Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo. Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita. Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.
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Artigo de método
Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling
Neste artigo
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Resumo
Resumo
A geração de linhagens celulares específicas do paciente representa uma ferramenta inestimável para pesquisa diagnóstica ou translacional, e essas células podem ser coletadas do tecido de biópsia de pele ou músculo disponível durante a investigação diagnóstica do paciente. Neste protocolo, descrevemos uma técnica para isolamento de células vivas de pequenas quantidades de tecido muscular ou cutâneo para cultura de células primárias. Além disso, fornecemos uma técnica para a imortalização de linhagens celulares miogênicas e linhagens celulares de fibroblastos a partir de células primárias. Uma vez que as linhagens celulares são imortalizadas, uma expansão substancial das células derivadas do paciente pode ser alcançada. As células imortalizadas são passíveis de muitas aplicações a jusante, incluindo triagem de drogas e correção in vitro da mutação genética. Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.
Introdução
O diagnóstico molecular evoluiu drasticamente nos últimos 20 anos. O DNA genômico agora é rotineiramente isolado do escarro ou do swab da bochecha, enquanto no passado exigia uma coleta de sangue. Com o atual tempo de resposta rápido e a facilidade de sequenciamento de genes, muitas mutações de doenças são rotineiramente identificadas sem a necessidade de testes adicionais. No caso do diagnóstico de doenças musculares, a identificação de dezenas de novos genes na última década responsáveis pela distrofia muscular ou miopatia mudou drasticamente a forma como essas doenças são diagnosticadas 1,2. Atualmente, existem dezenas de genes que foram identificado....
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Protocolo
NOTA: Os protocolos para a coleta do tecido humano deve ser analisado e aprovado pelo Comitê Institucional IRB. Coleção de descartado, tecido humano identificado-de ter sido aprovado pelo Hospital Infantil de Boston e Comitês IRB Hospital Brigham and Women. Os métodos descritos a seguir foram aplicadas para o isolamento de células miogénicas do de-identificados, tecido descartado. Os métodos descritos são aplicáveis ao tecido a partir de material coletado do paciente consentiu.
1. Isolamento celular
- A dissociação de biópsia do músculo e purificação de células miogénicas
- Pré-pesar uma placa de cultura de tecido de 10 ....
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Resultados
A Figura 1 ilustra alguns dos principais passos envolvidos na dissociação de tecido primário: a quantidade exacta de tecido é pesada num estéril de cultura de tecido de petri (Figura 1A, B). O tecido é então finamente picada usando bisturis estéreis, até que uma suspensão de tecido é obtida (figura 1C, D). Após a adição das enzimas de digestão, o tecido muscular primária dissociação é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. A progressão da digestã.......
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Discussão
Células como um recurso útil
O isolamento e cultura de populações de células miogênicas é extremamente útil quando estabelece fenótipos da doença ou em modelos in vitro de doença. O procedimento de isolamento de células miogénica descrito aqui permite o isolamento de fibroblastos a partir de mioblastos e amostras do músculo esquelético, o que pode, em seguida, ser propagadas, diferenciados, ou imediatamente analisadas. Estrutura e função de mioblastos pode ser avaliada atra.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta publicação é financiada pela Cure CMD, uma bolsa da Association Contre Les Myopathies (AFM) (projeto 16297) e pelos Institutos Nacionais de Saúde (números de concessão K08 AR059750, L40 AR057721 e 2R01NS047727).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento | |||
| Tecido capa de biossegurança cultural | Baker Company, Inc. | Centrífuga de bancada modelo SterilGuard Hood | |
| , como Beckman Model | Beckman Coulter | Modelo Allegra 6R | Se a classificação de células for realizada, uma centrífuga com refrigeração é preferida |
| Microscópio | Nikon | Modelo Eclipse TS100 | |
| Incubadora de cultura de tecidos, conectada a uma fonte de CO2 | Forma Scientific | Série II | |
| Classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| Reagentes para isolamento de mioblastos primários do tecido | |||
| Dispase II | Roche Applied Science | #04942078001 | Prepare uma solução de meia de 2.4U/ml em DMEM |
| Collagenase D | Roche Applied Science | #088882001 | Prepare uma solução de estoque de 10 mg/ml |
