A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Resumo

Este protocolo descreve a medição da contração isométrica em uma preparação isolada de músculo liso, usando um sistema de banho de tecido isolado e aquisição de dados baseada em computador.

Resumo

Os ensaios de banho de tecido isolado são uma ferramenta farmacológica clássica para avaliar as relações concentração-resposta em uma miríade de tecidos contráteis. Embora essa técnica tenha sido implementada há mais de 100 anos, a versatilidade, simplicidade e reprodutibilidade desse ensaio o ajudam a permanecer uma ferramenta indispensável para farmacologistas e fisiologistas. Os sistemas de banho de tecido estão disponíveis em uma ampla variedade de formas e tamanhos, permitindo que um cientista avalie amostras tão pequenas quanto as artérias mesentéricas murinas e tão grandes quanto o íleo suíno - se não maiores. O ponto central do ensaio de banho de tecido isolado é a capacidade de medir as alterações dependentes da concentração na contração isométrica e como a eficácia e a potência dos agonistas contráteis podem ser manipuladas aumentando as concentrações de antagonistas ou inibidores. Embora os princípios gerais permaneçam relativamente semelhantes, os avanços tecnológicos recentes permitem ainda mais versatilidade ao ensaio do banho tecidual, incorporando software de registro e análise de dados baseado em computador. Este vídeo demonstrará a função do banho de tecido isolado para medir a contração isométrica de um músculo liso isolado (neste caso, anéis de aorta torácica de rato) e compartilhará os tipos de conhecimento que podem ser criados com essa técnica. Estão incluídas descrições detalhadas da dissecção e preparação do tecido aórtico, colocação de anéis aórticos no banho de tecido e equilíbrio adequado do tecido antes da experimentação, testes de viabilidade do tecido, projeto experimental e implementação e quantificação de dados. O Aorta será conectado a transdutores de força isométrica, cujos dados serão capturados usando um conversor analógico-digital disponível comercialmente e um amplificador de ponte projetado especificamente para uso nesses experimentos. O software que acompanha este sistema será usado para visualizar o experimento e analisar os dados capturados.

Introdução

A disciplina de farmacologia tem usado o sistema isolado banho de tecidos para mais de 150 anos. A versatilidade deste sistema permitiu aos cientistas em todo o mundo para caracterizar os receptores de transdução do sinal do receptor e, com este conhecimento formando a base de terapias que têm tratados milhões de indivíduos com doenças ou distúrbios, tais como hipertensão, insuficiência cardíaca, diabetes, doença gastrointestinal, a bexiga disfunção, asma, e os transtornos de deglutição, para citar apenas alguns. Até hoje, o banho de tecido isolado permanece uma importante faceta do desenvolvimento da droga e pesquisa de base, uma vez que permite que o tecido para funcionar como um tecido. Nesta lição JoVE, um protocolo formal é partilhada para demonstrar uma experiência visual e virtuais utilizando os dados a partir de um tecido isolado experimento banho que mede a contracção isométrica, que permite a caracterização do receptor.

A principal vantagem desta técnica é que o tecido vivo é umnd funções como um tecido de todo, com um resultado fisiológico (contracção ou relaxação) que é relevante para o corpo. É uma síntese de etapas (de interação droga-receptor, de transdução de sinal, de segunda geração messenger, alteração na excitabilidade do músculo liso, e mudanças em função do tecido). Enquanto outras técnicas de permitir o estudo de cada um destes passos (por exemplo, ligação de radioligandos para a afinidade da droga, a medição de segundos mensageiros), o banho de tecido isolado técnica permite a integração de todos estes passos ^1. Outra vantagem é o facto de conservar a função do tecido permite o cálculo de variáveis ​​farmacológicas importantes que são mais significativo num tecido contra um ambiente celular; se aproxima mais como as drogas analisadas iria trabalhar no corpo como um todo.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Michigan.

