El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

Protocol

NOTA: Los protocolos para la recolección de tejido humano deben ser revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional IRB. Colección de descartados, el tejido humano de-identificado ha sido aprobado por los Comités IRB Hospital Brigham y Hospital de la Mujer y la Infancia de Boston. Los métodos descritos a continuación se han aplicado para el aislamiento de células miogénicas de desidentificados, descartado tejido. Los métodos descritos son aplicables a tejido recogido a partir de material paciente consentido.

Aislamiento 1. celular

1. La disociación de la biopsia muscular y la purificación de células miogénicas
   1. Pre-pesar una placa de cultivo tisular de 10 cm en una campana de bioseguridad de cultivo de tejidos, y luego volver a pesar el plato que contiene la biopsia muscular para calcular la cantidad de tejido que se ha disociado.
   2. Utilizando escalpelos estériles, tejido muscular mince finamente y añadir unas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que el tejido se seque.
   3. Añadir 3,5 ml cada una de dispase II y colagenasa D por gramo de tejido muscular para ser digeridos. Pipetear la solución de enzima de tejidos y picada a través de una pipeta de 25 ml estéril unas cuantas veces. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C con 5% de _CO2 durante 15 min y digerir el tejido hasta que la suspensión pasa fácilmente a través de una pipeta estéril ml 5.
      NOTA: la disociación del tejido se consigue normalmente por digestión enzimática dentro de 45 a 90 min. Por favor, consulte la sección "Los resultados representativos 'para obtener más detalles.
   4. Añadir 2 volúmenes de medio de crecimiento estéril al tejido disociado, filtro a través de un filtro de 100 micras celular más de un 50 ml de pellets de células tubulares y cónicos durante 10 min a 329 xg (~ 1100 rpm), la temperatura ambiente. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación.
   5. Resuspender el precipitado en 1 volumen de medio de crecimiento estéril y añadir 7 volúmenes de solución de lisis de glóbulos rojos. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 40 micras, entonces sedimentar tél las células durante 10 min a 329 xg, a temperatura ambiente.
   6. Contar las células en un hemocitómetro y resuspender las células en 1x HBSS 0,5% de BSA a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / 100 mL. Aparte ~ 250.000 células en un único tubo que se utilizarán como control negativo (sin teñir). Conjunto de tubos de lado adicionales de un solo color manchados de control para yoduro de propidio y para CD56, que son necesarios para la selección adecuada de las células CD56 positivas por FACS clasificación. Por favor refiérase a los teléfonos manuales de clasificación o consultar con clasificación FACS expertos instalaciones fundamental de asegurar controles adecuados se incluyen.
   7. Teñir las células para ser ordenados con 5μl / 10 ⁶ células de anticuerpo anti CD56. Incubar todas las muestras (incluyendo los controles) en hielo durante 30 min.
   8. Lávese las muestras en 10 ml 1x HBSS y células de pellets durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm) en una centrífuga refrigerada, 4 ° C de temperatura.
