Este protocolo de nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para completar a coloração imuno-histoquímica de cérebros de roedores, usando marcadores para microglia e elementos neuronais como exemplo.
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Artigo de método
Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imuno-histoquímica é uma técnica amplamente utilizada para detectar a presença, localização e abundância relativa de antigénios in situ. Este protocolo nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para concluir coloração imuno-histoquímica de tecido cerebral dos roedores, utilizando marcadores para microglia e elementos neuronais como um exemplo. Especificamente, este documento é um protocolo passo-a-passo para visualização fluorescente de microglia e neurônios via imunohistoquímica para Iba1 e pan-neuronal, respectivamente. Fluorescência-marcação dupla é particularmente útil para a localização de várias proteínas dentro da mesma amostra, proporcionando a oportunidade de observar com precisão interacções entre tipos de células, receptores, ligandos, e / ou a matriz extracelular em relação um ao outro, bem como co-proteína localização dentro de uma única célula. Ao contrário de outras técnicas de visualização, a intensidade da coloração imuno-histoquímica de fluorescência pode diminuir emas semanas a meses após a coloração, a menos que sejam tomadas precauções apropriadas. Apesar desta limitação, em muitas aplicações de rotulagem de fluorescência dupla é preferida em relação às alternativas tais como tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) ou fosfatase alcalina (AP), como fluorescência é mais eficaz do tempo e permite a diferenciação mais precisa entre dois ou mais marcadores. A discussão inclui dicas de solução de problemas e conselhos para promover o sucesso.
Introdução
A imuno-histoquímica é um processo para a detecção de antigénios (por exemplo, proteínas) em secções de tecido utilizando anticorpos primários que se ligam especificamente aos antigénios de interesse. A imuno-histoquímica foi lançada pela JR Marrack em 1934, quando ele determinou que os anticorpos poderiam localizar antígenos com grande especificidade 1. A partir de 1942, alguns dos primeiros estudos in vitro, utilizando anticorpos fluorescentes para visualizar imuno-histoquímica, foram publicadas 2,3, após o que o primeiro estudo in vivo histoquímica foi publicado em 4. Durante a década de 1960, três décadas após o início dos métodos imuno-histoquímica, os anticorpos conjugados com enzimas começou a ser usado como reagentes secundários. Estes métodos foram simultaneamente e independentemente desenvolvido na França e os EUA 5,6. Hoje, uma grande variedade de anticorpos oferece infinitas possibilidades para estudos de imunohistoquímica 7.
"> O objetivo geral desta correspondência é fornecer uma breve introdução sobre coloração imuno-histoquímica, não pretende ser uma análise abrangente e exaustiva desta técnica No método descrito, técnicas de imunohistoquímica para dois antígenos são apresentados (marcadores para microglia e. neurónios) para a coloração de paraformaldeído perfundido, sacarose crioprotegidos, criosseccionada cérebro de rato. coloração imuno-histoquímica começa com o bloqueio de ligação para reduzir a coloração de fundo não específica de antigénio. Em seguida, a incubação com anticorpo primário permite a ligação a um antigénio específico no tecido. Após o anticorpo primário, outro anticorpo, denominado anticorpo secundário, é aplicado para ligar o anticorpo primário a um sinal de visualização conjugado 8. O anticorpo secundário tem como alvo a imunoglobulina G (IgG) de domínio específico para as espécies em que o anticorpo primário foi levantadas. O anticorpo secundário amplifica o sinal do anticorpo primário, uma vez as regiões Fab de tque se ligam ao anticorpo secundário múltiplos locais no domínio de IgG do anticorpo primário. Enzimas ou moléculas fluorescentes conjugados com as regiões C F do anticorpo secundário permitir a visualização. Por exemplo, um anticorpo primário de coelho anti-Iba1 é uma molécula de IgG de coelho específico para Iba1. Quando burro anti-IgG de coelho é aplicado como anticorpo secundário, ele irá reconhecer e ligar-se a várias regiões do anticorpo anti-IgG de coelho Iba1 (ver Figura 1). O anticorpo de burro pode ser visualizado através de vários métodos. Esta correspondência se concentra na detecção de um fluoroforo conjugado com o anticorpo secundário, o qual reconhece o anticorpo primário, para a visualização por microscopia fluorescente. Em imuno fluorescente, um corante nuclear tal como Hoechst DAPI ou pode ser usado para visualizar todos os núcleos.