1. Sistema de Preparação e Configuração

1. Adicione 5 L de uma solução de sal fisiológico (PSS), que é a quantidade necessária para um experimento contracção banho de tecido que utiliza cerca de 50 ml de banhos de tecido; ver Tabela 2 para a receita PSS. Calcular o volume total necessário por multiplicação do número de banhos de tecido vezes o volume do banho e em seguida multiplicando pelo número de lavagens de tecidos necessários.
   1. Use a Tabela 2 como um guia para fazer PSS. Dissolve-se os sais em cerca de 4 L de água. NOTA: HPLC - Tipo I água é recomendado
   2. Adiciona-se 8 ml de 1 M de solução de CaCl ₂ (147 g / L de se utilizar o sal di-hidrato) para a solução, de modo que a solução final é de 1,6 mM de cálcio.
   3. Solução PSS Quantum sufficit a 5 L.
2. Pré-aqueça o sistema de banho de tecido a 37 ° C por ligar o banho de água aquecida a recirculação. Passo Crítica: Cada componente do sistema é jaqueta de água, assegurar que eles estão ligados em série uns aos outros. A direção do fluxo é crítica - garantir que os fluxos de água para cada componente com o menor conexão farpado e, ao mais alto conexão farpado.
3. Ligue sistema de aquisição de dados. Ligue os transdutores de força, pelo menos, 15 minutos antes do experimento para equilibrar a temperatura.
   NOTA: A maioria dos transdutores de força empregar medidores de tensão que são sensíveis a variações de temperatura e exibem deriva térmica inicialmente depois que a energia é aplicada.
4. Lançamento software de aquisição de dados e garantir a conexão com o sistema de aquisição de dados. Por favor, siga as instruções de fabricação para permitir a gravação de dados.
5. Certifique-se que os transdutores de força são calibrados antes de tecido é colocado no banho de tecidos e antes de gravação de dados já começou; foinstruções do fabricante Llow para calibração.
6. Ligue o sistema de banho de tecido a um 95% de _O2 / 5% de CO ₂ cilindro de gás de grau médico e verifique se há vazamentos de gás e, em seguida, pressurizar o sistema.
7. Encha os reservatórios de banho tecido com PSS e permitir que o tempo de solução para atingir a temperatura ideal. Primeiro o sistema e remover as bolhas de ar dentro do sistema e tubos.
8. Verifique aeradores de banho tecido para garantir a aeração solução consistente, que oxigena o tampão PSS e proporciona movimento browniano para distribuir drogas que serão introduzidas no banho de tecidos durante o experimento. Certifique-se de aeração / bolhas não causar o movimento do tecido, o que vai atrapalhar as gravações de dados; diminuir o fluxo de gás, conforme necessário.
   NOTA: O banho de tecidos e sistemas de aquisição de dados agora está pronto para iniciar a experiência.

