Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.
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Artigo de método
Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tecidos tumorais rígidas têm sido fortemente implicado na regulação da migração e invasão de células de cancro. Migração invasivo através de tecidos de ligação cruzada é facilitada por saliências ricos em actina chamados invadopodia proteoliticamente que degradam a matriz extracelular (ECM). Atividade Invadopodia demonstrou ser dependente de rigidez ECM e contráteis da célula cancerosa forças sugerindo que sinais de rigidez pode regular estas estruturas subcelulares através actomiosina contratilidade. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Enquanto existem algumas variações entre os dois ensaios, o protocolo aqui apresentado fornece um método para a criação de PAA thno pode ser usado em ambos os ensaios e são facilmente adaptáveis às necessidades biológicas e técnicas específicas do usuário.
Introdução
A rigidez da ECM associado a tumor tem sido identificada como um factor significativo na condução comportamento maligno, aumentando a contractilidade actomiosina 1-3. Embora este efeito principalmente tem sido demonstrado com células de cancro da mama, a rigidez da matriz foi encontrado para alterar as propriedades invasivas das células derivadas de uma variedade de cancros o que sugere que 4-8 rigidez tumoral podem desempenhar um papel em outros tipos de cancros. Para penetrar tecidos reticulados durante a migração invasiva, as células cancerosas utilizam saliências adesivas ricas em actina conhecidos como invadopodia que localizar proteinases ....
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Protocolo
1. Preparação de lamelas de vidro para PAAs
- Limpos 12 lamelas mm com toalhetes baixos fiapos.
- Chama as lamelas 12 milímetros e 14 milímetros a lamela na microplaca de cada 35 milímetros prato de vidro de fundo, passando-os através de uma chama do queimador de Bunsen, usando uma pinça.
- Tratar os micropoços com 200 uL de NaOH 0,1 N durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar e secar os micropoços para 30 min.
- Tratar os micropoços com 50-100 ul de 3-aminopropiltrimetoxisilano, durante 10 min à temperatura ambiente, na hotte. Este produto químico reage com plástico; portanto, use pipetas de vidro e não preencher os mic....
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Resultados
No ensaio invadopodia, invadopodia são tipicamente identificadas por uma co-localização de marcadores como actina e cortactina em estruturas puntiformes dentro do corpo celular (Figura 1). Ambos degradar de forma activa e não-degradante invadopodia pode ser contado e são diferenciados por se estas estruturas são co-localizada com as áreas pretas falta de sinal fluorescente no fibronectina marcada com FITC (Figura 1). Invadopodia são contadas manualmente, e a degradação de ECM por célula.......
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Discussão
Apresenta-se um método para a fabricação de PAA que podem ser usados como a base para invadopodia força de tracção e ensaios para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contrácteis. Enquanto PAAs têm sido muito utilizados para analisar os efeitos da rigidez nas células e calcular forças de tração 18,24,27, este protocolo é o primeiro a desenvolver ensaios paralelos baseados em PAAs com os mesmos factores de rigidez para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contráteis em resposta a .......
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Divulgações
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número K25CA143412 (Parekh). Gostaríamos de reconhecer que o apoio adicional foi fornecido pelo Departamento de Otorrinolaringologia. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Agradecimentos
Os autores não têm nada a revelar.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropiltrimetoxissilano | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrilamida (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Ácido acrílico NHS éster | Sigma-Aldrich | A8060 | preparar fresco em capela de exaustão 10 mg/ml em DMSO |
| Alexa Fluor 546 faloidina | Life Technologies | A22283 | também pode usar rodamina |
| Persulfato de amônio | Bio-Rad | 161-0700 | prepare uma solução fresca a 10% em 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use 6 gotas para encher micropoços |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Albumina de soro bovino | RPI | A30075 | faça 3% para solução de bloqueio em 1x PBS e armazene em 4 ° C |
| Lamínulas (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| tubo de diálise | Sigma-Aldrich | D9777 | pré-equilíbrio em tampão borato por 15 - 30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | uso para fazer meio invadopódios |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | uso para fazer solução de éster NHS de ácido acrílico |
| Fator de crescimento epidérmico | Vida útil Tecnologias | PHG0311 | uso para fazer invadopodia meio |
| Etanol | PHARMCO-AAPER | E200 | diluir com água ultrapura para 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | usar para fazer invadopódios meio |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | proteger da luz |
| Gelatina | Polysciences | 00639 | normalmente faça 10 ml de solução de sacarose a 1% / gelatina a 1% em PBS e armazene a 4 ° C (pré-aqueça PBS para dissolver a gelatina facilmente) |
| Pratos com fundo de vidro (lamínulas de 35 mm) | lamínulas | MatTek | P35G-0-14-C |
| glutaraldeído não revestido (25%) | Polysciences | 01909 | diluído com 1x PBS para 0,5% |
| Anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 633 | Technologies | A21050 | |
| Fibronectina plasmática humana | Life Technologies | 33016-015 | adicione 5 ml de água ultrapura para fazer 1 mg/ml; alíquota em volumes com base no uso para evitar ciclos excessivos de congelamento e descongelamento |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use para fazer 10x estoque PBS |
| Mouse anti-cortactina 4F11 anticorpo | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use para fazer 10x estoque PBS |
| NaCl | RPI | S23020 | use para fazer 10x estoque PBS e tampão de borato |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | diluir com água ultrapura para 0,1 N |
| Nu-Serum (soro de baixa proteína) | BD Biosciences | 355500 | use para fazer meio invadopódio |
| Paraformaldeído | Acros | 416785000 | normalmente fazem 10% de estoque em 1x PBS, preparam em capela de exaustão e adicionam alguns ml de NaOH forte para dissolver o paraformaldeído facilmente e, em seguida, trazem de volta ao pH 7,4 com HCl forte) |
| PBS (estéril) | Cellgro | 21-040-CV | uso para cultura de células |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | uso para fazer meio invadopódio |
| Borohidreto de sódio | Sigma-Aldrich | 452882 | preparar fresco em capela de exaustão 1 mg/ml em 1x PBS |
| Metaborato de sódio tetrahidratado | Sigma-Aldrich | S0251 | use para fazer tampão borato |
| Sacarose | RPI | S24060 | normalmente faça 10 ml de solução de sacarose a 1% / gelatina a 1% em PBS e armazene a 4 ° C (pré-aqueça PBS para dissolver a gelatina facilmente) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | faça 10% de estoque em 1x PBS e use como está para remoção de células em ensaio de força de tração ou dilua com 1x PBS para coloração |
Referências
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
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Reimpressões e permissões
