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Artigo de método

Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

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DOI:

10.3791/52262

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4 de fevereiro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides.

Resumo

As células-tronco pluripotentes possuem a capacidade de proliferar indefinidamente e de se diferenciar em quase qualquer tipo de célula. Além disso, o desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) gerou interesse e entusiasmo pela possibilidade de medicina regenerativa pessoal personalizada. No entanto, a eficiência da diferenciação de células-tronco em direção a uma linhagem desejada permanece baixa. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo para derivar o epitélio pigmentar da retina (EPR) a partir de células iPS (iPS-RPE) aplicando uma abordagem de engenharia de tecidos para gerar populações homogêneas de corpos embrióides (EBs), um intermediário comum durante a diferenciação in vitro. O protocolo aplica a formação de tamanho específico de EBs usando a tecnologia de placa de micropoços. Os métodos para identificar marcadores proteicos e genéticos de EPR por imunocitoquímica e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) também são explicados. Finalmente, é descrita a eficiência da diferenciação em diferentes tamanhos de EBs monitorados por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de marcadores de RPE. Essas técnicas facilitarão a diferenciação de células iPS em RPE para aplicações futuras.

Introdução

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são um tipo de célula-tronco pluripotentes derivadas através da reprogramação de células adultas com fatores extrínsecos 1. Em contraste, as células estaminais embrionárias (CES), um outro tipo de célula de tronco pluripotente, são gerados a partir da massa celular interna do blastocisto 2-3. Apesar de suas origens diferentes, as células iPS e CES são comparáveis ​​em sua capacidade ilimitada para replicar in vitro e na sua capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula 4-5. Estas características de células iPS torná-los os candidatos ideais para aplicações em medicina regenerativa personalizado. Os recentes esforços de pesquisa estão focados no desenvolvimento de protocolos de diferenciação robustos para a produção de células adultas especializadas, incluindo epitélio pigmentar da retina (RPE) 6-11.

Para potenciais aplicações clínicas de células iPS derivadas, uma diferenciação direcionado para esse tipo específico de célula é essencial. Existem vários métodospublicado pela diferenciação dirigida de ambas as células iPS CES e em RPE que varia muito em sua eficiência 6-7, 12-16. Nós ainda não sabemos muitos dos eventos moleculares que governam o destino de células / tecidos durante o desenvolvimento ou diferenciação. Nos últimos anos, foram feitos esforços para desenvolver o protocolo de diferenciação que pode imitar o desenvolvimento embrionário, tanto quanto possível. Durante a fase de blastocisto, a população não confirmadas de células-tronco estão juntos em um microambiente tridimensional. Assim, várias estratégias foram aplicados para tornar as células CES / iPS reunidos e crescê-las em três dimensões. Estes agregados de células-tronco são chamados de corpos embrióides (EBS). Estudos têm mostrado que a EB diferenciação de células estaminais imitar fase precoce do desenvolvimento do embrião e pode dar origem espontaneamente a endoderme primitiva na sua superfície exterior. Mais tarde, como EB desenvolvimento progride, os fenótipos de células diferenciadas de todas as três linhagens germinais aparecer 17-18. Therefore, o EBS protocolos de diferenciação com base têm atraído muita atenção para a diferenciação in vitro de células ESC / IPS e é um bom candidato para a geração EPR ​​a partir de células-tronco pluripotentes 13.

EB pode ser feita usando vários métodos de células ESC / IPS. Inicialmente, foram feitas EBs raspando as colónias aderentes e mantê-las em cultura em suspensão não-aderente. No entanto, esta abordagem produz população heterogénea de EBs que provoca baixa reprodutibilidade. Suspensão de cultura de células de queda e micropoco formação EBs baseado outras técnicas populares para formação EBs que produzem EBs homogêneos de tamanhos definidos que são altamente reprodutível. Além disso, a técnica de micropoços podem produzir grande número de agregados com menos esforço.

