Artigo de método

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

DOI:

10.3791/52307

⸱

18 de janeiro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

Neste artigo

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Resumo

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Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo. Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita. Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Resumo

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A geração de linhagens celulares específicas do paciente representa uma ferramenta inestimável para pesquisa diagnóstica ou translacional, e essas células podem ser coletadas do tecido de biópsia de pele ou músculo disponível durante a investigação diagnóstica do paciente. Neste protocolo, descrevemos uma técnica para isolamento de células vivas de pequenas quantidades de tecido muscular ou cutâneo para cultura de células primárias. Além disso, fornecemos uma técnica para a imortalização de linhagens celulares miogênicas e linhagens celulares de fibroblastos a partir de células primárias. Uma vez que as linhagens celulares são imortalizadas, uma expansão substancial das células derivadas do paciente pode ser alcançada. As células imortalizadas são passíveis de muitas aplicações a jusante, incluindo triagem de drogas e correção in vitro da mutação genética. Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Introdução

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O diagnóstico molecular evoluiu drasticamente nos últimos 20 anos. O DNA genômico agora é rotineiramente isolado do escarro ou do swab da bochecha, enquanto no passado exigia uma coleta de sangue. Com o atual tempo de resposta rápido e a facilidade de sequenciamento de genes, muitas mutações de doenças são rotineiramente identificadas sem a necessidade de testes adicionais. No caso do diagnóstico de doenças musculares, a identificação de dezenas de novos genes na última década responsáveis pela distrofia muscular ou miopatia mudou drasticamente a forma como essas doenças são diagnosticadas 1,2. Atualmente, existem dezenas de genes que foram identificados como causas de distrofia muscular e miopatia congênita, embora os mecanismos pelos quais muitos desses genes produzem doenças permaneçam obscuros. Em particular, as doenças raras constituem um desafio devido ao pequeno tamanho das populações de pacientes. Para esses casos, assim como para doenças mais comuns, a geração de ferramentas estáveis que facilitem estudos sobre o mecanismo de patogênese e rastreamento de drogas terapêuticas é altamente desejável.

Apesar do progresso dramático no diagnóstico de DNA, as biópsias musculares ainda são realizadas para estabelecer o diagnóstico primário em muitos pacientes nos quais há suspeita de doença metabólica ou muscular primária. Quando uma biópsia muscular é necessária, ela oferece a oportunidade de coleta adicional de tecidos diagnósticos e de pesquisa com risco mínimo de morbidade adicional para o paciente. Como há vários usos para cada amostra de tecido, é altamente desejável estabelecer técnicas para cultura de células primárias usando tecido cirúrgico que sejam diretas, eficientes e exijam quantidades mínimas de tecido. A triagem adequada de biópsias musculares ou de pele é necessária para maximizar o isolamento das células primárias do tecido e o armazenamento a longo prazo do material vivo. Além disso, a pesquisa com células-tronco e a triagem de medicamentos são uma grande promessa para o desenvolvimento de terapias para muitas doenças usando ensaios baseados em células 3,4.

Descrevemos aqui métodos para isolamento de células primárias de biópsias de músculo ou pele humana. Além disso, incluímos um protocolo para imortalização de células miogênicas, que é útil para gerar um grande número de células de um indivíduo. Essas células podem ser usadas para aplicações a jusante, como exames personalizados de medicamentos, que de outra forma seriam inatingíveis com o baixo número geral de células obtidas do tecido primário.

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Protocolo

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NOTA: Os protocolos para a coleta do tecido humano deve ser analisado e aprovado pelo Comitê Institucional IRB. Coleção de descartado, tecido humano identificado-de ter sido aprovado pelo Hospital Infantil de Boston e Comitês IRB Hospital Brigham and Women. Os métodos descritos a seguir foram aplicadas para o isolamento de células miogénicas do de-identificados, tecido descartado. Os métodos descritos são aplicáveis ​​ao tecido a partir de material coletado do paciente consentiu.