   9. Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1μg / ml de la muestra a ser sorted para la exclusión de las células muertas. Purificar células positivas CD56 a partir de células miogénicas no miogénicas utilizando el clasificador de células activadas por fluorescencia.
2. La disociación de biopsia de piel
   NOTA: Dérmica fibroblastos se pueden aislar de un punzón de piel de pacientes cuando las biopsias musculares no están disponibles. Fibroblastos dérmicos se pueden utilizar como biomaterial para muchos estudios, incluyendo la transducción con MyoD para generar células miogénicas. Además, los fibroblastos dérmicos se pueden utilizar para generar células iPS, que pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el estudio adicional.
   1. Transporte la biopsia de piel para el laboratorio en un medio de transporte. Una vez que se recibe la muestra, realice el cultivo primario tan pronto como sea posible. Si el cultivo primario no se puede establecer en el mismo día, almacenar la muestra a temperatura ambiente durante la noche.
   2. Transferir la biopsia de piel para un 35 mm placa de Petri estéril en la campana de flujo laminar.
   3. Enjuague la biopsia de la piel en una placa de Petri estéril con 1x PBS para eliminar la sangre y los residuos. Retire el tejido adiposo con un bisturí estéril.
   4. Añadir solución de colagenasa 2 ml y picar el tejido con el escalpelo, se incuba a 37 ° C durante 45 min a 1 hr, dependiendo del tamaño del tejido.
   5. Transferir el tejido digerido a un tubo cónico de 15 ml, lavar la placa de Petri con 2 ml de medio de cultivo de fibroblastos dos veces, y recoger el medio en el mismo tubo.
   6. Sedimentar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   7. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 3 ml de medio de fibroblastos para eliminar la colagenasa, a continuación, las células de pellets de nuevo. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación.
   8. Repita el paso 1.2.7 una vez más.
   9. Vuelva a suspender el sedimento en las células de fibroblastos y medianas placa 5 ml en un matraz de cultivo de tejido T25 estéril. Incubar el matraz a 37 ° C con 5% de CO _2.
   10. Evaluar la cultura de unión de los fibroblastos y el crecimiento en los próximos 1-3 días. <br /> Nota: Algunas piezas de tejido pequeños también podrán unir a la placa y los fibroblastos migran fuera de estas piezas de tejido.
   11. Mantener el cultivo bajo las mismas condiciones hasta que los fibroblastos se cultivan a aproximadamente 80% de confluencia.
   12. Recoge los fibroblastos por tripsinización y transferir a frascos de cultivo frescos para la expansión adicional. Realizar tripsinización por lavado de las culturas 3 veces en 1x PBS libre de Ca ⁺⁺ y Mg ^++. Añadir Tripsina-EDTA (ver Materiales Tabla) a las células (2 ml del matraz / T25) durante 2 min a 37 ° C.
   13. Dividir células desprendidas en frascos adicionales. Si algunas piezas de tejido de permanecer unidos a los matraces T25 originales, añadir 5 ml de medio de cultivo fresco a este frasco y más fibroblastos migran a cabo continuamente.
       NOTA: El cultivo de fibroblastos expandido se puede congelar abajo como P1 y se almacena en nitrógeno líquido para futuros experimentos.

