Artigo de método

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

DOI:

10.3791/52320

⸱

24 de junho de 2015

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Antwerp

Neste artigo

Resumo

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Os protocolos de circuito fechado estão se tornando cada vez mais difundidos na eletrofisiologia moderna. Apresentamos uma maneira simples, versátil e barata de realizar protocolos eletrofisiológicos complexos em neurônios piramidais corticais in vitro, usando um computador desktop e uma placa de aquisição digital.

Resumo

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Neuroscience experimental está a assistir um interesse crescente no desenvolvimento e aplicação de protocolos de novos e muitas vezes complexas, em circuito fechado, onde o estímulo aplicado depende em tempo real sobre a resposta do sistema. Aplicações recentes vão desde a implementação de sistemas de realidade virtual para o estudo de respostas motoras, tanto em camundongos e em um peixe-zebra 2, para controlar de convulsões seguintes acidente vascular cerebral cortical usando a optogenética 3. Uma das principais vantagens das técnicas de circuito fechado reside na capacidade de sondagem propriedades dimensionais mais altos que não estão directamente acessíveis ou que dependem de várias variáveis, tais como a excitabilidade neuronal 4 e fiabilidade, ao mesmo tempo maximizar a taxa de transferência experimental. Neste contribuição e no contexto de electrofisiologia celular, que descrevem como a aplicação de uma variedade de protocolos de circuito fechado para o estudo das propriedades de resposta de neurónios piramidais corticais, recorded intracelularmente com a técnica de patch clamp em fatias cerebrais agudas do córtex somatossensorial de ratos jovens. Como nenhum software de código aberto disponíveis comercialmente ou fornece todos os recursos necessários para desempenhar eficazmente as experiências descritas aqui, uma nova caixa de ferramentas de software chamado LCG 5 foi desenvolvido, cuja estrutura modular maximiza a reutilização de código de computador e facilita a implementação de novos paradigmas experimentais. Formas de onda de estimulação são especificados usando uma meta-descrição compacta e protocolos experimentais completos estão descritos nos arquivos de configuração baseados em texto. Além disso, LCG tem uma interface de linha de comando que é adequado para a repetição de ensaios e automação de protocolos experimentais.

Introdução

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Nos últimos anos, electrofisiologia celular evoluiu a partir do paradigma de ciclo aberto tradicional utilizado em experiências de tensão e de corrente de fixação com os protocolos de circuito fechado modernos. A técnica de circuito fechado mais conhecido é talvez o grampo dinâmico 6,7, o que permitiu a injecção sintética de canais artificiais dependentes da voltagem de íons para determinar a voltagem da membrana neuronal 8, o estudo em profundidade dos efeitos da não-determinístico piscando em canais iônicos sobre a dinâmica de resposta neuronal 9, bem como a recriação in vitro de realista em vivo- como ativid....

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Protocolo

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O protocolo aqui descrito está em conformidade com as recomendações e orientações do Comitê do Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade de Antuérpia Ética. Este protocolo requer a preparação de um material não-sensível a partir do cérebro de ratos Wistar explantado juvenis, obtido por técnicas de eutanásia humanas aprovados.

1. Equipamentos Preparação

  1. Instalar e configurar a aquisição de dados e sistema de estimulação.
    1. Usar um computador pessoal (PC) equipado com uma placa de aquisição de dados (DAQ) suportado por Comedi para gravar sinais e enviar voltagens analógicas de controlo para o amplificador electro....

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Resultados

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Nas seções anteriores, descrevemos como usar a caixa de ferramentas de software LCG para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas de células piramidais L5 e recriar in vivo -como atividade sináptica em uma preparação fatia. O uso de uma interface de linha de comando e protocolo semi-automatizado favorecer a reprodutibilidade e a eficiência da experiência, o que pode ter um grande impacto sobre a produção e a qualidade dos dados produzidos. Além disso, uma vez que os dados são guardados de uma forma consi.......

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Discussão

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Neste texto um protocolo completo para a aplicação em tempo real, em circuito fechado célula única experimentos eletrofisiológicos foi descrito, utilizando a técnica de patch-clamp e uma caixa de ferramentas de software recentemente desenvolvido chamado LCG. Para otimizar a qualidade das gravações é crucial que a configuração de gravação ser devidamente fundamentada, blindado e vibração livre: Isso garante o acesso de células inteiras estável e duradoura para o celular, que, juntamente com a possibilidade de automatizar.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Apoio financeiro da Fundação de Investigação da Flandres FWO (contrato n. 12C9112N a DL), do 7.º Programa-Quadro da Comissão Europeia (Rede Marie Curie "C7", contrato n.º 238214; O projeto "ENLIGHTENMENT" de Tecnologia Emergente do Futuro das TIC, contrato n. 306502), o Programa de Pólos de Atração Interuniversitários iniciado pelo Escritório de Política Científica da Bélgica (contrato n. IUAP-VII/20) e a Universidade de Antuérpia são gentilmente reconhecidos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fatiador de tecidosLeicaVT-1000S
Extrator de pipetasSutterP-97
PipetasWPI1B150F-41,5/0,84 mm OD/ID, com filamento
Mesa de isolamento de vibração MicroscópioTMCSérie 20
LeicaDMLFS40X Manipuladores de Objetiva de Imersão
ScientificaAmplificadores PatchStar
Axon InstrumentsMultiClamp 700BPlaca
de aquisição de dadospor computador National InstrumentsPCI-6229Suportado por drivers Comedi Linux
Computador desktopDellOptiplex 7010Tower OS: tempo real Linux
OsciloscópiosTektronixTDS-1002
Perfusion BombaGibsonMINIPULS3Usado com cabeça de bomba R4 (F117606)
Controlador de temperaturaSistemas multicanaisTC02PH01 Manômetro de cânula de perfusão
Testo510
IncubadoraMemmertWB14
NaClSigma71376ACSF
KClSigmaP9541ACSF, ICS
NaH2PO4SigmaS3139ACSF
NaHCO3SigmaS6014ACSF
CaCl2SigmaC1016ACSF
MgCl2SigmaM8266ACSF
GlicoseSigmaG7528ACSF
K-GluconatoSigmaG4500ICS
HEPESSigmaH3375ICS
Mg-ATPSigmaA9187ICS
Na2-GTPSigma51120ICS
Na2-FosfocreatinaSigmaP7936ICS
controlada opcional

Referências

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  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebraf....

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