Method Article

Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

DOI:

10.3791/52333

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June 17th, 2015

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1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

In This Article

Summary

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Os protocolos descrevem dois sistemas in vitro de testes de toxicidade de desenvolvimento (UKK e UKN1) com base em células estaminais embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Os sistemas de teste prever risco de toxicidade para o desenvolvimento humano, e pode contribuir para reduzir os estudos em animais, dos custos e do tempo necessário para os testes de segurança química.

Abstract

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Protocolos eficientes para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas para vários tecidos em combinação com tecnologias -ómicas abriu novos horizontes para em testes de toxicidade in vitro de potenciais drogas. Para fornecer uma base científica sólida para tais ensaios, será importante para obter informação quantitativa sobre o curso do tempo de desenvolvimento e sobre os mecanismos regulatórios subjacentes por abordagens de biologia de sistemas. Dois ensaios foram, portanto, ligado aqui para esses requisitos. No sistema de teste UKK, células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) (ou outras células pluripotentes) são deixados diferenciar espontaneamente durante 14 dias em corpos embrióides, para permitir a geração de células de todas as três camadas germinais. Este sistema recapitula principais etapas do desenvolvimento embrionário humano cedo, e ele pode prever-humano específico cedo embrionário toxicidade / teratogenicidade, se as células são expostas a produtos químicos durante a diferenciação. O sistema de teste baseia-se na UKN1 células estaminais embrionárias humanas diferenciação para um populatião de neuroectodérmico progenitoras (NEP) células durante 6 dias. Este sistema recapitula o desenvolvimento neural precoce e prevê neurotoxicidade de desenvolvimento precoce e alterações epigenética desencadeadas por agentes químicos. Ambos os sistemas, em combinação com estudos de transcriptoma de microarray, são adequados para a identificação de biomarcadores de toxicidade. Além disso, eles podem ser utilizados em combinação para gerar dados de entrada para análise biologia sistemas. Estes sistemas de teste tem vantagens sobre os estudos toxicológicos tradicionais requerem grandes quantidades de animais. Os sistemas de teste pode contribuir para uma redução dos custos de desenvolvimento de medicamentos e avaliação da segurança química. Sua combinação lança luz especialmente em compostos que podem influenciar o neurodesenvolvimento especificamente.

Introduction

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A capacidade das células-tronco embrionárias humanas (hESC) para se diferenciar em vários tipos de células abriu uma nova era de testes in vitro de toxicidade 1, modelagem de doença e medicina regenerativa 2. As células-tronco são dotados com a capacidade de se auto-replicar, para manter seu estado pluripotente, e se diferenciar em células especializadas 3,4. As propriedades de células estaminais embrionárias humanas (capacidade de se diferenciar para todos os principais tipos de células) são encontrados também em outras células estaminais pluripotentes humanas, tais como células pluripotentes estaminais humanas induzida (hiP....

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Protocol

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O protocolo a seguir foi realizada utilizando linha Embryonic Stem Cell humana (hESC) H9. Esta linha celular foi rotineiramente cultivadas no rato mitotically inativada fibroblastos embrionárias (MEFs) em meios de cultura de células estaminais embrionárias humanas suplementadas com bFGF e, em seguida, cultivadas em meio de células-tronco em seis centímetros placas de Petri revestidas com matriz da membrana basal, como matrigel, para se livrar de MEFs. As células H9 de> 80% de placas confluentes foram utilizados para nova passagem. Células H9 cultivadas em placas de matriz da membrana basal foram usadas para a formação de EBS. Todos os proc....

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Results

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Exposição ao mercúrio de metilo em sistema de teste UKK

O ensaio de citotoxicidade foi realizado com H9 EBS para obtenção de um valor de IC 10 (redução de viabilidade até 10%) para a citotoxicidade de metil-mercúrio (Figura 1). Também foi realizada uma microarray baseado (plataforma Affymetrix) estudo biomarcador. A H9 EB foram expostos ao mercúrio de metilo (0,25 e 1 uM) durante 14 dias. No dia 14, as amostras foram recolhidas utilizando TRIzol e o ARN foi isolad.......

