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Artigo de método

Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas

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DOI:

10.3791/52343

⸱

4 de janeiro de 2015

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Neste artigo

Resumo

Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.

Resumo

Tecidos tumorais rígidas têm sido fortemente implicado na regulação da migração e invasão de células de cancro. Migração invasivo através de tecidos de ligação cruzada é facilitada por saliências ricos em actina chamados invadopodia proteoliticamente que degradam a matriz extracelular (ECM). Atividade Invadopodia demonstrou ser dependente de rigidez ECM e contráteis da célula cancerosa forças sugerindo que sinais de rigidez pode regular estas estruturas subcelulares através actomiosina contratilidade. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Enquanto existem algumas variações entre os dois ensaios, o protocolo aqui apresentado fornece um método para a criação de PAA thno pode ser usado em ambos os ensaios e são facilmente adaptáveis ​​às necessidades biológicas e técnicas específicas do usuário.

Introdução

A rigidez da ECM associado a tumor tem sido identificada como um factor significativo na condução comportamento maligno, aumentando a contractilidade actomiosina 1-3. Embora este efeito principalmente tem sido demonstrado com células de cancro da mama, a rigidez da matriz foi encontrado para alterar as propriedades invasivas das células derivadas de uma variedade de cancros o que sugere que 4-8 rigidez tumoral podem desempenhar um papel em outros tipos de cancros. Para penetrar tecidos reticulados durante a migração invasiva, as células cancerosas utilizam saliências adesivas ricas em actina conhecidos como invadopodia que localizar proteinases para degradar focally o ECM 9. Invadopodia são consideradas uma característica de células invasivas e têm sido implicados na invasão de células de tumores e metástases 10,11. Os trabalhos anteriores mostraram que a rigidez da matriz pode regular números invadopodia e associado ECM degradação 4,12 através da atividade da miosina II e proteínas mechanosensitive 12. Considerando acorrelação entre a densidade e a agressividade do tumor do cancro 13,14, estes resultados sugerem um mecanismo pelo qual as células cancerígenas podem responder aos tecidos rígidos de tumor para dirigir a invasão e metástases através de actomiosina contractilidade.

Em rigidez MEC in vitro e em densidade do tecido vivo têm sido mostrados para regular o comportamento invasivo das células cancerosas 1,15-17. Enquanto actomiosina contractilidade parece ser importante neste processo, estudos actual conflito a respeito de se a capacidade metastática está correlacionada com o aumento ou a diminuição da força contráctil 6,18-20. Além disso, não se sabe se essas forças mediar diretamente a atividade invadopodia 21. Recentemente, descobriu que forças contráteis da célula cancerosa eram dependentes de rigidez da matriz e foram preditivos de degradação ECM por invadopodia 5. Estes resultados sugerem que as forças celulares podem desempenhar um papel importante na progressão do cancro pela mediação invadopodia acdade em resposta às propriedades mecânicas do microambiente do tumor.

Para correlacionar propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas, 5, modificamos um protocolo para a criação de PAAs com diferentes rigidez que anteriormente foi usado para investigar a atividade invadopodia dependente da rigidez 4,12,22. Por reticulação química fibronectina do plasma humano ao longo do PAA, estes hidrogéis modificadas podem ser utilizadas como a base para ambas invadopodia e ensaios de força de tracção para assegurar que as células experimentado as mesmas em ambas as experiências rigidez 5. Nos ensaios invadopodia, a fibronectina fornece um domínio de ligação natural para gelatina para ligar o ECM sobreposta para o SAP para detectar a degradação da matriz. Nos ensaios de força de tração, a fibronectina fornece um ligando para adesão celular direto para detectar deslocamentos de microesferas utilizadas para calcular as forças de tração celulares. Este método resulta em o que temos chamado macio, duro,e PAAs rígidas que são obrigados a pratos com fundo de vidro e têm módulos elásticos, E, de 1023, 7307 e 22692 Pa 5, que abrange a gama de propriedades mecânicas reportados para os tecidos normais e cancerosos 23.