2. La inmortalización de células miogénicas

1. Células de alimentación 30 min antes de la transfección con 5 ml de medio fresco suplementado con 10 mM de cafeína.
2. Homogeneizar una mezcla de 2 g de ADN plasmídico a partir de una preparación midi (CDK4 o hTERT plásmido) y polyjet e incubar a temperatura ambiente durante 15 min, según lo recomendado por el fabricante.
3. Añadir la mezcla de plásmido / polyjet a las células PE durante la noche.
4. Células de alimentación con medio fresco (DMEM y medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%). Doce horas más tarde, recoger el sobrenadante que contiene el virus y filtrar a través de un filtro de tamaño de poro 0,45 micras.
5. Usar 1 ml de sobrenadante recogido durante la noche para infectar la línea celular de empaquetamiento PA317 anfotrópicas ⁵ y obtener una línea celular productora de virus estables después de la selección, ya sea con 0.5 mg / ml de neomicina (G418) para CDK4 o 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT.
6. Preparar trabajo sobrenadantes virales por el crecimiento de las células de empaquetamiento estables hasta casi confluencia, luego, la cosecha el sobrenadante cada mañana, la tarde y la mañana para tres cosechas.
7. Filtra los sobrenadantes virales y, o bien utilizar directamente o dividirlos en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C para su uso posterior. Tenga en cuenta que sobrenadante viral pierde 50% de eficiencia de la infección con cada uno de congelación-descongelación. Recuerde que debe blanquear lavado antes de desechar todo lo que ha tocado las partículas virales.
   NOTA: La línea celular PA317 productoras de virus estable puede ser congelado y se mantiene a -150 ° C para el almacenamiento permanente (medio de congelación es del 10% DMSO; 90% de suero).
8. Plate FACS purificado células miogénicas (descrito en los pasos 1.1 a 1.9) a una densidad de 5 x 10 ⁴ células / pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1%. Asegúrese de que las células se unen a la placa antes de proceder con la infección viral.
9. Añadir 400 l filtrada, freshly producido sobrenadante viral o alícuotas congeladas a cada placa de seis pocillos durante la noche (mantener 2 pozos como controles).
10. Cambio de medio por la alimentación de las células con 2,5 ml / pocillo de medio fresco muscular (4: 1 medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio 199 suplementado con suero bovino fetal al 15%; 0,02 M tampón HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexametasona, factor de crecimiento de hepatocitos / l 2,5 g y / L el factor de crecimiento de fibroblastos básico 10 g). Deseche los medios de comunicación y pipetas que contienen las partículas virales en un contenedor de lejía. Deja células en el mismo medio durante 3 días para recuperarse de la infección, entonces tratan de selección utilizando 400 mg / ml de neomicina (infección CDK4) o 300 mg / ml de higromicina (infección hTERT).
11. Mantener células en la selección de medicamentos hasta que las células en la matriz placa control (1-2 semanas).
12. Células de paso antes de que se hacen confluentes (60-80% de confluencia, utilizando 0,05% de tripsina EDTA), incluso durante la SELECTIel período. Células Replate en múltiples 10cm platos con medio fresco de mioblastos (como se describe en 2.11), complementado con la droga selección. Mantener células seleccionadas inmortalizadas como una población heterogénea o clonar para obtener un fondo genético completamente homogénea (el mismo de inserción del transgén en cada célula).
13. Realice la selección clonal utilizando los siguientes pasos:
    1. Sembrar las células a baja densidad (por ejemplo, de 300 a 500 células en placas de 10 cm) y mantenerlas durante aproximadamente dos semanas, hasta pequeñas colonias se forman células (10-20).
    2. Eliminar la mayor parte del medio en este punto, dejando sólo una película fina para evitar que las células se sequen.
    3. Coloque un anillo de clonación (con un extremo sumergido en grasa de vacío de silicona) sobre cada clon deseado y añadir unas gotas de tripsina / EDTA.
    4. Las células de la cosecha una vez que se redondean aspirando cuidadosamente las células utilizando una punta de 1 ml o una pipeta Pasteur y su transferencia a la más pequeña pla multiwell disponiblete (96 o 48, 24 o 12 pocillos).
    5. Expandir clones según sea necesario para evitar la confluencia local.