2. Preparação de tecidos

1. Idealmente, dissecar os tecidos a partir do animal imediatamente antes do uso e colocar directamente into PSS.
   NOTA: Alguns tecidos podem ser salvos no PSS noite a 4 ° C, mas os controles apropriados deve ser feito para validar a função do tecido após um armazenamento prolongado; veja Seção 6.
2. Use a aorta torácica como o tecido neste exercício.
3. Anestesiar o rato, de acordo com as diretrizes institucionais e coloque o lado dorsal do rato para baixo. Confirme anesthetization via um dedo do pé-pitada ea perda de resposta reflexa a esse estímulo doloroso.
   NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital fornecido através de uma injecção intraperitoneal. Diretrizes institucionais para anestesia roedor pode ser diferente.
4. Criar um pneumotórax, criando uma incisão com tesoura ao longo do diafragma na parte inferior da caixa torácica. Em seguida, continuar a incisão da parte de baixo da caixa torácica para o esterno e bifurcar.
5. Dissecar fora ou colocar de lado os órgãos que estão no topo da coluna vertebral e localize a aorta, que se encontra diretamente ao longo da coluna vertebral.
   NOTA: Este étep fornece um espaço de trabalho claro para dissecar a aorta.
6. Sever todas as ligações à aorta; a partir do esófago, pulmão, etc, e cortar a aorta perpendicular à coluna vertebral ao nível do diafragma.
7. Suavemente segurar a aorta com uma pinça e utilize uma tesoura para dissecar a aorta a partir da espinha. Comece a dissecção na área inferior do diafragma ao lado da coluna vertebral e do trabalho em direção ao coração. Certifique-se de tomar cuidado extra para não puxar ou puxão na tecido aórtico, o que pode danificar o tecido.
8. Colocar imediatamente a aorta no prato dissecção preparado contendo PSS.
   NOTA: A dissecção da aorta em anéis é o melhor feito em um prato de dissecação que tem um silastic fundação preto. Isto permite a utilização de fios que podem ser usados ​​para canular a artéria aorta e ser fixada ao prato, proporcionando estabilidade ao mesmo tempo no prato de dissecação. O fundo preto fornece contraste que auxilia dissecção. Cuidados devem ser tomados na utilização de fios canulação como o endotelialcamada de células ial pode ser removido com um excesso de atrito do fio contra o lúmen do vaso.
9. Tomar um fio e fazer um pequeno ângulo de 90 ° em uma extremidade e empurrar a extremidade em ângulo para a base de silastic para ancorar o fio de guia. Coloque toda a aorta no prato dissecção.
10. Segurar a extremidade do fio de guia, com uma pinça, e, em seguida, passe suavemente o fio no interior do lúmen da aorta.
11. Use uma pinça e deslize a aorta para o fio. Quando a extremidade livre do fio de guia é visível, o fio suavemente curva e colocar a extremidade livre para a fundação de silastic do prato para estabilizar o tecido.
12. Usando pequenos Vannas tesoura e pinça, retire o tecido adiposo perivascular e todos os outros tecidos estranhos, coágulos de sangue, etc., até a aorta torácica aparece em branco e um pouco fibrosa.
13. Remover a aorta a partir de arame limpa e utilize uma tesoura para cortar em anéis da aorta, que são cerca de 3-5 mm de largura.
14. Inserir um anel aórtico de um de um par de tiganchos ssue por segurar o gancho e usando uma pinça para deslizar suavemente o anel no gancho. Repita este processo com o segundo gancho. Tome cuidado para garantir os ganchos não emaranhado; veja a Figura 3.
15. Verifique se cada gancho tem um fio de seda diferente anexado. Verificar que um gancho tem um pequeno laço de seda atado que permite a ligação de um vidro ou uma haste de aço inoxidável, enquanto que o outro é uma peça 10-4 cm de comprimento de sutura que vai ser amarrado o transdutor de força à mão; veja a Figura 3.
    Observação: Uma vez que a aorta é fixada aos ganchos, o tecido é preparado para ser montado no banho de tecido; veja a Figura 3.
16. Repita os passos de 2,14-2,15, para montar um segundo anel aórtico na segunda câmara do banho de tecido.

3. Colocação Tissue em Bath

1. Note-se que neste sistema, os próprios banhos de tecido são estacionários. Neste momento, preencher os banhos de tecido com aquecido, PSS aerado e permitir que a solução para vir a temperature.
2. Com a sutura de seda, amarrar um dos ganchos na preparação de tecido para o pino na vara de aço inoxidável. Coloque este final para a câmara de banho de tecido. Ligue a vara a um stand anel e coloque a outra extremidade no prato de coloração com PSS para manter o tecido imerso em tampão; veja a Figura 3.
   1. Coloque a haste e tecido na câmara de banho de tecidos e certifique-se que o tecido é totalmente imerso no PSS e da haste é segura; veja a Figura 3.
   2. Amarre a outra sutura para o transdutor de força e certifique-se de deixar uma folga na sutura entre o tecido e o transdutor de força.
      NOTA: Este folga vai ser removido através do ajuste do micrómetro; veja a Figura 3.
3. Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica.

4. Definir tensão passiva

NOTA: Cada tecido tem um comprimento (Lo) em que células musculares lisas responder optimally. As experiências preliminares para determinar a tensão de alongamento óptimo que alcança este comprimento devem ser realizados para cada tipo de manipulação de tecidos a ser examinado. O rato aorta torácica tem uma tensão de alongamento passivo ideal de 4 g.

1. Use o micrômetro / cremalheira e pinhão para aumentar a tensão de 2 g e esperar que o tecido para chegar planalto. Uma vez patamar é atingido, aumentar a tensão de 2 g e outra esperar para o tecido para estabilizar.
   NOTA: Nos anéis de aorta, após a tensão inicial de 2 g definiu e planalto atingido, o tecido deve então relaxar a ~ 1,6 g. Uma segunda aplicação de 2 g iria levar o tecido a ~ 3,6 g, a partir do qual o tecido novamente irá relaxar e tensão irá diminuir. Assim, depois de ter adicionado 4 g de tensão total, o software deve indicar cerca de 3,2 g de tensão.
2. Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica.

