Este protocolo de nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para completar a coloração imuno-histoquímica de cérebros de roedores, usando marcadores para microglia e elementos neuronais como exemplo.
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Artigo de método
Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imuno-histoquímica é uma técnica amplamente utilizada para detectar a presença, localização e abundância relativa de antigénios in situ. Este protocolo nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para concluir coloração imuno-histoquímica de tecido cerebral dos roedores, utilizando marcadores para microglia e elementos neuronais como um exemplo. Especificamente, este documento é um protocolo passo-a-passo para visualização fluorescente de microglia e neurônios via imunohistoquímica para Iba1 e pan-neuronal, respectivamente. Fluorescência-marcação dupla é particularmente útil para a localização de várias proteínas dentro da mesma amostra, proporcionando a oportunidade de observar com precisão interacções entre tipos de células, receptores, ligandos, e / ou a matriz extracelular em relação um ao outro, bem como co-proteína localização dentro de uma única célula. Ao contrário de outras técnicas de visualização, a intensidade da coloração imuno-histoquímica de fluorescência pode diminuir emas semanas a meses após a coloração, a menos que sejam tomadas precauções apropriadas. Apesar desta limitação, em muitas aplicações de rotulagem de fluorescência dupla é preferida em relação às alternativas tais como tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) ou fosfatase alcalina (AP), como fluorescência é mais eficaz do tempo e permite a diferenciação mais precisa entre dois ou mais marcadores. A discussão inclui dicas de solução de problemas e conselhos para promover o sucesso.
Introdução
A imuno-histoquímica é um processo para a detecção de antigénios (por exemplo, proteínas) em secções de tecido utilizando anticorpos primários que se ligam especificamente aos antigénios de interesse. A imuno-histoquímica foi lançada pela JR Marrack em 1934, quando ele determinou que os anticorpos poderiam localizar antígenos com grande especificidade 1. A partir de 1942, alguns dos primeiros estudos in vitro, utilizando anticorpos fluorescentes para visualizar imuno-histoquímica, foram publicadas 2,3, após o que o primeiro estudo in vivo histoquímica foi publicado em 4. Durante a década de 1960, três ....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o cuidado e uso de animais Comitê Institucional (IACUC) da Universidade do Arizona. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados podem ser encontrados na Tabela 1.
1. Preparação do Tecido
- Perfusão
- Eutanásia roedor com uma overdose de pentobarbital de sódio (25 mg / kg, IP), e perfundir transcardíaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de completamente sangrados (3-5 min) a um caudal de 8 ml / min. Para obter instruções de perfusão em profundidade, ver Gage et al 2012 9.
- Imediatamente após a des....
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Resultados
Este protocolo de coloração resulta em cortes de tecido de cérebro de rato que microglia com marcação fluorescente no canal 594 (vermelho) e neurónios marcados no canal 488 (verde; ver Figura 4). Se uma mancha nuclear tem sido feito, ele irá mostrar no canal 405 (azul). As imagens podem ser tomadas em diferentes canais e sobrepostos para comparação directa dos três canais, ou entre quaisquer dois canais. Muitos pacotes de software de aquisição digitais incluir essa funcionalidade. Double-marcação com Ib.......
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Discussão
O objectivo global desta comunicação era introduzir procedimentos de imuno-histoquímica para o leitor. Para isso, o exemplo da rotulagem de casal com Iba1 e antígenos Pan-neuronais para observar microglia e neurônios em paraformaldeído perfusão, foi utilizado sacarose cérebro crioprotegidos, rato criosseccionada.
Esta técnica pode ser adaptado para servir finalidades infinitas. Uma matriz de antigénios diferentes numa variedade de tipos de tecidos tais como, mas não limitado para o cérebro, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Ryan Hart e ao Sr. Arriz Lucas por seu inestimável feedback sobre esta comunicação. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NINDS R01 NS065052 e Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas de Vidro Superfrost Plus da Fisherbrand | Fisher Scientific | 22-034-979 | Usado para montagem de tecido (1.2.2) |
| Forno | Thermo Scientific | 51028112 | Usado para secagem de tecido (2.1.1) |
| Mini caneta de Papanicolau | Life Technologies | 00-8877 | Usado na etapa 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Usado para todas as lavagens durante a coloração (2.2), bem como a etapa Hoechst (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Usado para secar lâminas (2.2) |
| Caixa de coloração preta | Ted Pella | 21050 | Usado para bloquear e colorir etapas (2.2) |
| Soro de burro normal | Fisher Scientific | 50-413-253 | Usado para incubação de blocos e anticorpos (2.2) |
| Camundongo α-Pan-neuronal | Millipore MAB2300 | Usado para anticorpo primário (2.2.4) | |
| Coelho α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Usado para anticorpo primário (2.2.4) |
| Burro α-coelho 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Usado para anticorpo secundário (2.2.6) |
| Burro α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Usado para anticorpo secundário (2.2.6) |
| Folha de Caterer | Qualquer | N/A | Usado nas etapas 1.2.2 e 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Usado para aplicação de lamínulas (2.2.8) |
| Lamínulas | Fisher Scientific | 12544E | Usado para aplicação de lamínulas (2.2.8) |
| Esmalte para Unhas Transparente | Qualquer | N/A | Usado para lamínula (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 e LSM 710 (varredura a laser, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Usado para imagens (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Usado para imagens (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Para o protocolo DAB | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | Para o protocolo DAB |
| Kit DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Para o protocolo DAB |
| Laboratórios de vetor IgG de cavalo α-coelho biotinilado | BA-1100 | Para o protocolo DAB | |
| Laboratórios de vetor IgG de cavalo α-mouse biotinilado | BA-2001 | Para protocolo DAB | |
| 30% Peróxido de hidrogênio | FisherScientific | H325-500 | Para protocolo DAB |
| Wheaton slide racks e pratos de coloração | TedPella | 21043 | Para protocolo DAB |
| Bomba de perfusão Masterflex e tubulação | Cole-Parmer | Usado para perfusão (1.1.1 e 1.1.2) | |
| Composto científico de tecido Andwin CRYO-OCT (caso de 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Usado para congelamento de tecidos (1.2.1) |
| Termômetro (-50 a 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Usado para congelamento de tecidos (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Usado para seccionamento de tecido (1.2.2) |
| Prato de coloração, plástico com 2 tampas | Grale Scientific | 353 | Para retrival de antígeno |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | Para retrival de antígeno |
| Microondas | Qualquer | N / A | Para retrival de antígeno |
Referências
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marsha....
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Reimpressões e permissões