Representative Results

La Figura 1 ilustra algunos de los pasos clave que participan en la disociación tejido primario: la cantidad exacta de tejido se pesa en una placa de cultivo tisular de Petri estéril (Figura 1A, B). El tejido se pica finamente utilizando escalpelos estériles, hasta que se obtuvo una suspensión de tejido (Figura 1C, D). Después de la adición de las enzimas de digestión, músculo primario de disociación del tejido se consigue normalmente mediante digestión enzimática dentro de 45-90 min. La progresión de la digestión del tejido se monitoriza típicamente cada 15-20 min para evitar overdigestion y la muerte celular. La digestión enzimática puede ser delicadamente con una pipeta y se mezcla un par de veces cada 15 a 20 min. Al final de la etapa de digestión, las células se filtran a través de un 100 micras (Figura 1E, F) y luego un filtro de 40 micras. Dependiendo de la cantidad de iniciar el tejido muscular y si la muestra se obtiene a partir leve o grave músculo afectado, el cel primaria disociadals será heterogénea. La figura 1G muestra un ejemplo de células mononucleares en suspensión inmediatamente después de la digestión, mientras que la Figura 1H muestra un ejemplo de células primarias disociadas 3-6 hr después de la digestión y enchapado en placas de cultivo de tejidos. Células miogénicas normalmente se mezclará con fibroblastos y células adipogénicas. Las células inmunes también pueden estar presentes en los casos en que la inflamación está asociada con la enfermedad del paciente. Por lo tanto, prospectivo separación de los diferentes tipos de células podría ser deseable. Para prospectivo aislamiento de células miogénicas humanos, CD56 o N-CAM ha sido ampliamente utilizado como un marcador fiable ^6-9. Esta purificación puede ser beneficioso poco después de aislamiento para el enriquecimiento de células progenitoras miogénicas y antes del proceso de inmortalización celular. Alternativamente, la inmortalización de las células primarias se puede realizar en primer lugar, células miogénicas a continuación inmortalizadas pueden ser seleccionados en base a la expresión de CD56 por FACS. A sobre esquemáticalos pasos requeridos antes de la FACS clasificación y un ejemplo de un perfil de FACS se ilustra en la Figura 2. Brevemente, las células primarias se cuentan y se resuspenden a alta concentración como se indica, a continuación, se añade el anticuerpo primario (es decir, CD56 anti) a las células y se incubó durante 30 minutos en hielo. Después de un lavado, las células se analizaron a través de un clasificador de células activadas por fluorescencia y se purificaron (Figura 2) .El rendimiento aproximado de las células CD56 positivas varía de muestra a muestra, que van desde 40-70% del total de células mononucleares. El rendimiento varía dependiendo de la edad del individuo y de si las células miogénicas se extraen a partir de músculo afectado o enfermo. Muscular No se ve afectado por lo general tiene alto porcentaje de células miogénicas, mientras que el músculo distrófico tiene a menudo menores porcentajes de células CD56 positivas. Las células purificadas se colocaron en placas en medio completo de crecimiento miogénico (ver Materiales Tabla). Las células pueden ser pasados ​​por tripsinización cuando REACh 60-70% de confluencia. Células CD56 que expresan son miogénico y capaz de formar miotubos in vitro ^10,11 .La inmortalización de células miogénicas requiere la transfección secuencial de dos genes ^12,13 (como se esquematiza en la Figura 3). Quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) se utiliza para superar el estrés de cultivo de tejidos debido a las condiciones de cultivo inadecuadas, y la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) impide acortamiento de los telómeros debido al fenómeno de replicación terminal ^12. Ambos plásmidos pre-virales están en el esqueleto del vector pBabe. El constructo de ADNc de CDK4 de ratón contiene el gen de resistencia a neomicina y el ADNc de hTERT constructo contiene el gen de resistencia a higromicina. Este último también contiene un Herpes Simplex Virus de la timidina quinasa (TK) cassette y sitios loxP colocados en ambos extremos de la casete de hTERT / TK. Esto permite la escisión de la totalidad de la unidad de expresión por la recombinasa Cre ¹⁴ y contra-selección usando ganciclovir.

Recientemente células inmortalizadas se pueden mantener como una población en la que los virus se integran en diferentes sitios, o clonados, para obtener un fondo totalmente homogéneo genética (sola inserción en el genoma de la célula y su progenie). En la mayoría de los casos, el aislamiento de clones de una población principal será resultados en ligeras diferencias entre clones en función de la inserción del casete en el genoma de la célula. Además, el cultivo extensivo de tejido favorecerá la selección de células con ventaja de crecimiento en lugar de los que diferencian. YOsolation de clones individuales se hace simplemente mediante la siembra de células a baja densidad (por ejemplo: de 300 a 500 células en platos de 10 cm) y cultivando durante aproximadamente dos semanas hasta que se forman colonias pequeñas (10-20 células). La mayor parte del medio se retira entonces, dejando sólo una capa delgada para evitar que las células se sequen. Los clones se tripsinizaron usando anillos de clonación y luego expandido según sea necesario. Clones inmortalizados expandidas pueden ser probados para la expresión de marcadores de células miogénicas comunes, tales como CD56 por FACS, desmina y la expresión de MyoD por inmunofluorescencia, o myotube formación de la diferenciación. Myotubes son más evidentes cuando las células miogénicas confluentes (90% de confluencia) se colocan en medio de diferenciación (DMEM y medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con 2% de suero de caballo) después de 3-5 días (Figura 4). No se observaron diferencias en myotube formación y en la capacidad de contracción myotube entre las células de control no inmortalizadas y células inmortalizadas (Videos 1 y 2).