5. Equilíbrio e Confecção de Drogas

1. Equilibrar a tecido para60 min após a aplicação de tensão passiva para o tecido.
2. Durante a fase de equilíbrio, lavar o tecido a cada 15-20 min. Escorra o banho de tecidos e substituir o PSS com PSS de um reservatório aquecido.
   NOTA: Durante este tempo, o tecido irá relaxar, o que é indicado pela perda de tensão passiva.
3. Durante este tempo, preparar medicamentos para o experimento, que necessitam de ser de pelo menos 1000 vezes mais concentrada que a concentração real no banho, de modo que apenas um pequeno volume da reserva de fármaco necessária para atingir a concentração desejada.

6. desafio inicial

1. No final do período de equilíbrio, lavar o tecido um tempo final, com excepção de dados, e re-zero de todas as entradas.
2. Escolher um agonista (composto que irá provocar a contracção activo) ao qual o tecido responde.
   NOTA: No rato aorta torácica, o músculo liso arterial irá contrair ativamente para um agonista do receptor adrenérgico alfa devido à inervação dotecido pelo sistema nervoso simpático. Um agonista adrenérgico não seria útil em tecidos intestinais dado que os agonistas adrenérgicos causar relaxamento. Neste caso, um agonista de receptor, tais como acetilcolina (receptor colinérgico) poderia ser utilizado. Uma alternativa para a fenilefrina e a acetilcolina é a utilização de um agonista não-receptoras tais como níveis elevados de potássio (K) como o primeiro desafio. No músculo liso, K elevado opera para indirectamente os canais abertos de cálcio e, portanto, vistos como um índice geral da integridade do músculo liso.
   1. Execute o primeiro desafio ou o desafio de despertar pela adição de 10 ^-5 M fenilefrina ao banho de tecidos. Para atingir esta concentração em 50 mL de banho de tecidos, adicionar 50 ul de uma solução de fenilefrina 10 ^-2 M.
      NOTA: 50 ul em 50 ml de PSS é uma diluição 1 / 1.000, de modo que a concentração final é de 1.000x inferior a lingua, ou 10 ^-5 M. Conhecimento de volume e manutenção constante do volume dentro do banho de tecido cHamber é crítico para a determinação da concentração final da droga.
3. Adicionar 10 ^-5 M fenilefrina ao banho de tecidos e permitir a contracção de pico e, em seguida, planalto, quando a inclinação dos dados torna-se zero. Certifique-se de gravar cada evento experimental para auxiliar a análise pós-experimental.
4. Depois de planalto, lave o agonista para fora completamente por esvaziamento eo reenchimento da câmara de banho de tecido com o novo PSS. Certifique-se de registrar esses eventos também.
   NOTA: A regra de ouro é que a concentração de agonista no banho é reduzida 10 vezes com cada lavagem. Embora, mais do que 3-4 lavagens podem ser necessários para pôr o tecido de volta para baixo para o seu tom de linha de base de equilíbrio (tensão).
5. Deixe o resto do tecido em tom de linha de base para ~ 10 min antes de prosseguir.

7. Experiment

NOTA: Prazosin, um antagonista dos receptores adrenérgicos alfa, será apresentado à câmara de banho de tecido para mudar a resp concentraçãocurva onse à fenilefrina (PE); este é um antagonismo demonstrável.