Diferenciação de células dentro EBS é regulada por um multiplex de pistas morfogénicos do microambiente extracelular e intracelular. Em contraste com a diferenciação em um monformato olayer, o EBS fornecer uma plataforma para montagem complexa de células e sinalização intercelular para ocorrer 17. Curiosamente, foi observado o número de células estaminais pluripotentes usados ​​para fazer EBs individuais para influenciar o destino das células. Por exemplo, em um estudo diferenciação hematopoiética da CES humanos, observou-se que 500 células EB promoveu a diferenciação no sentido de linhagem mielóide enquanto que 1.000 células EB empurrado na direcção da linhagem eritróide 20. Em outro estudo, a EBS menores favoreceu diferenciação endoderme Considerando EB maiores promovidas no sentido de neuro-ectoderma diferenciação 11, 17.

Estes estudos anteriores sugerem fortemente que o número de células ESC / IPS usados ​​para fazer EBs individuais afetam as EBs diferenciação com base para quaisquer tipos de células. No entanto, a nosso conhecimento, não há estudos atuais que elucidaram o impacto do tamanho EBs em sua propensão de se diferenciar em direção RPE. O objetivo deste estudo é caracterizar a influência deTamanho EB em induzida células-tronco pluripotentes (IPS) - epitélio pigmentar da retina (iPS-RPE) diferenciação e para identificar o número célula ideal para fazer as EBs para a diferenciação dirigida para RPE linhagem.

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Protocolo

1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura

  1. Prepare meio de cultura livre de células-tronco-alimentador por adição de 100 ml de suplemento de 5x isento de soro a 400 ml de meio basal de células estaminais. O meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e a -20 ° C durante 6 meses.
  2. Adicionar 10 mM solução de associado-ró, coiled-coil contendo proteína quinase (Rock) inibidor para comercialmente disponível corpo embryoid (EB) médio de formação (Y-27362).
  3. Prepare meio de diferenciação pela adição de 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 10% de substituição de soro nocaute (KSR) e 10 ug / ml de gentamicina a Modified Eagle Médium / Nutrient Mixture Dulbecco F-12 (DMEM / F12).
  4. Prepare meio iPS-RPE por adição de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, sal de sódio de 13 ng / ml triiodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina e 15% de soro bovino fetal (FBS) 21 de Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM). Ajustar o pH para 7,4.
  5. Preparar a solução estoque de sal de sódio triiodo-L-thyronine. Dissolve-se 1 mg de sal de sódio triiodo-L-tironina em 1 N de hidróxido de sódio por agitação suave. Adicionar 49 ml de MEM para fazer 50 ml de 20 ug / ml de sal de sódio triiodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final.
  6. Preparar a solução de estoque de hidrocortisona. Solubiliza-se 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol a 100% por agitação suave. Adicionar 19 ml de MEM para fazer 20 ml de 50 ug / ml de solução de estoque de hidrocortisona. Alíquotas e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final.
  7. Preparar uma solução de trabalho de dispase a 1 mg / ml em DMEM / F12.
  8. Preparação das placas de matriz revestido
    1. Prepare matriz proteína extraída da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma si em DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1 ml da solução de matriz. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Após a incubação de 1 hora, aspirar o excesso de DMEM / F12. Adicionar 0,5 ml de meio de cultura de células estaminais livre de alimentador para evitar a secagem dos poços. As placas de matriz revestida está pronto para uso.
  9. Para preparar as placas de micropoços, por lavagem de cada poço com 2 ml de DMEM / F12. Remover DMEM / F12 e adicionar 0,5 ml de meio de formação de EB suplementado com inibidor da rocha a cada poço. Centrifugar a placa a 2000 xg durante 5 minutos para remover quaisquer bolhas de ar.
  10. Preparar tampão de coloração de FACS através da mistura de 2% de FBS e 0,09% de azida de sódio em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ajustar o tampão de pH 7,4.
  11. Preparar a solução de neutralização de tripsina por adição de 10% FBS para DMEM / F12.