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Protocolo

1. Preparação de lamelas de vidro para PAAs

  1. Limpos 12 lamelas mm com toalhetes baixos fiapos.
  2. Chama as lamelas 12 milímetros e 14 milímetros a lamela na microplaca de cada 35 milímetros prato de vidro de fundo, passando-os através de uma chama do queimador de Bunsen, usando uma pinça.
  3. Tratar os micropoços com 200 uL de NaOH 0,1 N durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Aspirar e secar os micropoços para 30 min.
  5. Tratar os micropoços com 50-100 ul de 3-aminopropiltrimetoxisilano, durante 10 min à temperatura ambiente, na hotte. Este produto químico reage com plástico; portanto, use pipetas de vidro e não preencher os micropoços completamente para evitar contato com o plástico prato.
  6. Lave os micropoços com água ultrapura para cerca de 10 min até que o 3-aminopropiltrimetoxisilano se torna claro.
  7. Lave os micropoços com água ultrapura duas vezes utilizando uma garrafa squeeze.
  8. Lave os micropoços com 2 ml de água ultrapura umtemperatura ambiente t em um balancim fixado a uma velocidade média (~ 1 Hz), durante 10 min.
  9. Aspirar e secar os micropoços para 30 min.
  10. Tratar os micropoços com 2 ml de solução de glutaraldeído a 0,5% à temperatura ambiente num agitador rotativo ajustado a uma velocidade média (~ 1 Hz), durante 30 min.
  11. Lave os micropoços com 2 ml de água ultrapura à temperatura ambiente num agitador rotativo à velocidade média (~ 1 Hz), durante 10 min. Repita duas vezes mais para um total de 30 min.
  12. Micropoços seco a um ângulo inclinado (60º ou superior) por 30 min.
    Nota: Os pratos pode ser armazenada durante 2 meses num exsicador.

2. Preparação de PAAs para Invadopodia Ensaios

  1. Para uma solução de PAA suave (8% de acrilamida e 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 25 ul de 2% BIS, e 574 ul de água ultrapura (Tabela 1).
  2. Para uma solução de PAA disco (8% de acrilamida e 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 175 & #181; l de 2% BIS, e 409 ul de água ultrapura (Tabela 1).
  3. Para uma solução de PAA rígida (12% de acrilamida e 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 ul de 40% de acrilamida, 300 ul de 2% BIS, e 169 ul de água ultrapura (Tabela 1).
  4. Desgaseificar as soluções durante 15 min. Adicionar 200, 215, e 230 uL de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano em água ultrapura com as soluções de APA macios, duros, rígidos e, respectivamente. Para todas as soluções, adicionar 1 ml de 10 mg / ml de ácido acrílico N-hidroxissuccinimida (NHS), éster de 5 uL de um / ml de persulfato de amónio, 100 mg e 2 ul de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED ; Tabela 1). Misture com pipetagem suave e evitar a criação de bolhas em soluções.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(L) 		2%
BIS
(L) 		Ultrapura
Água
(L) 		1 mg / ml
FN
(L) 		10 mg / ml
NHS Éster
(L) 		100 mg / mL
APS
(L)
TEMED
(L) 		Elástico
Módulo
(Pa)
Macio 200 25 574 200 1 5 2 1023
Duro 200 175 409 215 1 5 2 7307
Rígido 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tabela 1: Ingrediente volumes e resultando módulos elásticos para PAAs macios, duros e rígidos utilizados nos ensaios invadopodia. AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amónio.

  1. Pipetar 8,48 mL da solução de PAA sobre o centro de cada micropoço.
    Nota: Este volume teoricamente produz um PAA de 75 um de espessura.
  2. Com cuidado, abaixe o lado inflamado da lamela 12 milímetros para a gota na microplaca, usando uma pinça.
  3. Permitir que a solução de PAA ensanduichada polimerizar durante 15-30 min. Verifique polimerização, verificando a solução restante.
  4. Adicionar 2 ml de 1x PBS a cada prato e remover as lamelas de 12 milímetros, com uma pinça.
    Nota: 10x PBS é feita em laboratório e composto de 0,011 M de KH 2 PO 4, 1,54 M de NaCl, e 0,056 M de Na 2 HPO 4.
  5. Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS à temperatura ambiente durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.