1. Para um banho, adicionar o veículo (H ₂ O) em que prazosina foi dissolvido. Para outro, adicione a concentração adequada de prazosin. Neste exemplo, adicionar 25 uL de veículo a um banho e 25 ul de 10 ^-5 M de concentração prazosina para o outro para obter um 5 x 10 ^-9 M ou uma concentração de 5 nM no banho.
   NOTA: Embora a adição de veículo parece desnecessária neste exemplo, é imperativo fazê-lo quando se utiliza outros veículos que têm um potencial para ser vasoactivo (por exemplo, DMSO, etanol, acetato). Adicione o veículo correspondente, mesmo que pouca evidência existe para que seja vasoativas.
2. Deixar veículo / prazosina nos banhos e não lavar o tecido durante 1 hora.
   1. Embora os tecidos são equilibrante, preparar várias concentrações de agonista (PE). Incluem uma vasta gama de concentrações, a partir das concentrações que não induz qualquer resposta (por exemplo, </ Em> 10 ^-9 M PE) para concentrações que ultrapassam a resposta máxima (por exemplo, 10 ^-4 M PE). Desde curvas concentração-resposta são logarítmicas na natureza, fazer seis soluções separadas banco de PE (10 ^-6 -10 ^-1 M) através de diluições em série a partir da solução estoque 10 ^-1 M. Certifique-se que o volume necessário para cada concentração é ligeiramente maior do que o triplo do volume total necessário para todos os banhos (ie> 300 ul).
3. Continuar a adição de agonista, como descrito na Tabela 1.
   NOTA: Esta experiência vai gerar uma curva de resposta concentração cumulativa ao PE; cada iteração leva em conta a quantidade de substância já adicionado ao banho. Adições ocorrer até que já não aumentar a contração, ou de toda a curva atingiu patamar.
   1. Adicionar a cada concentração de droga individualmente até que o limite do tecido é alcançada.
   2. Se não houver mudança, adicionar o próximo concentração nosérie; ver Tabela 2.
      NOTA: O calendário destas adições depende do agonista utilizado. Por exemplo, norepinefrina e contração fenilefrina se desenvolve rapidamente, e deve platô em poucos minutos. Em contrapartida, a endotelina-1 contração desenvolve lentamente e pode não planalto para perto de 45 min. Outra experimentação pode ser feito sobre o tecido, após a construção de uma curva, tal como este, desde que (1) a substância lavagens para fora; e (2) que possa ser demonstrado que o tecido volta ao comportamento normal contrátil e não é afetado pelos estímulos anteriores.

Análise 8. Dados

1. Certifique-se de salvar os dados imediatamente antes e depois de uma intervenção (por exemplo, acordar ou curva cheia).
2. Encontrar e definir a linha de base do tecido para cada canal de câmara / input banho de tecidos, o que ajudará na análise de dados.
3. Uma vez que a linha de base é definida, encontrar a resposta máxima para cada concentração, e registrar o change a partir da linha de base. Sequencialmente percorrer cada uma das concentrações e registrar a mudança de linha de base.
4. Gráfico os dados resultantes. Fazei isto em qualquer programa gráfico.
   NOTA: Graph Pad Prism é concebido para farmacologista, e este é ideal para o tipo de experiência aqui apresentada.

Resultados

Em termos de agonismo, a eficácia relativa (E _max) e a potência _(EC50) de um agonista de um dado tecido pode ser calculado e comparado com as respostas de outros agonistas no mesmo tecido ^1. Na nossa experiência, a aorta torácica do rato foram incubados com veículo ou antagonista do receptor adrenérgico prazosina α ₁ (5 nM) durante uma hora antes da adição do agonista adrenérgico α ₁ fenilefrina ao banho de tecidos e geração de contracção (Figura 1).

A figura 2 apresenta modificado resultados da Figura 1. As respostas verdes têm marcado a contração máxima atingida pelo PE marcado como max, a contração máxima ½ marcado como tal e, em seguida, associado à concentração PE que causou essa resposta. A identificação destes valores é a determinação da concentração eficaz de um agonista que consegue uma resposta max metade (50%) ou CE _50.

Na geração e interpretação destes resultados, é importante o uso de ambas as concentrações baixas e elevadas de agonista para criar a curva de concentração-resposta. Sem pontos suficientes para mostrar uma linha de base estável e máxima planalto, EC ₅₀ e E _MAX só pode ser estimado. Isto foi feito graficamente neste exemplo. O software de computador que usa funções logísticas para as curvas sigmoidais pode ser usado para ajuste de curva e cálculo dos valores de _EC50.

Figura 1:. Esquemático representando tecido de banho dos desenhos um anel de tecido colocado na parede dupla, com camisa de água de tecido de bath. Tampão de entrada e saída são regulados por uma torneira de passagem de 3 vias de vidro integradas na base da câmara. _O2 / _CO2 é borbulhado através de um arejador que está selado com uma junta de vedação para evitar fugas de gás ou PSS. Recirculação de entrada é inferior à saída de recirculação para manter adequada e evitar a formação de bolsas de ar que causariam temperatura desregulação.