2. iPS Cultura

  1. Antes da semeadura de células iPS, warm-tronco meio de cultura de células sem alimentador de até 37 ° C, e têm a matrix placas revestidas pronto.
  2. Rapidamente descongelar as células iPS IMR90-1 em um banho de água a 37 ° C. Em seguida, retire o crio-frasco do banho de água e limpe o frasco com etanol 70%. Transferem-se as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de aglomerados de células.
  3. Adicionar 5 ml de meio de cultura de células-tronco quente livre de alimentador para as células, gota a gota e misture delicadamente. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
  4. Ressuspender cuidadosamente os aglomerados de células em 2 ml de meio de cultura de células-tronco sem alimentador e semear os aglomerados de células nos poços de placa revestida com matriz. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2, 95% de humidade.
  5. Alterar o meio de cultura de células iPS diária. Observe colônias indiferenciadas cinco a sete dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para passagem (colônias com um centro denso) sob um microscópio de luz.

3. Passaging de iPS Cells

  1. A passagem das células iPS antes de começar, aqueça a solução dispase, DMEM / F12 e haste meio de cultura de células sem alimentador de 37 ° C em banho-maria.
  2. Antes passaging células iPS, remova todas as áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirar o meio. Lavar cuidadosamente as células iPS com 2 ml de DMEM / F12.
  3. Adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM / F12 duas vezes. Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de meio de cultura livre de células-tronco-alimentador para cada poço.
  4. Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar aglomerados de células. Transfira os aglomerados de células isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar haste meio de cultura de células sem alimentador suficiente para semear a próxima passagem de células.

4. Geração da EBS Usando Microplacas

  1. Preparação de uma suspensão de células isoladas de células iPS
    1. Remover o medium a partir de células iPS e lave as células iPS com 2 ml de DMEM / F12. Adicionar 750 ul de Accutase para células iPS em cada poço da placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células a separar da placa (cerca de 5-10 minutos).
    2. Usar uma pipeta para dissociar suavemente as células restantes e a separar quaisquer células restantes na superfície da placa. Transferem-se as células para um tubo cónico de 50 ml. Lavar a placa com 5 ml de DMEM / F12 e combinar o enxaguado DMEM / F12 com as células no tubo cónico. Passar a suspensão de células através de um coador de células de 40 mm para remover quaisquer possíveis aglomerados de células residuais.
    3. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente para remover a Accutase. Ressuspender o sedimento de células em meio de formação de EB modo que a concentração de células é de cerca de 0,5-1,0 x 10 7 células / ml.
    4. Determinar o número de células viáveis ​​por contagem das células com azul de tripano e um hemocitómetro.
  2. Adjusting densidade celular em micropoços para formar EBs controlada de tamanho
    1. Ajustar o número de células para cada poço da placa de micropoços para gerar os desejados tamanhos EB. Adicionar células aos micropoços das placas preparadas no passo 1.9, distribuir uniformemente as células por suavemente pipetando as células várias vezes.
      NOTA: Número de células por poço requeridas = o número desejado de células por EB x número de micropoços por poço.
    2. Ajustar a forma formação EB suplementado com inibidor de rocha nos poços para um volume final de 2,0 ml. Redistribuir as células com cuidado pipetando cada poço. Centrifugar as placas de micropoços a 100 xg durante 3 min. Colocar as placas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas.
  3. EBs colheita das placas de micropoços
    1. Colheita de EBs micropoços por meio de pipetagem no poço cima e para baixo com uma micropipeta 1 ml para remover a maior parte dos CEs. Passar a suspensão através de uma célula EB 40 um invertidafiltro no topo de um tubo cónico de 50 ml para remover as células individuais.
    2. Lava-se a placa de micropoços 5 vezes com 1 ml de DMEM / F12 para remover todos os CEs. Recolha lavagens e passar por cima do filtro de células invertido. Vire filtro de células do lado direito para cima para um novo tubo de 50 ml. Recolha as EBs por lavagem com meio formação EB. Contagem EBS para determinar o rendimento.