(Figura 5). Ejemplos de curvas de crecimiento se muestran en la Figura 5A, donde se observó el acortamiento de los telómeros como las células se expandieron para número prolongado de pasajes. Por el contrario, la inmortalización éxito se asocia con aumento de la actividad de la telomerasa (Figura 5)

Figura 1:.. Ilustraciones de pasos críticos para la disociación de tejido muscular humano primario (A) Pesaje de la placa de cultivo de vacío, antes de la colocación del tejido y (B) después de la colocación del tejido (C) escalpelos estériles se utilizan para picar el tejido, hasta que (D) el tejido queauto se reduce a una suspensión. Se añaden colagenasa y dispasa y el tejido se digirió durante 45-90 min, a continuación, la digestión se filtró a través de un filtro de malla de nylon para descartar los desechos (E, F). (G, H) ejemplos de células recién disociadas chapadas inmediatamente después de la disociación (G ) o 3 horas después de la disociación, cuando las células primarias comienzan a asentarse (H).

Figura 2:. Flujo de trabajo de los procedimientos involucrados en la tinción de mioblastos humanos antes de la purificación a través de fluorescencia clasificador de células activadas Se destacan los pasos críticos para la tinción de las células humanas antes del análisis FACS. También se muestran ejemplos de parcelas FACS. El control negativo (panel izquierdo) se utiliza para establecer la puerta de clasificación. En los paneles de la derecha, las células que expresan CD56 positivas son una verja y la Percentage de células positivas se muestra. Esta estrategia se puede utilizar para purificar células miogénicas, ya sea antes o después de la inmortalización procedimiento de inmortalización.

Figura 3: Esquema de la producción de virus para la inmortalización de mioblastos. Flujo de trabajo de la producción de retrovirus utiliza para inmortalizar mioblastos. Una construcción de plásmido que contenía CDK4 o el casete hTERT-TK floxed en una columna vertebral pBabe (izquierda) se transfecta en la ecotrópico Phoenix (PE) de la línea celular de empaquetamiento durante la noche (08.12 horas) con polyjet. El sobrenadante se transfiere a continuación, después de la filtración sobre la línea celular de empaquetamiento anfotrópica Phoenix (PA317). El sobrenadante de estas células puede ser utilizado ya sea directa o las células se puede seleccionar ya sea con neomicina o higromicina para generar una línea celular estable para uso futuro. Las alícuotas del filtEred sobrenadante se puede almacenar a -80 ° C para su uso posterior (con una pérdida de efectividad de 50%). Bleach se utiliza para limpiar cada consumible utilizado en todos los puntos del procedimiento.

Figura 4:. Esquema de inmortalización de mioblastos reversible del flujo de trabajo del procedimiento de inmortalización (arriba): Las células primarias son primero transfectadas con CDK4. Después de la selección de neomicina, los mioblastos se transfectan con un casete de hTERT floxed que contiene dos marcadores de selección; HSV-TK y Higromicina. Si se desea en un momento posterior, el casete de hTERT puede ser "floxed" a cabo mediante la expresión de Cre recombinasa y seleccionando para la escisión con ganciclovir. Esto permite que el "re-mortalization" de los mioblastos y el reinicio de acortamiento de los telómeros. Si los telómeros son 20 kb de largo, esto todavía permite cientos de duplicaciones, y evita t complicación de que la sobre-expresión de hTERT. Finalmente, los clones isogénicas de la población inmortalizado pueden ser aislados. El miogenicidad de las células recién inmortalizadas se puede demostrar usando marcadores específicos de las células musculares tales como desmina (panel inferior izquierda, las células en medio de crecimiento teñidas con anti-desmina, D33 clon, verde). Este clon es tan miogénico que las células diferenciadas se ven incluso si se mantienen las células en condiciones de proliferación. Cuando las células se diferencian en medio de diferenciación (con suero de caballo al 2%, medio y paneles de la derecha) myotube formación llega a ser muy extensa. Casi todas las células teñidas con el anticuerpo MF20 a cadena embrionario miosina pesada (verde) y miotubos tienen múltiples núcleos por DAPI (azul, todas las imágenes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Verificación del procedimiento de inmortalización. (A) Curvas de crecimiento de clones isogénicos de mioblastos primarios, la población inmortal (mioblastos hTERT-CDK4) y el clon re-mortalized (mioblastos floxed hTERT-CDK4) se muestran como ejemplos. No hay diferencias en las tasas de crecimiento fueron detectables antes de que las células alcanzan la senescencia. Acortamiento de los telómeros se controló en función de duplicaciones de la población y la longitud del telómero se midió por TRF. (B) mioblastos TRF mostrado son ejemplos de puntos de tiempo y replicación tardía en mioblastos (5 puntos de tiempo de PD 13-75), re-mortalized después escisión hTERT (3 puntos de tiempo de PD 62-152) y mioblastos inmortalizados (PD 75 y 200). (C), la infección exitosa hTERT se traduce en un aumento de la actividad de la telomerasa. La actividad telomerasa se ​​evaluó mediante ddTRAP (ddTRAP lectura, a la derecha; cuantificación del ensayo, izquierda) ¹⁵ en las células antes y después de HTEInfección RT. escisión hTERT abolió la actividad de la telomerasa al umbral original, visto en mioblastos. Los resultados se muestran como productos totales telomerasa generados por equivalente de células (corrección de fondo). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Haga clic aquí para ver el vídeo.
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Videos 1 y 2. Myotubes se generaron a partir de células antes y después del proceso de inmortalización. Las células se cultivaron hasta la confluencia en medio de crecimiento y cambiaron a medio de diferenciación durante 10 días. En ambos vídeos, contracciones funcionales de uno o más miotubos son detectables. Grabación de la contracción espontánease hizo utilizando una lente de 20X. No se observaron diferencias entre las células inmortalizadas y no inmortalizadas.