Figura 1: SchEmatic de representação directa vs. indirecta técnicas de marcação de anticorpos. Os anticorpos ligam-se ao antigénio de interesse e podem ser amplificados por anticorpos secundários dirigidos contra as espécies de os anticorpos primários. Esta técnica pode ser realizada utilizando complexo de avidina-biotina (ABC) para a amplificação e para a visualização DAB (A), ou um anticorpo secundário fluorescente directamente conjugado (B). Alternativamente, os anticorpos primários podem ser directamente conjugado com muitas marcas diferentes, incluindo biotina ou um fluoróforo (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um método alternativo para a visualização de coloração imuno-histoquímica utiliza 3,3'-diaminobenzidina (DAB; ver Figuras 1 e 2). Isso é diferente de fluorescência usando um biotinilado ouperoxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo secundário, o qual fornece uma enzima para converter DAB a um precipitado que é visível sob microscopia de campo claro. Nos casos em que um único antígeno é de interesse ou coloração é necessário para ser duradouro, DAB pode ser mais apropriado do que a coloração fluorescente. No entanto, a coloração DAB não é bem adequada para a diferenciação entre vários marcadores, especialmente se dois antigénios nucleares são de interesse. Para obter informações sobre materiais DAB e modificações do protocolo, consultar Tabela 1. Em alternativa, cloreto de nitro azul de tetrazólio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) pode ser usado para visualizar uma fosfatase alcalina (AP) secundário conjugado anticorpo.
Figura 2:. Imagens representativas de cortes de tecido cerebral de níquel reforçada DAB individuais marcado Rato Rato cérebro ifficções que são rotulados com DAB-níquel reforçada para Iba1 (A) e pan-neuronal (B) permitir a análise de longa duração da microglia ou neurônios sozinho. Barra de escala de 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Deve-se considerar a abundância estimado do antigénio de interesse dentro do tecido a ser analisado. Os métodos indirectos (como descrito acima) são úteis para alvos com baixa abundância. Quando o antigénio de interesse é em grande abundância, métodos directos podem ser aplicados. Os métodos directos envolvem um anticorpo primário que é conjugado directamente a um sinal de visualização, e, portanto, não é necessária qualquer anticorpo secundário. Este método simplifica o processo de coloração, mas elimina a amplificação alcançado por métodos indirectos. Usando um anticorpo primário conjugado directamente elimina também a reactividade cruzada de anticorpos secundáriosquando a rotulagem dupla.
Esta comunicação detalha o protocolo para a rotulagem de casal com Iba1 e Pan-neuronais (detalhes na Tabela 1). Iba1 manchas microglia em muitos estados de ativação, incluindo ramificados, hiper-ramificado, ativado, amebóides, ea vara. Manchas Pan-neuronais neuronal axônios, dendritos, e Soma. Desde Iba1 manchas mais microglia e metas Pan-neuronais do neurônio, esta combinação de manchas é útil na obtenção de um amplo entendimento das interações microglia-neurônio.
Em suma, a coloração imuno-histoquímica conta com a seleção cuidadosa de anticorpos. Como a questão de pesquisa se torna mais específica, os anticorpos produzidos contra antígenos alternativas pode ser desejado. Para atingir um estado de ativação microglial específico, pode-se optar pelo uso de anticorpos CD45 ou CD68, ao invés de Iba1. Além disso, ao trabalhar com camundongos, F4 / 80 pode obter os resultados necessários. Da mesma forma, os elementos neuronais pode ser dirigida especificamente com anticorpos razada contra o núcleo, sinapse (pré ou pós), axônio, e crescimento cone. Além disso, há outros marcadores que distinguem a idade do neurónio (duas vezes Cotrin, NeuN), e a regeneração neuronal (GAP-43).
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o cuidado e uso de animais Comitê Institucional (IACUC) da Universidade do Arizona. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados podem ser encontrados na Tabela 1.
1. Preparação do Tecido
- Perfusão
- Eutanásia roedor com uma overdose de pentobarbital de sódio (25 mg / kg, IP), e perfundir transcardíaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de completamente sangrados (3-5 min) a um caudal de 8 ml / min. Para obter instruções de perfusão em profundidade, ver Gage et al 2012 9.
- Imediatamente após a descarga de PBS, fixar o tecido irrigando com paraformaldeído a 4% em PBS durante 15-20 min a um caudal de 8 ml / min.