1. Isolamento celular

  1. A dissociação de biópsia do músculo e purificação de células miogénicas
    1. Pré-pesar uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros em uma biossegurança capa de cultura de tecidos, e, em seguida, re-pesar a placa contendo a biópsia muscular para calcular a quantidade de tecido a ser dissociados.
    2. Usando bisturis estéreis, tecido muscular pique finamente e adicione algumas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que o tecido seque.
    3. Adicionar 3,5 ml de cada dispase II e colagenase D por grama de tecido muscular a ser digerido. Pipeta o tecido picada e solução de enzima através de uma pipeta estéril 25 ml algumas vezes. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 15 minutos e digerir tecido até que a lama passa facilmente através de uma pipeta de 5 ml estéril.
      NOTA: dissociação Tissue é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. Por favor, consulte a secção 'Os resultados representativos "para obter detalhes adicionais.
    4. Adicionar 2 volumes de meio de cultura estéril de tecido dissociado, filtrar através de um filtro de 100 um sobre uma célula de células de 50 ml para tubos cónicos e pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm), a temperatura ambiente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia.
    5. Ressuspender o sedimento em 1 volume de meio de cultura estéril e adicionar 7 volumes de solução de lise de glóbulos vermelhos. Filtrar a solução através de um filtro de células 40 pm, então sedimentar tele células durante 10 minutos a 329 xg, à temperatura ambiente.
    6. Contar as células num hemocitómetro e ressuspender as células em HBSS 1x 0,5% de BSA numa concentração de 1 x 10 6 células / 100 ul. Separe ~ 250.000 células em um único tubo que vai ser utilizado como um controlo negativo (sem mancha). Definir uma só cor manchadas tubos de controle de lado adicionais de iodeto de propídio e para CD56, que são necessários para a correcta delimitação de células positivas CD56 por FACS classificação. Por favor, consulte a célula manuais seleção ou consultar com FACS triagem especialistas instalação central para assegurar os controlos adequados estão incluídos.
    7. Corar as células a serem classificados com 5 ul / 10 6 células do anticorpo anti CD56. Incubar todas as amostras (incluindo o controlo) em gelo durante 30 min.
    8. Lavar as amostras em 10 ml de HBSS e 1x células pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1.100 rpm) numa centrifugadora refrigerada, 4 ° C de temperatura.
    9. Adiciona-se iodeto de propídio a uma concentração final de 1 ug / ml para a amostra a ser sorted para a exclusão de células mortas. Purifica-se células positivas para CD56 a partir de células miogénicas não miogénicos usando o separador de células activadas por fluorescência.
  2. A dissociação de biópsia de pele
    NOTA: dérmica de fibroblastos podem ser isolados a partir de uma punção da pele de doentes biópsias musculares quando não estão disponíveis. Fibroblastos dérmicos podem ser usadas como biomaterial para diversos estudos, incluindo a transdução com MyoD para gerar células miogénicas. Além disso, os fibroblastos da derme pode ser usado para gerar células iPS, que podem ser diferenciadas em vários tipos de células para estudo posterior.
    1. Transportar a biópsia da pele para o laboratório em meio de transporte. Uma vez que a amostra é recebido, realizar a cultura primária tão rapidamente quanto possível. Se a cultura primária não podem ser estabelecidos no mesmo dia, armazenar a amostra à temperatura ambiente durante a noite.
    2. Transfira a biópsia da pele para um estéril 35 milímetros placa de Petri na capela de fluxo laminar.
    3. Lavar a biópsia da pele em uma placa de Petri estéril com 1x PBS para remover o sangue e detritos. Remover o tecido adiposo com um bisturi estéril.
    4. Adicionar 2 ml de solução de colagenase e mediu o tecido com bisturi, incubar a 37 ° C durante 45 min a 1 hora, dependendo do tamanho do tecido.
    5. Transferir o tecido digerido a um tubo de 15 ml, lavar a placa de Petri com 2 ml de meio de cultura de fibroblastos duas vezes, e recolher o meio no mesmo tubo.
    6. Sedimentar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    7. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 3 ml de meio de fibroblastos para remover a colagenase, em seguida, as células pellet novamente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia.
    8. Repita o passo 1.2.7 mais uma vez.
    9. Re-suspender o sedimento em 5 ml de células de fibroblastos e médias placa em um frasco de cultura de tecidos T25 estéril. Incubar o balão a 37 ° C com 5% de CO 2.
    10. Avaliar a cultura de fibroblastos para fixação e crescimento nos próximos 1-3 dias.
      NOTA: Alguns pequenos pedaços de tecido também pode anexar a placa e fibroblastos migram para fora desses pedaços de tecido.
    11. Manter a cultura sob as mesmas condições até que os fibroblastos são cultivadas a cerca de 80% de confluência.
    12. Recolhe fibroblastos por tripsinização e transferir para frascos de cultura frescas para a expansão adicional. Realizar tripsinização por lavagem das culturas 3 vezes em PBS 1x isento de Ca ++ e Mg ++. Adicionar tripsina-EDTA (ver Tabela de Materiais) para as células (frascos de 2 ml / T25), durante 2 min a 37 ° C.
    13. Dividir células destacadas em frascos adicionais. Se alguns pedaços de tecido permanecer solidários com os frascos T25 originais, adicionar 5 ml de meio de cultura fresco para este frasco e mais fibroblastos vão migrar para fora continuamente.
      NOTA: A cultura de fibroblastos expandidos podem ser congelados para baixo como P1 e armazenados em azoto líquido para futuras experiências.