Figura 2:. Rat Aorta Torácica + Endothelium A figura acima mostra quatro experimentos distintos (diferentes animais e realizados por diferentes pesquisadores em diferentes set ups como representados por cores diferentes) para testar a capacidade de prazosin para deslocar uma contração induzida-PE. Prazosin (5 milhas náuticas) claramente deslocado para a direita da curva de contração induzida pelo PE em paralelo.

Figura 3: Rato Aorta Torácica + endotélio estimativa gráfica de valores de EC ₅₀ para o PE na ausência (veículo) e presença (prazosina) de antagonista.. Linha Verde (grupo C) só é marcado.

Sal	MW (g / mol)	5 Litros	MM FINAL
			(g)
NaCl	58,45	37.99	130
KCl	74,56	1.75	4.7
KH2PO4	136,1	0,8	1.18
MgSO4• 7h20	246,5	1,45	1.17
NaHCO3	84,21	6.25	14.9
Dextrose	180,16	5	5.5
EDTA	380	0,05	0,03

Tabela 1: Normal Physiological Solução Salina (PSS) da receita Conteúdo do PSS tamponada com bicarbonato usado neste experimento.. Incluem-se os pesos moleculares de todos os sais e a quantidade adicionada a 5 L de _dH2O para obter a concentração desejada.

Concentração no banho	A adição de agonista feito para banho
1 x 10 -9 M	50 ml de 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M	100 ml de 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M	35 ml de 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M	100 ml de 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M	35 ml de 1 x 10 ~ 4 M
3 x 10 -7 M	100 ml de 1 x 10 ~ 4 M
1 x 10 -6 M	35 ml de 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M	100 ml de 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M	35 ml de 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M	100 ml de 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M	35 ml de 1 x 10 M -1

Tabela 2:. Tissue banho Aditivo Agonista Concentrações A quantidade de agonista a ser adicionado a cada banho de próPerly construir curvas de concentração-resposta cumulativas. A concentração do banho desejado é conseguido através da adição de quantidades sequenciais de concentrações crescentes de agonista. Cada adição leva em conta a concentração de agonista já presente no banho. Isto é feito para minimizar o aumento de volume no banho de tecido que resultam da utilização de volumes crescentes de uma única concentração de agonista.

Discussão

Medição da força isométrica como ferramenta de pesquisa é mais de 150 anos, mas continua a ser a técnica de protótipo para caracterização receptor em tecidos contráteis ^2. O poder desta técnica é, na sua simplicidade e versatilidade: por gravação respostas induzidas por concentrações crescentes de agonista na presença ou ausência de um antagonista, uma miríade de informação pode ser derivada sobre as características farmacológicas de cada fármaco e o receptor ao qual se liga-se ^3-5. As experiências deste tipo também reunir informação sobre o competitivo contra a natureza não competitiva dos antagonistas utilizados, bem como a heterogeneidade dos receptores e efeitos de drogas não-específicos ^6-8. Assim, com permutações simples para este banho de tecido isolado experimento, um perfil farmacológico relativamente completa dos receptores que medeiam a contracção muscular induzida pelo agonista pode ser gerado.

Em termos de agonismo, the eficácia relativa (E _max) e a potência _(EC50) de um agonista de um dado tecido pode ser calculado e comparado com as respostas de outros agonistas no mesmo tecido ^1. Na nossa experiência, a aorta torácica do rato foram incubados com veículo ou o α ₁ adrenérgico prazosina antagonista do receptor (5 nM), durante uma hora antes da adição do agonista adrenérgico α ₁ fenilefrina ao banho de tecidos e geração de contracção. A Figura 2 apresenta os resultados modificado da Figura 1. As respostas verdes foram marcados com a contracção máxima conseguida pela PE marcado como máximo, a contracção máxima ½ marcada como tal e, em seguida, associadas com a concentração do PE que causou que a resposta. A identificação destes valores é a determinação da concentração eficaz de um agonista que consegue uma resposta max metade (50%) ou o valor de EC _50.