| 1x Sterile Hank' s Solução salina balanceada (HBSS), livre de cálcio e magnésio | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| Albumina de soro bovino, fração V | Sigma | #05470 | Prepare uma solução estéril de 1X HBSS 0,5% BSA para classificação FACS |
| Meio de crescimento estéril para mioblastos: Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM) com glicose alta (4,5 g) suplementado com 30% de soro bovino fetal | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | L-glutamina |
| RBC | Qiagen | 158904 | |
| Estoque de iodeto de propídio 10mg/ml | Sigma | P4170 | Prepare a solução estoque diluindo o pó em água destilada estéril |
| Anticorpo CD56 anti-humano para citometria de fluxo | Biolegend | 318310 | Anticorpo conjugado com APC, outros rótulos estão disponíveis |
| Reagentes para imortalização de mioblastos primários | |||
| Linha celular de embalagem ecotrópica PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| Linha celular de embalagem anfotrópica PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Gelatina de pele de porco | Sigma | G1890-500g | Prepare uma solução estoque de gelatina a 0,1% em água. Cubra o prato com a solução a 37&graus; C por uma hora. Retire a solução e adicione meio. |
| PolyJet | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | EMD Biosciences | 400051 | |
| plasmídeos pBabe contendo mCDK4 e hTERT | não disponíveis | Stadler et al, 2013 | |
| Kit midiprep de plasmídeos Qiagen | Qiagen | 12143 | |
| Médio 199 | Life Technologies | Médio 199 (31150022) | |
| Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | Mix 4:1 DMEM: 199 |
| Meio de crescimento mioblasto: 4:1 Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM) e Medium 199 suplementado com 15% de soro fetal bovino; Tampão HEPES de 0,02 M; 1,4 mg/L de vitamina B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L dexametasona, 2,5 μ g/L de fator de crescimento de hepatócitos e 10 μ g/L beta fator de crescimento de fibroblastos. | Tecnologias da vida (DMEM, F199); Atlanta Biológica (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (sulfato de zinco); Sigma (Vit.B12, Dexametasona); Chemicon International (HGF); Biopioneer (betaFGF) | # 15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876,#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). | Prepare o meio e a solução de estoque Vit. B12 (20mg / ml); Sulfato de Zinco (60µ g/ml); Dex (55µ g/µ l) separadamente para facilitar o uso. Solução estoque HGF (5µ g/ml) e FGF (20µ g/ml) deve ser adicionado de novo todas as semanas na concentração final de trabalho. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| Anticorpo de cadeia pesada de miosina para imunocoloração | Banco de hibridoma de desenvolvimento | MF20 | Clone MF20 |
| Desmin Anticorpo para imunocoloração | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clone D33 Soro |
| cavalo | Invitrogen | 26050-088 | |
| Reagentes para isolamento primário de fibroblastos da pele | |||
| Meio de transporte: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 0,2% de penicilina/estreptomicina | Meio RPMI 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| Meio de cultura de fibroblastos primários humanos: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina | Soro fetal bovino: Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| Solução de colagenase: Colagenase tipo 2 (100 mg) ressuspensa em 12,5 ml de meio de cultura de fibroblastos e esterilizado por filtro | Worthington | 4176 | |
| Estéril 1X Tampão de fosfato solução salina (PBS) livre de cálcio e magnésio | Lonza | 17-516F | |
| Materiais para isolamento de mioblastos primários | |||
| Tubos cônicos estéreis de 50 ml e 15 ml | GeneMate/Bioexpress | C-3394-4 (50 ml); C3394-1 (15 ml)) | |
| Bisturis estéreis | Aspen Surgical | 372610 | |
| Hemocitômetro | Hausser Scientific | 1492 | |
| Pipetas estéreis de 5, 10 e 25 ml Vidro | Bellco | 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml) | As pipetas reutilizáveis são lavadas, o algodão é tampado e autoclavado antes do uso |
| Pratos de plástico estéreis tratados com cultura de tecidos (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Filtros de células de nylon estéreis (100 µ m e 40 µ tamanho m) | BD Falcon | 352340 (40µ m); 352360 (100µ m) | |
| Materiais para imortalização | |||
| Estéril 0,45 µ m filtros | Millipore | SLHV013SL | |
| Anéis de clonagem | Corning | #3166-8 | Para ser limpo e autoclavado antes e depois do uso |
| Materiais para linhas celulares de fibroblastos | |||
| Pratos de plástico estéreis tratados com cultura de tecidos de 35 mm | Greiner bio-one | 628160 | |
| Bisturis estéreis | DeRoyal | D4510A | |
| Frascos estéreis para cultura de tecidos T25 | Techno Plastic Product, TPP | 90026 | vendido nos EUA pela MIDSCI |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
Referências
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