2. Imortalidade de Células Miogênica

  1. de 5 milhões de células Placa ecotrópica de empacotamento Phoenix (PE) durante uma noite numa placa de cultura de tecido de 10 centímetros estéril em DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo.
  2. Células de alimentação 30 minutos antes da transfecção com 5 ml de meio fresco suplementado com 10 mM de cafeína.
  3. Homogeneizar uma mistura de 2 ug de DNA de plasmídeo a partir de uma preparação midi (hTERT CDK4 ou plasmídeo) e PolyJet e incubar à temperatura ambiente durante 15 min, tal como recomendado pelo fabricante.
  4. Adicione a mistura de plasmídeo / PolyJet às células PE durante a noite.
  5. Células de alimentação com meio fresco (DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo). Doze horas mais tarde, recolhe-se o sobrenadante contendo vírus, filtrando-a através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um.
  6. Use 1 ml de sobrenadante recolhido para infectar durante a noite a linha celular de empacotamento anfotrópico PA317 5 e obter uma linha de células produtoras de vírus, após selecção com estável ou 0,5 mg / mL de neomicina (G418) para CDK4 ou 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT.
  7. Prepare trabalhando sobrenadantes virais pelo crescimento das células de embalagem estáveis ​​para próximo da confluência, em seguida, a colheita do sobrenadante cada manhã, à noite e de manhã a três colheitas.
  8. Filtrar os sobrenadantes virais e utilizar quer directamente ou dividi-los em alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C para uso posterior. Note-se que o sobrenadante viral perde 50% de eficiência de infecção com cada congelamento-descongelamento. Lembre-se de branquear-lavagem antes de descartar tudo o que tem tocado as partículas virais.
    NOTA: A linha de células produtoras de vírus PA317 estáveis ​​pode ser congelada e mantida a -150 ° C para o armazenamento permanente (meio de congelação é de 10% de DMSO; 90% soro).
  9. Placa células miogénicas-purificado FACS (descrito nos passos 1,1-1,9) a uma densidade de 5 x 10 4 células / poço em placas de 6 poços revestidas com 0,1% de gelatina. Certifique-se de que as células estão ligados à placa antes de prosseguir com a infecção viral.
  10. Adicionar 400 ul filtrada, freshly produzido sobrenadante viral ou alíquotas congeladas a cada seis poços durante a noite (manter dois poços como controles).
  11. Mudar meio alimentando as células com 2,5 ml de poço de media / fresco muscular (4: 1 meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio 199 suplementado com 15% de soro fetal de bovino; 0,02 M de tampão HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l dexametasona, factor de crescimento de hepatócitos de 2,5 ug / L e factor de crescimento de fibroblastos básico / L 10? g). Descartar os meios de comunicação e pipetas contendo as partículas virais em um recipiente de água sanitária. Deixar as células no mesmo meio durante 3 dias para recuperar de infecção, em seguida, tratar por selecção usando 400 ug / ml de neomicina (infecção CDK4) ou 300 ug / ml de higromicina (infecção hTERT).
  12. Manter as células sob selecção de droga até as células da matriz de controlo prato (1-2 semanas).
  13. Células de passagem antes de se tornarem confluentes (60-80% de confluência, utilizando tripsina EDTA 0,05%), mesmo durante a selectino período. Células replate 10 centímetros em vários pratos com meio de mioblastos fresco (como descrito em 2.11) suplementadas com a droga seleção. Manter células imortalizadas seleccionados como uma população heterogénea ou clonar obter um fundo genético completamente homogénea (mesma inserção do transgene em todas as células).
  14. Realizar a selecção clonal utilizando os seguintes passos:
    1. Semear as células a uma densidade baixa (por exemplo, 300 a 500 células em placas de 10 cm) e mantê-los durante cerca de duas semanas, até que colónias pequenas são formadas células (10-20).
    2. Remover a maior parte do meio, neste ponto, deixando apenas uma película fina para evitar que as células de secar.
    3. Coloque um anel de clonagem (com uma extremidade mergulhada em silicone graxa de vácuo) ao longo de cada clone desejado e adicione algumas gotas de tripsina / EDTA.
    4. Células colheita, uma vez que se tornam arredondadas com cuidado aspirar as células utilizando uma ponta de 1 ml ou uma pipeta de Pasteur e transferi-las para o menor pla multipoço disponívelte (96 ou 48, 24 ou placas de 12 poços).
    5. Expandir clones conforme necessário para evitar confluência local.