Infelizmente, o uso do parâmetro dependente do agonistas sozinha para determinar as características de ligação ao receptor pode ser complicado ^9. Idealmente, experiências adicionais utilizando antagonistas do receptor de permitir o cálculo dos dois parâmetros importantes que são a chave para definir a interacção entre um fármaco e um receptor: a ₁₀ -log da dissociação antagonista constante (pK _B) e ₁₀ a -log molar do antagonista concentração necessária para induzir um duplo desvio para a direita na curva de concentração-resposta (pA ₂₎ ^10. Ambos K _B e pA ₂ ganho a sua utilidade a partir do fato de que eles são valores independentes de agonistas, e permanecer constante, mesmo entre diferentes tecidos ^11. A partir dos dados na Figura 2, pK _B pode ser calculado usando a equação seguinte, com base em valores de _EC50 calculados em outros lugares:

CE _50, na ausência de prazosina = 2 x 10 ^{~ 8} M
CE ₅₀ no présença de prazosina = 7 x 10 ^-6 M

Resolver para K _B na equação seguinte:
log (dr-1) = log [B] - log K B
Onde:
[B] = concentração de antagonista, ou 5 x 10 ^-9 M. log (5 x 10 ^-9 M) = -8.3
dr = relação dose de valor EC ₅₀ na presença de antagonista / CE _{de 50} de ausência. Se houver um desvio para a direita, este valor irá ser maior do que um. Assim:
dr = 7 x 10 ^-6 M / 2 x 10 ^-8 M ou 700 x 10 ^-8 M / 2 x 10 ^-8 M = 700/2 = 350
Substituindo [B] e dr:
log (350-1) = -8 - log K _B
2.54 = -8 - log KB
pK _B = 10,54

Este valor para o prazosin é consistente com os valores obtidos com prazosin interage com um α ₁ adrenérgico receptou ^12,13, sugerindo que o receptor adrenérgico fenilefrina para mediar a contracção é o receptor adrenérgico α _1.

Vários passos são fundamentais para o sucesso desses experimentos. Os tecidos devem permanecer no PSS após a dissecação para evitar a perda de viabilidade do tecido. Qualquer preparação muscular isométrica tem uma relação comprimento-tensão ideal que gera força máxima contra tensão passiva ^14,15. Para o experimento descrito neste protocolo, tensão passiva ótima foi previamente determinado pela soma brevemente incrementos de 0,5 g de tensão passiva ao tecido. O tecido deve começar sem tom e, em seguida, após 30 minutos de equilibração, o tecido foi desafiada com uma concentração máxima de KCl (80 mM), o que gerou tom activo. Em seguida, o tecido foi lavado e deixou-se voltar à linha de base tom. Depois de 15 min na linha de base, um outro 0,5 g de tensão passiva foi colocada e este processo foi repetido até que um patamar detensão ativa foi conseguido com tensão passiva adicional. Em experiências preliminares, 4 g no total de tensão passiva foi determinada para alcançar geração de tensão máxima activo em anéis de aorta e, assim, esta quantidade total de tensão é colocado sobre os anéis antes de equilibração. Em termos processuais, é melhor a zero aplicação tensão passiva antes, mas pode ser feito a qualquer momento antes do experimento. Excesso de alongamento dos tecidos, em qualquer ponto do experimento ou dissecção, vai impactar negativamente a viabilidade do tecido e os resultados experimentais. Isto é mais imperativo ao colocar no banho de tecidos, como este passo tem a maior probabilidade de estiramento excessivo. Lavagem adequada, em número e duração é necessária para efeitos reprodutíveis. Um segundo desafio muito cedo depois de um desafio inicial, ou antes de tecidos voltaram a tensão da linha de base, irá resultar em respostas aberrantes. Se estudar antagonistas / inibidores reversíveis, tecidos não deve ser lavado antes de ser agonista disso, como o inhibiconcentração tor vai ser diminuída.

Há vantagens notáveis ​​e desvantagens para os isolados ensaios de banho de tecido.

Desvantagens: Os tecidos podem experimentar diferentes graus de danos durante a remoção cirúrgica ou a colocação de anéis em ganchos. Uma vez que a célula endotelial é o revestimento interno do anel da aorta, é preciso ter cuidado com o posicionamento do anel de ganchos, de modo a não danificar a camada de células. Os tecidos também podem ter distintamente diferentes períodos de tempo em que eles são viáveis ​​no banho de tecido, e isto tem que ser determinado; nem todos os tecidos são o mesmo. Ao longo destas linhas, tecidos podem mudar em sua capacidade de resposta ao longo do dia de tal forma que os controles de tempo tornar-se um controle necessário para cada experimento. Um bom exemplo disto é a traqueia da cobaia que melhora máximo em contractilidade de 100% durante uma experiência típica 8 h. As drogas que são pouco solúveis em água pode precipitar no PSS. Finalmente, um acumuladond adições não-cumulativas de uma droga que é um agonista pode resultar em resultados diferentes se ocorrer dessensibilização do receptor para o agonista; angiotensina II é uma dessas drogas que mostra taquifilaxia rápidas.