3. Preparação de PAAs para TRACCÇÃO Ensaios

  1. Para uma solução de PAA suave (8% de acrilamida e 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 25 ul de 2% BIS, e 566 ul de água ultrapura (Tabela 2).
  2. Para uma solução de PAA disco (8% de acrilamida e 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 175 ul de 2% BIS, e 401 ul de água ultrapura (Tabela 2).
  3. Para uma solução de PAA rígida (12% de acrilamida e 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 ul de 40% de acrilamida, 300 ul de 2% BIS, e 161 ul de água ultrapura (Tabela 2).
  4. Desgaseificar as soluções durante 15 min. Adicionar 200, 215, e 230 uL de 1 mg / ml de fibronectina do plasma humano para as soluções de APA macios, duros, rígidos e, respectivamente. Sonicate 8 l de 200 nm microesferas vermelhas fluorescentes (excitação / emissão de 580/605 nm) para 30 seg. Para cada solução, adicionar 8 l de 200 microesferas fluorescentes vermelhas nm,1 uL de 10 mg / ml de ácido acrílico, éster NHS 5 ul de um / ml de persulfato de amónio a 100 mg, e 2 ul de TEMED (Tabela 2). Misture com pipetagem suave e evitar a criação de bolhas em soluções.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(L) 		2%
BIS
(L) 		Ultrapura
Água
(L) 		1 mg / ml
FN
(L)
As micro-esferas
(L) 		10 mg / ml
NHS Éster
(L) 		100 mg / mL
APS
(L)
TEMED
(L) 		Elástico
Módulo
(Pa)
Macio 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Duro 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Rígido 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tabela 2:. Ingrediente volumes e resultando módulos elásticos para PAA macios, duros, rígidos e utilizados nos ensaios de força de tracção AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amónio.

  1. Pipetar 8,48 mL da solução de PAA sobre o centro de cada micropoço.
    Nota: Este volume teoricamente produz um PAA de 75 um de espessura.
  2. Com cuidado, abaixe o lado inflamado de the 12 milímetros lamela sobre a gota na microplaca, usando uma pinça.
  3. Permitir que a solução de PAA ensanduichada polimerizar durante 15-30 min. Verifique polimerização, verificando solução restante.
  4. Adicionar 2 ml de 1x PBS a cada prato e remover as lamelas de 12 milímetros, com uma pinça.
  5. Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS à temperatura ambiente durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.

4. Preparação de ECM para Invadopodia Ensaios

  1. Aquece-se a solução de gelatina (gelatina a 1% e 1% de sacarose) a 37 ° C.
  2. Tratar o SAP com 150 ul da solução de gelatina, durante 1 min, em seguida, cuidadosamente aspirado a partir do fundo dos micropoços ao segurar os pratos de vidro de fundo num ângulo de 45 °.
  3. Seca-se a camada fina remanescente de gelatina sobre o SAP nos micropoços em um ângulo agudo (60 ° ou maior) para optimizar a secagem durante 60 minutos.
  4. Tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de glutaraldeído a 0,5% refrigerado em ice durante 15 minutos, seguido por temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Lave os micropoços com 2 ml de uma 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
  6. Tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de boro-hidreto de sódio durante 1 min. Bater levemente pratos na bancada para remover as bolhas que se formam sobre a superfície da gelatina.
  7. Aspirar e lavar os micropoços com 2 ml de uma 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
  8. Dilui-se uma solução de fibronectina de plasma humano marcada com FITC a 50 ug / ml com um 1x PBS e centrifugar a 175.000 x g a 4 ° C durante 15 min. Ou comprar comercialmente disponível fibronectina rotulados ou rotulá-la da seguinte forma:
    1. Dissolve-se 5 mg de fibronectina em 10 ml de tampão borato (170 mM de tetra-hidrato de metaborato de sódio e 40 mM de NaCl) e o lugar em tubagem de diálise.
    2. Rotular a fibronectina, colocando o tubo em 200 ml de tampão de borato contendo 6 mg de FITC dissolvido à temperatura ambiente num agitador magnéticodefinido na configuração mais baixa para 1,5 horas no escuro.
    3. Dialisar com 500 ml de uma 1x PBS num agitador magnético definido no nível mais baixo durante 3 dias num quarto escuro frio (4 ° C) com dois volumes muda de um dia.
    4. Calcular a concentração de fibronectina marcada com FITC com base na densidade óptica de aliquotas diluídas (1: 200) a 280 nm e 493 nm como [OD 280 - (0,36 x DO 493)] / 1,4 vezes o factor de diluição de 2 vezes 200 (que corresponde para a concentração de glicerol a fibronectina no passo seguinte), resultando em unidades de mg / ml.
    5. Dialisar durante a noite numa solução de glicerol a 50% num agitador magnético definido no nível mais baixo durante a noite numa câmara fria a 4 ° C).
  9. Tratar os micropoços com 150 ul de solução de fibronectina marcada com FITC à temperatura ambiente durante 60 min no escuro.
  10. Aspirar cuidadosamente a solução de fibronectina marcada com FITC a partir do fundo dos micropoços ao segurar os pratos de vidro de fundo emum ângulo de 45 ° e, em seguida, encher os pratos de vidro de fundo com solução de etanol a 70% à temperatura ambiente durante 10 min, a uma capa de cultura de células para a esterilização escuro. Preencha também tampas de vidro prato fundo ou limpar com lenços lint baixa embebido em álcool 70%.
  11. Lavar pratos com fundo de vidro, preenchendo-os com 1x PBS por 5 min. Repita duas vezes mais com 2 ml de PBS 1x para um total de 15 min.

