ainda estão presentes, incube com tripsina outro 3 min e, em seguida, avançar para a etapa de trituração. No caso de um único ensaios baseados em células para se certificar de optimizar o tempo de rendimento óptimo das células de células vivas durante o passo de tripsinização.
  4. Para inactivar a tripsina, adicionar 500 ul meio completo e centrifugação a 300 xg durante 10 min, no caso de ensaios de células individuais, centrifugar durante mais 2 min.
  5. Remover sobrenadante e ressuspender as células em meio de esferas cuidadosamente.
  6. Usar um filtro de 40 um filtro de células de tampão para se obter uma suspensão de célula única.
  7. No caso de se utilizar células RFP- em ensaios bassed de células multi-RFP + e, avaliar a percentagem de células fluorescentes em cada poço após ressuspensão através de análise de citometria de fluxo.
  8. Para os ensaios de replating série de células individuais, sementes de 1 célula por cavidade em um novo ultra-baixo fixação placa de 96 poços preparados tal como acima descrito. A partir de uma esfera individual, semear aproximadamente 20 poços individuais. Para os ensaios de esferas replating primários múltiplos baseados em células, as células de semente obtido a partir de um poço de esferas primárias para uma nova placa de 96 poços e contar o número de células no dia seguinte por microscopia.
  9. Avaliar a percentagem de células formadoras de esfera em esferas secundárias ensaios usando a fórmula descrita no passo 2.11.

Análise 4. Resultado

  1. Analisar os resultados de experimentos realizados em triplicatas independentes e usar o teste t de Student dois lados para analisar os valores normalmente distribuídos e de outra forma Mann-Whitney-testes para análise estatística.

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Resultados

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Em ensaios de esferas convencionais, cerca de 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de células RFP- deu origem a uma esfera tumor individual no ensaio de esferas primário (Figura 4A). Além disso, as esferas formadas por RFP + células eram maiores em tamanho do que os que são formados por células RFP-.

Quando colocadas em ensaios baseados em células individuais, células RFP + também formou mais esferas do que as células RFP-, confirmando os resultados acima. No entanto, havia ...

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Discussão

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Esferas culturas é um método amplamente utilizado para testar o potencial de células estaminais do cancro e para enriquecer as células estaminais do tipo em uma ampla variedade de células tumorais humanas 15,25,26. Sob estas condições de cultura, as células cancerosas que não têm capacidade de auto-renovação são esperados para diferenciar e eventualmente sofrem morte celular. Embora eles podem, inicialmente, formar grupos de células tumorais ou mesmo esferas especialmente em ensaios preliminares, eles não são...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Baden-Württemberg Stiftung (Programa II de Células-Tronco Adultas) concedida a C.L. Agradecemos à Dra. Martina Konantz pela contribuição crítica e revisão do manuscrito. Agradecemos a Emmanuel Traunecker e Toni Krebs do DBM FACS Facility (Hospital Universitário de Basileia) pela assistência na classificação do FACS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de baixa fixaçãoCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinaLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HidrocortisonaLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644concentração final: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bconcentração final: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044concentração final: 1X
Heparina-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02diluição 1:1.000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Tripsina-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189diluição 1: 1.000
DMEM / F12Gibco21041-025
DMEM / F12 (pó)Gibco42400-010
MetilceluloseSigmaM0387
Cloridrato de puromicinaApplichemA2856
Cell classificadorBDAria III classificador de células
FACS analisadorBDAccuri c6 citômetro de fluxo
MicroscópioOlympusIX50 Osiris

Referências

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