Vantagens: Uma das principais vantagens de experimentos banho de tecidos é que é em tempo real; pode-se ver a experiência que se desenrola e pode rapidamente tirar conclusões e planejar os próximos passos, bem como solucionar problemas durante um experimento. Um experimento leva um dia para fazer. Vários tecidos podem geralmente ser preparados a partir de um animal tal que o animal possa servir como o seu próprio controlo, e que aumenta a resistência a um experimento. Pode-se também isolar o tecido a partir de outros factores, a fim de testar uma resposta relativamente puro do tecido à droga. Em experiências in vitro, tais como o sistema de banho de tecido também permitem o uso de uma pequena quantidade de fármaco em comparação com uma experiência in vivo.

O delineamento experimental básico aqui descrito pode serextensivamente modificado para permitir o registo dos parâmetros adicionais ou a introdução de outros estímulos externos. Por exemplo, além de permitir que os eléctrodos para a estimulação do campo eléctrico de nervos inervação ^16,17. Com a adição de sondas térmicas ou de pH, os efeitos da temperatura e do pH sobre as respostas contrácteis também pode ser medido ^18,19. Da mesma forma, o oxigênio pode ser substituída total ou parcialmente com N ₂ para avaliar os efeitos induzidos pela hipóxia. Além disso, os mesmos princípios básicos de medição contractilidade isométrica utilizados neste vídeo pode ser utilizada para desenvolver sistemas que permitem a medição simultânea de desenvolvimento e alterações da tensão isométrica em ²⁰ cálcio intracelular. A transdução do sinal é também prontamente estudados, uma vez que existem sistemas que podem congelar rapidamente uma amostra de tecido durante uma resposta, de modo que a actividade de um sistema de via de transdução de sinal pode ser verificada bioquimicamente.

A variação de equipment que pode ser usado para fazer isso é enorme. Este sistema todo, qualquer mão construídos ou automatizado, pode ser comprado a partir de várias empresas diferentes. Os banhos de tecido e titulares de tecido utilizados neste protocolo foram (banhos de tecido) e mão construído (titulares)-blown mão por um in-house oficinas mecânicas da Universidade Estadual de Michigan.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software LabChart	ADInstruments		7.2
PowerLab (4 canais)	ADInstruments	ML760
QuadBridge (4 canais)	ADInstruments	ML112	ML112
Cabo Adaptador	de Grama ADInstruments	MLAC11	MLAC11
Transdutor de Deslocamento de Força de Grama	Grass Instrument Co	FT03	FT03
Cabo Transdutor de Grama	Grass Instrument Co	TAC-7 REV-1
Cabo BNC para BNC	ADInstruments	MLAC01
IsoTemp 2100	Fisher Scientific		IC-2100
Banho de Tecido	Múltiplas Fontes
Solução			PSS
Sutura de seda trançada	Harvard Apparatus	51-7615	SP104
Suporte de anel	Humboldt MFG Co	H-2122 7
Pratos de dissecação	feitos à mão com tubulação de silicone
Tygon	VWR Scientific	63010-100	R-3603
Braçadeiras de mangueira	Cole-Parmer Instrument Co	06832-08	SNP-8
50 ml Banho Muscular	Eberhartglass Sopro	Personalizado
250 ml Câmaras de Aquecimento	Eberhartglass Sopro
	Ace Glass	7202-06	7202-02
Micrômetro
Suportes
PersonalizadosGrampos de três pinos	VWR International		Talon
Conector S	VWR International		Talon
Ganchos de tecido	feitos à mão em casa
Estereomicroscópio Leica MZ6	Leica		10447254
		12562-36	12562-36
Placa de Petri de Cultura	Pyrex		7740 Vidro
Sylgard Elastômero de Silicone	Dow Corning		Sylgard 170 Kit
Vannas Tesoura	George Tiemann & Co	160-150	160-150
Laja & Pinça de fixação	George Tiemann & Co	160-55	160-55