5. Preparação e imagem das Invadopodia Ensaios

  1. Adicionar 25.000 células cancerosas em 2 ml de meio invadopodia (1: 1 de DMEM e meio RPMI 1640 com 5% de soro de baixo teor em proteína, 10% de soro fetal de bovino, e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico adicionada de fresco) para os pratos de vidro de fundo e incubar durante a noite.
  2. Aspirar e tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de paraformaldeído a 3,7% à temperatura ambiente no escuro durante 20 minutos para fixar as células.
  3. Após duas lavagens rápidas com 2 ml de PBS 1x, tratar os micropoços com 2 ml de Triton X-100 a 0,1% na solução tempe quartoratura no escuro durante 5 min para permeabilizar as células.
  4. Depois de uma lavagem rápida com 2 mL de PBS 1x, tratar os micropoços com 3% de albumina de soro bovino solução à temperatura ambiente de bloqueio no escuro durante 60 min para bloquear as células.
  5. Incubar os micropoços com 150 ul de anticorpo de ratinho anti-cortactina (1: 750) em solução à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos de bloqueio.
  6. Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
  7. Incubar os micropoços com 150 ul de anticorpo de cabra anti-rato de anticorpo 633 (1: 500) e 546 faloidina (1: 750) em solução à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos de bloqueio.
  8. Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
  9. Adicione seis gotas de meio de montagem para preencher cada micro e cubra com 22 x 22 lamelas.
  10. Cortactina Imagem e actina para identificar invadopodia usando filtros de excitação e emissão de 632/647 nm e556/570 nm, respectivamente, utilizando uma lente de imersão em óleo de elevada NA, 40X sobre uma ampla microscópio de campo invertido. Da mesma forma, a fibronectina imagem para identificar a degradação de ECM utilizando um filtro de excitação e de emissão de 492/518 nm.

6. Preparação e imagem das TRACCÇÃO Ensaios

  1. Adicionar 15.000 células cancerosas em 2 ml de meio invadopodia para os pratos de vidro de fundo e incubar durante a noite.
  2. Aspirar o meio em pratos de vidro de fundo e substituir com 2 ml de meio L-15, com os mesmos suplementos (5% de soro de baixo teor em proteína, 10% de soro fetal de bovino, e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico) adicionado de fresco, pré -warmed a 37 ° C.
  3. Incubar as placas de fundo de vidro em uma câmara ambiental em um microscópio invertido pré-equilibrado a 37 ° C, com humidade elevada durante 1 h.
  4. Tome quatro conjuntos de imagens usando uma NA alta, 40X lente em um microscópio de campo amplo invertido com um estágio automatizado para marcar posições celulares:
    1. Células de imagens sobre ap dos PAAs usando contraste de fase (imagem de "fase").
    2. Imagem microesferas fluorescentes de excitação e emissão filtros de 560/645 nm, concentrando-se ligeiramente sob as células até a primeira camada de microesferas no topo dos AAP entra em foco ("estressado" imagem).
    3. Além disso, o foco para o fundo do PAA (usando as microesferas como marcadores) e tomar uma imagem (imagem de "fundo"). Nota: A finalidade desta imagem é para registrar a posição z para obter a espessura PAA real em cada posição para cálculos de força de tração, conforme descrito em Resultados representativos.
    4. Depois dessas imagens foram adquiridas em múltiplas posições, misturar suavemente em 220 ul de solução a 10% de Triton-X para remover as células. Microesferas de imagem no topo do SAP em cada posição conforme anteriormente descrito (imagem "nula").