Discussion

Las células como un recurso útil

El aislamiento y el cultivo de poblaciones de células miogénicas es extremadamente útil cuando se establece fenotipos de la enfermedad o en modelos in vitro de la enfermedad. El procedimiento de aislamiento de células myogenic aquí descrito permite el aislamiento de los mioblastos y fibroblastos a partir de muestras de músculo esquelético, que luego pueden ser propagados, diferenciada, o inmediatamente analizadas. La estructura y función de mioblastos se pueden evaluar a través de un examen microscópico, la evaluación de la supervivencia celular, la evaluación de la fusión celular, o a través de estudios moleculares de ARN o la expresión de proteínas. Además, los mioblastos pueden diferenciarse en miotubos que comparten muchas características de miofibras inmaduras, lo que permite la evaluación directa de la función de mioblastos en el contexto del desarrollo muscular y la recuperación después de daño tisular. Mientras que todos estos fenotipos tienden a ser bastante reproducible en los primeros pasajes de células miogénicas, el comportamiento de muchos m primarialíneas celulares yogenic pueden ser alterados en el curso de muchos pasajes. Como resultado, a veces es deseable para inmortalizar una línea celular miogénica dado (tal como se describe aquí), que puede facilitar la facilidad de establecimiento de cultivo y la generación de resultados reproducibles durante un período de tiempo más largo.

Selección de poblaciones específicas de células

Este protocolo describe el aislamiento de células miogénicas de tejido de músculo esquelético utilizando FACS como un esquema de purificación. La estrategia propuesta de seleccionar células incluye el uso de yoduro de propidio (un indicador de las células muertas) y CD56 (un marcador de células miogénicas), para diferenciar células miogénicas en vivo de las células muertas, desechos y células no miogénicas. Las células contenidas en la población CD56 positivo incluirán progenitores miogénicos capaces de miotubos forman, mientras que la población-CD56 negativa incluirá células no miogénicos incluyendo fibroblastos y células posiblemente adipogénicos. Cada una de estas fracciones puedeser independientemente cultivan para producir cultivos celulares de mioblastos o fibroblastos, y el potencial para establecer cultivos de células de fibroblastos en paralelo puede ser útil para ejercicios de células o de banco de ADN independientes o condiciones de control adicional para ensayos que se realizan en los cultivos de células miogénicas. Hay varias otras opciones para la selección de los cultivos de células de fibroblasto myoblastic y específicos de tejido muscular digerido, en los casos en que la separación FACS no es deseable o no está disponible, que se describen en otras partes ^16,17. Un método alternativo para separar las células fibroblásticas y myoblastic implica el uso de propiedades de adherencia diferenciales entre estos dos tipos de células para enriquecer pasajes sucesivos de células para un tipo de célula dada. Como los fibroblastos se adhieren al plástico mucho más fácilmente que los mioblastos, permitiendo que las suspensiones de células a incubar en plástico durante aproximadamente 1 hr cuando se establezcan o pasar las células y luego chapado el sobrenadante en un plato diferente se resUlt en la eliminación de muchos fibroblastos de la suspensión celular ^18.