5. chapeamento EBs e Iniciando Diferenciação

  1. Placa os CEs em matriz de proteína revestidas placas de seis poços (como no passo 1.8.1), a uma densidade de <1000 EB / poço em meio de formação de EB mais 10 uM de inibidor da rocha. Incubar as CEs a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas.
  2. 24 horas após a EB chapeamento, substitua-o por meio de diferenciação para iniciar a diferenciação. Mudar metade do meio de diferenciação em dias alternados até as células são recolhidas para análise posterior.
  3. Recolher amostras no dia 6, 17, 29 e 60 para realizar RT-PCR, immunocytochemistry e FACS para validar a expressão de genes e proteínas do EPR característicos.

6. Extração de RNA e PCR

  1. Extrai-se ARN a partir de amostras EB acordo com as instruções fornecidas no kit disponível comercialmente. Determinar a concentração de RNA usando um espectrofotómetro.
  2. Realizar a transcrição reversa em 100 ng de ARN total de acordo com o ARN em ADNc comercialmente disponível kit de transcrição reversa.
  3. Executar PCR com 10 ng de ADNc, utilizando os seguintes iniciadores (Tabela 1), a uma concentração de 10 pmol / 10 ng de cDNA. Definir a PCR como se segue: desnaturar o ADN, a 95 ° C durante 5 min, com 35 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de um ciclo final de 72 ° C durante 10 min. Executar o produto de PCR num gel de agarose 1%.

7. Immunocytochemistry

  1. Lavar as CEs com PBS duas vezes à temperatura ambiente. Fixar as EBs na RT em 4% paraformaldehyde durante 10 min. Lavar uma vez com PBS à temperatura ambiente. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até ser utilizado para a coloração.
  2. No dia da coloração, tratar as células fixas com fixação e permeabilização reagentes. Incubar as amostras com a solução (10% de soro de cabra em solução de permeabilização) durante 1 h à TA bloqueio.
  3. Realizar imunoquímica em 10% de soro de cabra em solução de permeabilização utilizando os seguintes anticorpos primários nas diluições indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubar as amostras com anticorpos O / N correspondente a 4 ° C.
  4. No dia seguinte, remover o anticorpo primário a partir das células e lavar as amostras três vezes com PBS. Incubar as amostras com anticorpos secundários fluoróforos, durante 1 h à TA.
  5. Remover o anticorpo secundário a partir das células e lavar as amostras três vezes em PBS. Montar a tampa desliza sobre lâminas de vidro com meio de montagem contendo DAPI e permitir que as amostras para definir O / N em câmara escura.Usar um microscópio de fluorescência para visualizar a coloração.

8. Coloração para análise FACS

  1. Lavar as CEs cultivadas em PBS duas vezes. Incubar as CEs com 0,5 ml de 0,25% de tripsina, durante 5-10 minutos para se obter uma suspensão de célula única. Neutraliza-se a tripsina com uma solução de tripsina neutralizante (1 ml / poço).
  2. Transferir a suspensão de células individuais para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min.
  3. Descartar o sobrenadante e adicionar 10 ml de DMEM / F12 para as células no tubo. Inverter cuidadosamente para misturar as células. Centrifuga-se a 600 x g. Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de coloração de FACS.
  4. Contar o número total de células. Centrifugar a 600 xg por 10 min. Após centrifugação descarte sobrenadante. Fixar as células imediatamente por adição de 0,5 ml de paraformaldeído a 4%. Misture bem em vórtice suave. Incubar as células a 4 ° C durante 20 min.
  5. Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover osobrenadante. Vortex suavemente para perturbar o sedimento celular. Permeabilizar as células por adição de 1 ml de solução de permeabilização refrigeradas. Vortex suavemente para misturar e incubar em gelo durante 30 min.
  6. Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover o sobrenadante. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS e ressuspender. Repita este passo para mais uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração de FACS a uma concentração final de 5 x 10 6 células / ml.
  7. Transferir 100 ul da suspensão de células (0,5 x 10 6 células) para cada um de microcentrífuga tubos e adicionar o volume recomendado de anticorpo primário. Para Pax6, adicionam-se 5 ul de PE anti-Pax6 em 100 ul de suspensão de células. Para MITF, adicionam-se 5 ul de anti-MITF em 100 ul de suspensão de células.
  8. Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 60 min. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS. Misturar e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e repetir 8,16 por duas vezes adicionais.
  9. Para a coloração de MITF, incubar as células na Antibo secundáriody, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488, a uma diluição de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para a coloração Pax6, evitar este passo.
  10. Lavam-se as células com 5 ml de tampão de coloração de FACS e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Repetir o processo por mais duas vezes.
  11. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de coloração de FACS e vórtice suavemente para perturbar o sedimento celular. As amostras estão prontos para análise de citometria de fluxo.