- Remover cérebro e em lugar de 4% de paraformaldeído durante 24 horas, seguido de soluções de sacarose graduadas (15%, 30%, 30%, em sequência; preparado em solução salina tamponada com Tris) a 4 ° C. Transferir o cérebro para o subsequente solução de sacarose óomente depois que o cérebro tem afundado em cada solução. Nota: Normalmente, 5 dias em cada solução é tempo suficiente para que o tecido a afundar.
- Congelamento do tecido e cryosectioning
- Inserir o cérebro em meio de inclusão, tal como o composto outubro e submergir em isopentano a uma temperatura de -35 ° C. Permitir que o cérebro de congelamento por um período mínimo de 10 minutos, e, em seguida, armazena-se a -80 ° C. Problemas podem surgir se a diligência temperatura não é tomada; por favor, veja a discussão para solucionar problemas de informações.
- Os cortes coronais em série com uma espessura de 20 um e uma temperatura de -20 ° C. Recolha tecido em lâminas carregados positivamente. Secções do cérebro pode ser colocado em uma caixa corrediça envolvido em folha de um saco de correr superior e armazenada a longo prazo a -80 ° C. Este método de armazenamento cria um limite duplo para evitar a exposição ao ar e geada.
2. Processamento de Tecidos
NOTA: equipamentos e materiais Exemplo required para a coloração são mostrados na Figura 3. As alternativas estão disponíveis, no entanto, essas imagens vão ajudar aqueles novos para coloração imuno-histoquímica de visualizar itens apropriados antes de comprar.
Figura 3: Exemplo de itens necessários para coloração imuno-histoquímica A caixa preta mostrado em (A) é uma câmara de umidade ideal para imunofluorescência, como lâminas são protegidas da luz sem a necessidade de envolver a caixa na folha.. Após corte, as lâminas podem ser armazenadas numa caixa tal como a caixa de amarelo mostrado em (B). Envolvendo a caixa firmemente em papel alumínio e colocar em um saco zip-top antes do congelador ajuda a proteger as amostras de tecido do freezer queimar. Um exemplo de lâminas é dada em (C), com diferentes pratos de coloração descritos em (D) e (E ). As lamelas podem variar em tamanho e espessura (F), no entanto 1.2 lamelas grossas proporcionam bons resultados de imagem na maioria dos microscópios confocais e verticais. Um lápis tal como o representado em (G) pode ser utilizado para rotular os slides. Marcadores permanentes devem ser evitados como a tinta pode correr, afetando tanto a coloração ea capacidade de determinar que a amostra é. Uma caneta PAP de mini tal como o mostrado em (H) permite uma borda repelente para ser desenhada em lâminas.
- Preparação da lâmina
- Retirar as lâminas do congelador e descongelamento à temperatura ambiente.
- Opcional: Se as secções foram previamente flutuou de lâminas, colocar as lâminas descongeladas num forno a 60 ° C durante não mais de 4 horas para ajudar a prevenir a partir de secções de tecido flutuando lâminas.
- Colocar as lâminas em um rack de slides e correspondente prato.
- Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada, solução entre lavagens mudando. A partir deste passo em frente, evite ter seçons sem líquido por longos períodos de tempo. Nota: Se seções secar, coloração de fundo é aumentada e dados significativos não pode ser obtida de forma confiável.
- Retirar as lâminas do congelador e descongelamento à temperatura ambiente.
- A coloração de tecidos
- Em uma caixa de coloração à prova de luz, criar uma "câmara de umidade", com tecidos sem fiapos umedecido com água deionizada.
- Seque as bordas do slide com um tecido que não solte fiapos, use um mini caneta pap para fazer uma fronteira repelente líquido bem na borda do slide, longe de cortes de tecido. Esta fronteira devem assegurar suficiente espaço entre o menisco do líquido e a borda do tecido de modo que a tensão superficial não afecta a coloração.
NOTA: O repelente fronteira caneta PAP pode ser aplicado antes 2.1.3 se os anticorpos de interesse não precisa de recuperação de antigénios microondas. Se a caneta pap tem sido aplicado antes da lavagem em PBS, a integridade da fronteira repelente de líquido deve ser verificado nesta etapa. Use uma caneta mini-pap para preencher eventuais lacunas na fronteira. - Com as lâminas colocado horizontalmente, a ligação não específica de antigénio bloco por incubação em 4% v / v de soro em PBS (solução bloqueadora). Pipetar 300 ul de solução de bloqueio, por lâmina, durante 1 hora à temperatura ambiente. Certifique-se a solução de bloqueio estende-se para a caneta PAP na borda da lâmina e cobre completamente o tecido para evitar a coloração desigual provocado por tensão superficial perto do tecido.