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Resultados

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A Figura 1 ilustra alguns dos principais passos envolvidos na dissociação de tecido primário: a quantidade exacta de tecido é pesada num estéril de cultura de tecido de petri (Figura 1A, B). O tecido é então finamente picada usando bisturis estéreis, até que uma suspensão de tecido é obtida (figura 1C, D). Após a adição das enzimas de digestão, o tecido muscular primária dissociação é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. A progressão da digestã...

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Discussão

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Células como um recurso útil

O isolamento e cultura de populações de células miogênicas é extremamente útil quando estabelece fenótipos da doença ou em modelos in vitro de doença. O procedimento de isolamento de células miogénica descrito aqui permite o isolamento de fibroblastos a partir de mioblastos e amostras do músculo esquelético, o que pode, em seguida, ser propagadas, diferenciados, ou imediatamente analisadas. Estrutura e função de mioblastos pode ser avaliada atra...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Esta publicação é financiada pela Cure CMD, uma bolsa da Association Contre Les Myopathies (AFM) (projeto 16297) e pelos Institutos Nacionais de Saúde (números de concessão K08 AR059750, L40 AR057721 e 2R01NS047727).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Tecido  capa de biossegurança culturalBaker Company, Inc.Centrífuga de bancada modelo SterilGuard Hood
, como Beckman Model Beckman CoulterModelo Allegra 6RSe a classificação de células for realizada, uma centrífuga com refrigeração é preferida
MicroscópioNikonModelo Eclipse TS100
Incubadora de cultura de tecidos, conectada a uma fonte de CO2Forma Scientific Série II
Classificador de células ativadas por fluorescência (FACS)Becton DickinsonModel Aria
Reagentes para isolamento de mioblastos primários do tecido
Dispase IIRoche Applied Science#04942078001Prepare uma solução de meia de 2.4U/ml em DMEM
Collagenase D Roche Applied Science#088882001Prepare uma solução de estoque de 10 mg/ml
1x Sterile Hank' s Solução salina balanceada (HBSS), livre de cálcio e magnésioGIBCO Life Technologies#14185-052
Albumina de soro bovino, fração VSigma#05470Prepare uma solução estéril de 1X HBSS 0,5% BSA para classificação FACS
Meio de crescimento estéril para mioblastos: Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM) com glicose alta (4,5 g) suplementado com 30% de soro bovino fetalGIBCO Life Technologies11965-092L-glutamina
RBCQiagen158904
Estoque de iodeto de propídio 10mg/mlSigmaP4170Prepare a solução estoque diluindo o pó em água destilada estéril
Anticorpo CD56 anti-humano para citometria de fluxoBiolegend318310Anticorpo conjugado com APC, outros rótulos estão disponíveis
Reagentes para imortalização de mioblastos primários
Linha celular de embalagem ecotrópica PECell BiolabsRV-101
Linha celular de embalagem anfotrópica PA3174Cell BiolabsRV-102
Gelatina de pele de porcoSigmaG1890-500gPrepare uma solução estoque de gelatina a 0,1% em água. Cubra o prato com a solução a 37&graus; C por uma hora. Retire a solução e adicione meio.
PolyJet SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
plasmídeos pBabe contendo mCDK4 e hTERTnão disponíveisStadler et al, 2013
Kit midiprep de plasmídeos QiagenQiagen12143
Médio 199Life Technologies Médio 199 (31150022)
Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)Mix 4:1 DMEM: 199
Meio de crescimento mioblasto: 4:1 Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM) e Medium 199 suplementado com 15% de soro fetal bovino; Tampão HEPES de 0,02 M; 1,4 mg/L de vitamina B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L dexametasona, 2,5 μ g/L de fator de crescimento de hepatócitos e 10 μ g/L beta fator de crescimento de fibroblastos.Tecnologias da vida (DMEM, F199); Atlanta Biológica (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (sulfato de zinco); Sigma (Vit.B12, Dexametasona); Chemicon International (HGF); Biopioneer (betaFGF) # 15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876,#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). Prepare o meio e a solução de estoque Vit. B12 (20mg / ml); Sulfato de Zinco (60µ g/ml); Dex (55µ g/µ l) separadamente para facilitar o uso. Solução estoque HGF (5µ g/ml) e FGF (20µ g/ml) deve ser adicionado de novo todas as semanas na concentração final de trabalho.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Anticorpo de cadeia pesada de miosina para imunocoloraçãoBanco de hibridoma de desenvolvimentoMF20Clone MF20
Desmin Anticorpo para imunocoloraçãoThermo ScientificMS-376-S0Clone D33 Soro
cavaloInvitrogen26050-088
Reagentes para isolamento primário de fibroblastos da pele
Meio de transporte: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 0,2% de penicilina/estreptomicinaMeio RPMI 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
Meio de cultura de fibroblastos primários humanos: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicinaSoro fetal bovino: Thermo ScientificSH30071.03
Solução de colagenase: Colagenase tipo 2 (100 mg) ressuspensa em 12,5 ml de meio de cultura de fibroblastos e esterilizado por filtroWorthington4176
Estéril 1X Tampão de fosfato solução salina (PBS) livre de cálcio e magnésioLonza17-516F
Materiais para isolamento de mioblastos primários
Tubos cônicos estéreis de 50 ml e 15 mlGeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 ml); C3394-1 (15 ml))
Bisturis estéreisAspen Surgical372610
HemocitômetroHausser Scientific1492
Pipetas estéreis de 5, 10 e 25 ml VidroBellco1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)As pipetas reutilizáveis são lavadas, o algodão é tampado e autoclavado antes do uso
Pratos de plástico estéreis tratados com cultura de tecidos (10 cm)BD Falcon353003
Filtros de células de nylon estéreis (100 µ m e 40 µ tamanho m)BD Falcon352340 (40µ m); 352360 (100µ m)
  Materiais para imortalização
Estéril 0,45 µ m filtrosMilliporeSLHV013SL
Anéis de clonagemCorning#3166-8Para ser limpo e autoclavado antes e depois do uso
Materiais para linhas celulares de fibroblastos 
Pratos de plástico estéreis tratados com cultura de tecidos de 35 mmGreiner bio-one628160
Bisturis estéreisDeRoyalD4510A
Frascos estéreis para cultura de tecidos T25Techno Plastic Product, TPP90026vendido nos EUA pela MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Contém solução de lise de comercialmente de de mioblastos

Referências

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Errata

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Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

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Stacy C. Cossette

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Stacy A. Cossette

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