9. iPS-RPE Isolamento e Cultura

  1. No dia 29, cuidadosamente cortadas à volta das colónias pigmentadas seleccionados a partir da placa de cultura utilizando uma pipeta de ponta de 200 ul. Transfira as colônias flutuantes para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se as colónias a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
  2. Ressuspender as colónias de células em 10 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante.
  3. Prepara-se uma suspensão de células individuais por incubação das colónias com 2 ml de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Gentilmente vortex a suspensão de células de dissociar as colônias.
  4. Neutralizar a tripsina, adicionando 2 ml de meio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células individuais em 2 ml de meio iPS-RPE. Transferem-se as células em uma matriz proteica revestido placa de 6 poços e lugar numa incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade.

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Resultados

Neste experimento, as células iPS foram cultivadas e diferenciadas na linhagem RPE da EBS. EB de tamanhos controladas foram formados utilizando placas de micropoços. Como visto na Figura 1 formação EB foi homogénea nas placas de microcavidades. Estes EB foram então recolhidas e colocadas em placas de 6 poços (Figura 2).

EPR podem ser identificados pela sua morfologia hexagonal clássica, pigmentação, e a expressão de marcadores EPR. Após 12 semanas de cultura...

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Discussão

Para realizar o pleno potencial das células-tronco pluripotentes para terapia celular, é necessário regulamentar a sua diferenciação de uma forma consistente e reproduzível. Este relatório descreve os protocolos para formar EBs controlada porte usando tecnologia de microplaca, iniciar a diferenciação em direção RPE e identificar marcadores de proteínas e genes de RPE. Para sincronizar a diferenciação in vitro, tamanhos homogêneos da EBS foram formados por um número conhecido de células iPS centrifugado em placa...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

As opiniões ou afirmações aqui contidas são opiniões privadas dos autores e não devem ser interpretadas como oficiais ou como refletindo as opiniões do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa. Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene e Jae-Hyek Choi possuíam uma Associação de Pesquisa de Pós-Doutorado do Conselho Nacional de Pesquisa no USAISR. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Medicina de Reabilitação Clínica do Exército dos EUA (CRMRP) e pelo Programa de Pesquisa em Medicina Operacional Militar (MOMRP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mídia mTeSR1 + suplemento 5x StemCell Technologies5850
Y-27632 (Inibidor de Rocha)Stem Cell Technologies72304
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-MercaptoetanolSigmaM-7154
Aminoácidos não essenciaisHyclone(Fisher)SH30853.01
Substituição de soro knockoutLife Technologies10828-028
Gentamicina Life Technologies15750-060
L-GlutaminaLife Technologies25030-081
MEM mídia LifeTechnologies10370-021
N1 suplementoSigmaN-6530-5ML
TaurinaSigmaT-8691-25G
HidrocortisonaSigma H0888-1G
Fetal bovino soroHyclone(Fisher)SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium sal SigmaT6397
Hidróxido de sódioSigmaS5881
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Phosphate tamponado salinaHyclone(Fisher)10010-023
Aggrewell 400 placaStem Cell Technologies27940
AggreWell mediumStem Cell Technologies5893
AccutaseStem Cell Technologies7920
BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Cytoperm Fixation / Permeabilization KitBD Biosciences554714
Mouse Anti-PAX6 anticorpoEstudos de desenvolvimento Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX anticorpoAbcamAb23340
Mouse  Anticorpo anti-MITFThermo ScientificMS-772-P
Coelho Anti-ZO-1 anticorpoInvitrogen40-2200
RNeasy plus mini kitQiagen74134
PCR master mixPromegaM7502
RNA de alta capacidade para kit de cDNALife Technologies4387406

Referências

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