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Discussion

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As abordagens tradicionais de testes toxicológicos envolvem estudos com animais extensas tornando assim o teste caro e demorado. Além disso, devido às diferenças entre espécies nos estudos pré-clínicos de segurança nos animais nem sempre são válidos para prever os efeitos de toxicidade de drogas potencialmente relevantes para os seres humanos. Apesar de primatas não-humanos são mais previsíveis, ainda forte ética e demandas socioeconômicas estão aumentando rapidamente por sociedades modernas para o desenvolvimento sensí.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

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Agradecemos a M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani e Cornelia Böttinger pelo excelente suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Alemã de Pesquisa (RTG 1331) e do Ministério Alemão de Pesquisa (BMBF).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F-12Life Technologies11320082Dulbecco's Modified Eagle Medium:Mistura de nutrientes F-12
KOSRLife Technologies10828028Knockout Serum Replacement
GlutaMAXLife Technologies35050061suplemento GlutaMAX
NEAALife Technologies11140050MEM Solução
DPBSLife Technologies14190-0144Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, sem cálcio, sem
magnésio mTeSR mediumStemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V placa inferiorVWR734-0483Placa, Microwell, V BTTM, 96 Well, Estéril 1 * 50 ST
V tampa da placa inferiorVWR634-0011Tampa, placas de microtitulação, Cond. Anel 1 * 50 ST
Pen/StrepLife Technologies15140-122Penicilina-estreptomicina,
água destiladaLife Technologies15230-089.Água destilada estéril
Humano FGF-2 (bFGF)MilliporeGF003AF-100UGbásico, humano recombinante, livre de animais
Filtro 0.22 μ mMilliporeSCGPU02REStericup-GP, 0,22 μ m, polietersulfona, 250 ml, radioesterilizado
StemPro EZPassageTM DescartávelInvitrogen23181010
BD MatrigelTM, qualificado hESC MatrixStemcell Technologies354277frasco de 5 ml
DMSOSigmaD-2650
RNAlater Solução de EstabilizaçãoLife TechnologiesAM7020Ele estabiliza e protege a integridade do RNA em amostras descongeladas.
70 μ m Filtro de CélulasBecton Dickinson352350Filtro de Células com 70 μ m Malha de nylon
35 μ m Filtro de células da tampa, 5  tubo de ensaioBecton Dickinson352235ensaio de fundo redondo de 5 ml de poliestireno, com uma tampa de filtro de células (35  μ m)
Tubo de polipropileno estéril de 50 mlGreiner Bio-One227261 Tubopolipropileno de 50 ml com fundo cônico, frasco estéril
T75Greiner Bio-One658175CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Frascos
TRIzolLife Technologies10296010
placas de fundo óptico de 96 poçosThermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
ApotransferinaSigma-AldrichT-2036
DispaseWorthington BiochemicalsLS002104
DorsomorphinTocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R & D Systems233-FB
GelatinaSigma-AldrichG1890-100G
GlicoseSigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
InsulinaSigma-AldrichI-6634
Nocaute DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR& D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ProgesteronaSigma-AldrichP7556
PutrescinaSigma-AldrichP-5780
Inibidor de ROCK Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
SeleniumSigma-AldrichS-5261
β-MercaptoethanolGibco Invitrogen31350-010
[header]
Lista de Kits
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
Kit de Hibridização, Lavagem e Mancha GeneChipAffymetrix900721, 22, 23Este kit fornece todos os reagentes necessários para a lavagem de hibridização e coloração de microarrays.
Conjunto DNase livre de rnaseQIAGEN79254
[header]
Lista de equipamentos
Microscópio invertidoOlympusIX71
Genechip - 645Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450Affymetrix
Affymetrix Scanner Gene-Chip-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5Molecular Devices
 
 
 
[header]
Lista de softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Ferramentas online para anotação funcional
DAVID
Onto-ferramentas Laboratório de Sistemas Inteligentes
de Aminoácidos Não Essenciais líquida Fator de Crescimento de Fibroblastos tubo de de Forno de hibridização e Bioinformática

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceut....

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Human Pluripotent Stem CellsDevelopmental Toxicity AssaysEmbryoid Body FormationNeuroectodermal Progenitor DifferentiationTranscriptome Microarray AnalysisChemical Safety ScreeningSystems Biology Data GenerationEarly Embryonic DevelopmentNeural Development ToxicityToxicity Biomarker Identification

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