Utilidad de los fibroblastos vs. mioblastos

Las biopsias musculares de pacientes se usan típicamente para la purificación de las células musculares primarias, sin embargo mioblastos enfermos no pueden proliferar de manera efectiva y sólo pueden someterse a un escaso número de divisiones en vitro, requiriendo así la inmortalización celular para alcanzar el alto número de divisiones necesarias. Dado que tanto los fibroblastos y mioblastos se pueden aislar a partir de biopsias musculares, ambas fracciones celulares se deben guardar a partir de muestras de pacientes, ya que pueden tanto ser útiles y ofrecer mucho versatilidad para aplicaciones posteriores. Por ejemplo, los fibroblastos pueden ser utilizados para la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que contienen una gran promesa para generar el número de células ilimitadas y el potencial de ser inducidas a diferenciarse en múltiples linajes celulares. Estas características son muy deseables para las células obtenidas de un pacientes con enfermedades raras, que potencialmente pueden ser corregidos in vitro o utilizados en pruebas de detección de drogas experimentales en busca de compuestos terapéuticos. Mioblastos inmortalizados también se pueden utilizar en el cribado basado en fármacos. Los fibroblastos también se pueden convertir eficazmente a un destino miogénico por la infección con un virus que expresa MyoD ^19-21. Este método ha sido probado con eficacia utilizando fibroblastos extraídos de pacientes con enfermedades musculares y confirmó que los fibroblastos que expresan MyoD pueden formar eficazmente miotubos que expresan proteínas musculares maduras. Por lo tanto, ambos tipos de células pueden utilizarse eficazmente en varias aplicaciones aguas abajo y proporcionan material de inestimable para estudios de diagnóstico y terapéuticos.

Impacto de la inmortalización

La inmortalización de las células diploides normales le permite a uno preparar una línea celular humana estable que puede ser totalmente caracterizado y estudiado por muchos laboratorios diferentes. Los cultivos primarios de independienteaislamientos pueden variar y su capacidad general proliferativa pueden ser variables cuando se introduce daño en el proceso de disociación o por overdigestion, que pueden distorsionar el comportamiento de cultivo. La inmortalización de células por medio de la expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT) tiene la ventaja de mantener un fenotipo celular estable y células permanecen diploides. Ha habido informes en ratones que la telomerasa puede modular la vía Wnt ^22. No hemos observado este fenómeno en las células humanas. Sin embargo, para evitar tal complicación potencial, el casete de hTERT se ha flanqueado con sitios lox, de manera que se puede quitar después de los telómeros se han alargado. Telómeros largos confieren cientos de divisiones adicionales, suele ser suficiente para llevar a cabo la mayoría de los experimentos.

Debido a la expansión de células continua siempre proporciona una ventaja selectiva para un rápido crecimiento, el fenotipo celular en ocasiones puede llegar a ser sesgada debido al crecimiento excesivo de la división de más rápidocélulas, en lugar de las mejores células que se diferencian. Si bien esto aún no ha demostrado ser un problema significativo utilizando el método descrito, se puede remediar por la descongelación de las células que han sido congelados temprano en su historia de cultivo o por selección clonal de las células que presentan el fenotipo deseado.

Por último, mientras que la expansión de células miogénicas a un número ilimitado cerca tiene ventajas para la detección de drogas y posible el modelado de la enfermedad, las técnicas actuales también tienen desventajas intrínsecas que impiden el uso de estas células como vehículos terapéuticos en terapia basada en células, o herramientas de diagnóstico como primarios. Tanto la extensa en la cultura y la inmortalización pasos vitro cambiar el fenotipo de las células musculares en comparación con su estado natal. Es importante destacar que estas células se expanden en un entorno que es muy diferente de el medio natural de las células satélite primaria dentro de su nicho. Por lo tanto, las células inmortalizadas requieren pruebas de seguridad intensa y posiblemente desarrollo de nuevas técnicas si se van a volver a introducir en el músculo del paciente humano.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010