- Use soro da mesma espécie em que o anticorpo secundário é feito. Nota: Neste processo, os anticorpos secundários são feitos em burro, e, assim, é utilizado soro de burro. Se forem utilizados anticorpos secundários a partir de duas ou mais espécies diferentes, incluem soro de cada espécie.
- Pipeta anticorpo primário em lâminas. Nota: As concentrações de anticorpos para esta coloração foram otimizados em 1: 5.000 e 1: 500 para Iba1 e pan-neuronal, respectivamente. Estas concentrações foram encontrados para mostrar a coloração significativa com uma ausência de coloração de fundo.
- Solução diluída de bloco para1% de soro em PBS e adicionar anticorpos primários. Pipetar 300 ul de solução de anticorpo primário em 1% de soro, por lâmina. Mais uma vez, é assegurar que o fluido para a extremidade da caneta PAP. Incubar durante a noite a 4 ° C.
- Incluem três lâminas de controlo: uma que contém anticorpos nem Iba1 nem Pan-neuronais, um com Iba1 sem anticorpo pan-neuronal, e outro com anticorpos pan-neuronal sem Iba1. Mancha estas lâminas na mesma corrida com as mesmas soluções, no entanto omitir os anticorpos primários para testar a ligação não específica de anticorpos secundários.
- Na manhã seguinte, lavagem das lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada, solução entre lavagens mudando.
- Anticorpos fluorescentes são sensíveis à luz, portanto, a partir deste passo em frente, minimizar a exposição à luz, garantindo recipientes de lavagem são envoltos em papel alumínio e caixas de hibridação são preto ou incubadas no escuro. Pipetar os anticorpos secundários apropriados em todos os slides e incubar por60 min à temperatura ambiente a uma concentração de 1: 250 em solução de bloqueio (ver o passo 2.2.3) em uma "câmara de humidade" à prova de luz (ver o passo 2.2.1).
- Use anticorpos secundários de diferentes comprimentos de onda. Aqui, para o anticorpo primário de coelho anti-Iba1, utilizar coelho de burro anti-594 como o anticorpo secundário adequado. Para o rato anticorpo primário anti-Pan-neuronal, utilizar de burro anti-ratinho de 488 como o anticorpo secundário adequado. Alternativamente, usam anti-coelho 488 e 594 anti-rato.
- Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada.
- Opcional: executar coloração nuclear.
- Colocar em Hoechst (ou outro corante nuclear) a uma concentração de 0,03 ug / ml em H2O destilada dupla para 0 exactamente 60 segundos.
- Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada.
- Lavar em DDH 2 0.
- Lamínula
- Lâminas lamela com um meio de montagem aquoso, tal como Fluoromount-G ou ProlongGold. Tome o cuidado de remover todas as bolhas usando um aplicador com ponta de algodão.
Nota: Outros agentes de montagem poderia ser usado, por mais alto bleed-through entre corantes tem sido observado por alguns poucos dias de lamínulas. - Use clara unha polonês para selar as bordas, evitando as seções de secar devido à evaporação. Permitir unha polonês para secar em um recipiente à prova de luz, enquanto desliza permanecer plana e à temperatura ambiente, e, em seguida, armazenar em um recipiente à prova de luz envolvido em folha a 4 ° C.
- Lâminas lamela com um meio de montagem aquoso, tal como Fluoromount-G ou ProlongGold. Tome o cuidado de remover todas as bolhas usando um aplicador com ponta de algodão.
3. Imaging o tecido manchado
- Microscopia
- Permitir a unha polonês para secar por pelo menos uma hora antes de começar microscopia, o que deve ocorrer em uma sala escura.
- Adquirir microfotografias usando um microscópio confocal ou pesquisa com uma fonte de luz fluorescente e um anexo de câmera digital. Usando o software que acompanha, definir a exposição para cada comprimento de onda - 405, 488, e 594 - separadamente. Nota: em profundidade instruções de imagem deve estar disponível on-line a partir do fabricante microscópio.
- Adquirir microfotografias em cada canal, sem mover as seções ou ajustar o foco. Tire fotos em cor, ou alternadamente em escala de cinza e converter para colorir depois.
