O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides.
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Artigo de método
Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco pluripotentes possuem a capacidade de proliferar indefinidamente e de se diferenciar em quase qualquer tipo de célula. Além disso, o desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) gerou interesse e entusiasmo pela possibilidade de medicina regenerativa pessoal personalizada. No entanto, a eficiência da diferenciação de células-tronco em direção a uma linhagem desejada permanece baixa. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo para derivar o epitélio pigmentar da retina (EPR) a partir de células iPS (iPS-RPE) aplicando uma abordagem de engenharia de tecidos para gerar populações homogêneas de corpos embrióides (EBs), um intermediário comum durante a diferenciação in vitro. O protocolo aplica a formação de tamanho específico de EBs usando a tecnologia de placa de micropoços. Os métodos para identificar marcadores proteicos e genéticos de EPR por imunocitoquímica e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) também são explicados. Finalmente, é descrita a eficiência da diferenciação em diferentes tamanhos de EBs monitorados por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de marcadores de RPE. Essas técnicas facilitarão a diferenciação de células iPS em RPE para aplicações futuras.
Introdução
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são um tipo de célula-tronco pluripotentes derivadas através da reprogramação de células adultas com fatores extrínsecos 1. Em contraste, as células estaminais embrionárias (CES), um outro tipo de célula de tronco pluripotente, são gerados a partir da massa celular interna do blastocisto 2-3. Apesar de suas origens diferentes, as células iPS e CES são comparáveis em sua capacidade ilimitada para replicar in vitro e na sua capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula 4-5. Estas características de células iPS torná-los os candidatos ideais para aplicações em medicina ....
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Protocolo
1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura
- Prepare meio de cultura livre de células-tronco-alimentador por adição de 100 ml de suplemento de 5x isento de soro a 400 ml de meio basal de células estaminais. O meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e a -20 ° C durante 6 meses.
- Adicionar 10 mM solução de associado-ró, coiled-coil contendo proteína quinase (Rock) inibidor para comercialmente disponível corpo embryoid (EB) médio de formação (Y-27362).
- Prepare meio de diferenciação pela adição de 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 10% de substituição de soro nocaute (KSR) e....
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Resultados
Neste experimento, as células iPS foram cultivadas e diferenciadas na linhagem RPE da EBS. EB de tamanhos controladas foram formados utilizando placas de micropoços. Como visto na Figura 1 formação EB foi homogénea nas placas de microcavidades. Estes EB foram então recolhidas e colocadas em placas de 6 poços (Figura 2).
EPR podem ser identificados pela sua morfologia hexagonal clássica, pigmentação, e a expressão de marcadores EPR. Após 12 semanas de cultura.......
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Discussão
Para realizar o pleno potencial das células-tronco pluripotentes para terapia celular, é necessário regulamentar a sua diferenciação de uma forma consistente e reproduzível. Este relatório descreve os protocolos para formar EBs controlada porte usando tecnologia de microplaca, iniciar a diferenciação em direção RPE e identificar marcadores de proteínas e genes de RPE. Para sincronizar a diferenciação in vitro, tamanhos homogêneos da EBS foram formados por um número conhecido de células iPS centrifugado em placa.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
As opiniões ou afirmações aqui contidas são opiniões privadas dos autores e não devem ser interpretadas como oficiais ou como refletindo as opiniões do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa. Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene e Jae-Hyek Choi possuíam uma Associação de Pesquisa de Pós-Doutorado do Conselho Nacional de Pesquisa no USAISR. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Medicina de Reabilitação Clínica do Exército dos EUA (CRMRP) e pelo Programa de Pesquisa em Medicina Operacional Militar (MOMRP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mídia mTeSR1 + suplemento 5x Stem | Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Inibidor de Rocha) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M-7154 | |
| Aminoácidos não essenciais | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Substituição de soro knockout | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamina | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM mídia Life | Technologies | 10370-021 | |
| N1 suplemento | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Hidrocortisona | Sigma H0888-1G | ||
| Fetal bovino soro | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium sal Sigma | T6397 | ||
| Hidróxido de sódio | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate tamponado salina | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 placa | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Cytoperm Fixation / Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 anticorpo | Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX anticorpo | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anticorpo anti-MITF | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Coelho Anti-ZO-1 anticorpo | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| RNA de alta capacidade para kit de cDNA | Life Technologies | 4387406 |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol
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Reimpressões e permissões