Observação: As imagens em escala de cinza de cada canal de cor ou pode ser agrupada em pós-processamento. - Assegurar que as secções de tecidos não são expostas à luz ambiente ou luz de microscópio, para longos períodos de tempo, como foto-branqueamento das secções ocorrerá. Para evitar isso, aumentar o tempo de exposição, em vez de aumentar a intensidade de luz / laser.
- Não desligue a fonte de luz fluorescente dentro de 30 min de ser ligado.
Nota: Alterar a origem de ligar e desligar em rápida sucessão pode diminuir a vida útil da lâmpada fluorescente.
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Resultados
Este protocolo de coloração resulta em cortes de tecido de cérebro de rato que microglia com marcação fluorescente no canal 594 (vermelho) e neurónios marcados no canal 488 (verde; ver Figura 4). Se uma mancha nuclear tem sido feito, ele irá mostrar no canal 405 (azul). As imagens podem ser tomadas em diferentes canais e sobrepostos para comparação directa dos três canais, ou entre quaisquer dois canais. Muitos pacotes de software de aquisição digitais incluir essa funcionalidade. Double-marcação com Ib...
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Discussão
O objectivo global desta comunicação era introduzir procedimentos de imuno-histoquímica para o leitor. Para isso, o exemplo da rotulagem de casal com Iba1 e antígenos Pan-neuronais para observar microglia e neurônios em paraformaldeído perfusão, foi utilizado sacarose cérebro crioprotegidos, rato criosseccionada.
Esta técnica pode ser adaptado para servir finalidades infinitas. Uma matriz de antigénios diferentes numa variedade de tipos de tecidos tais como, mas não limitado para o cérebro, ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Ryan Hart e ao Sr. Arriz Lucas por seu inestimável feedback sobre esta comunicação. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NINDS R01 NS065052 e Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas de Vidro Superfrost Plus da Fisherbrand | Fisher Scientific | 22-034-979 | Usado para montagem de tecido (1.2.2) |
| Forno | Thermo Scientific | 51028112 | Usado para secagem de tecido (2.1.1) |
| Mini caneta de Papanicolau | Life Technologies | 00-8877 | Usado na etapa 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Usado para todas as lavagens durante a coloração (2.2), bem como a etapa Hoechst (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Usado para secar lâminas (2.2) |
| Caixa de coloração preta | Ted Pella | 21050 | Usado para bloquear e colorir etapas (2.2) |
| Soro de burro normal | Fisher Scientific | 50-413-253 | Usado para incubação de blocos e anticorpos (2.2) |
| Camundongo α-Pan-neuronal | Millipore MAB2300 | Usado para anticorpo primário (2.2.4) | |
| Coelho α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Usado para anticorpo primário (2.2.4) |
| Burro α-coelho 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Usado para anticorpo secundário (2.2.6) |
| Burro α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Usado para anticorpo secundário (2.2.6) |
| Folha de Caterer | Qualquer | N/A | Usado nas etapas 1.2.2 e 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Usado para aplicação de lamínulas (2.2.8) |
| Lamínulas | Fisher Scientific | 12544E | Usado para aplicação de lamínulas (2.2.8) |
| Esmalte para Unhas Transparente | Qualquer | N/A | Usado para lamínula (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 e LSM 710 (varredura a laser, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Usado para imagens (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Usado para imagens (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Para o protocolo DAB | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | Para o protocolo DAB |
| Kit DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Para o protocolo DAB |
| Laboratórios de vetor IgG de cavalo α-coelho biotinilado | BA-1100 | Para o protocolo DAB | |
| Laboratórios de vetor IgG de cavalo α-mouse biotinilado | BA-2001 | Para protocolo DAB | |
| 30% Peróxido de hidrogênio | FisherScientific | H325-500 | Para protocolo DAB |
| Wheaton slide racks e pratos de coloração | TedPella | 21043 | Para protocolo DAB |
| Bomba de perfusão Masterflex e tubulação | Cole-Parmer | Usado para perfusão (1.1.1 e 1.1.2) | |
| Composto científico de tecido Andwin CRYO-OCT (caso de 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Usado para congelamento de tecidos (1.2.1) |
| Termômetro (-50 a 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Usado para congelamento de tecidos (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Usado para seccionamento de tecido (1.2.2) |
| Prato de coloração, plástico com 2 tampas | Grale Scientific | 353 | Para retrival de antígeno |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | Para retrival de antígeno |
| Microondas | Qualquer | N / A | Para retrival de antígeno |
Referências
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
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Reimpressões e permissões