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Resultados

No ensaio invadopodia, invadopodia são tipicamente identificadas por uma co-localização de marcadores como actina e cortactina em estruturas puntiformes dentro do corpo celular (Figura 1). Ambos degradar de forma activa e não-degradante invadopodia pode ser contado e são diferenciados por se estas estruturas são co-localizada com as áreas pretas falta de sinal fluorescente no fibronectina marcada com FITC (Figura 1). Invadopodia são contadas manualmente, e a degradação de ECM por célula...

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Discussão

Apresenta-se um método para a fabricação de PAA que podem ser usados ​​como a base para invadopodia força de tracção e ensaios para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contrácteis. Enquanto PAAs têm sido muito utilizados para analisar os efeitos da rigidez nas células e calcular forças de tração 18,24,27, este protocolo é o primeiro a desenvolver ensaios paralelos baseados em PAAs com os mesmos factores de rigidez para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contráteis em resposta a ...

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Divulgações

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número K25CA143412 (Parekh). Gostaríamos de reconhecer que o apoio adicional foi fornecido pelo Departamento de Otorrinolaringologia. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.

Agradecimentos

Os autores não têm nada a revelar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-AminopropiltrimetoxissilanoSigma-Aldrich281778
Acrilamida (40%)Bio-Rad161-0140
Ácido acrílico NHS ésterSigma-AldrichA8060preparar fresco em capela de exaustão 10 mg/ml em DMSO
Alexa Fluor 546 faloidinaLife TechnologiesA22283também pode usar rodamina
Persulfato de amônioBio-Rad161-0700prepare uma solução fresca a 10% em 1x PBS
Aqua Poly/MountPolysciences18606use 6 gotas para encher micropoços
BIS (2%)Bio-Rad161-0142
Albumina de soro bovinoRPIA30075faça 3% para solução de bloqueio em 1x PBS e armazene em 4 ° C
Lamínulas (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
tubo de diáliseSigma-AldrichD9777pré-equilíbrio em tampão borato por 15 - 30 min
DMEMCellgro10-013-CVuso para fazer meio invadopódios
DMSOSigma-AldrichD8418uso para fazer solução de éster NHS de ácido acrílico
Fator de crescimento epidérmicoVida útil TecnologiasPHG0311uso para fazer invadopodia meio
EtanolPHARMCO-AAPERE200diluir com água ultrapura para 70%
FBSThermo ScientificSH30070.03usar para fazer invadopódios meio
FITCSigma-AldrichF7250proteger da luz
GelatinaPolysciences00639normalmente faça 10 ml de solução de sacarose a 1% / gelatina a 1% em PBS e armazene a 4 ° C (pré-aqueça PBS para dissolver a gelatina facilmente)
Pratos com fundo de vidro (lamínulas de 35 mm)lamínulasMatTekP35G-0-14-C
glutaraldeído não revestido (25%)Polysciences01909diluído com 1x PBS para 0,5%
Anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 633TechnologiesA21050
Fibronectina plasmática humanaLife Technologies33016-015adicione 5 ml de água ultrapura para fazer 1 mg/ml; alíquota em volumes com base no uso para evitar ciclos excessivos de congelamento e descongelamento
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-1use para fazer 10x estoque PBS
Mouse anti-cortactina 4F11 anticorpoEMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-1use para fazer 10x estoque PBS
NaClRPIS23020use para fazer 10x estoque PBS e tampão de borato
NaOH (1 N)Sigma-AldrichS2770diluir com água ultrapura para 0,1 N
Nu-Serum (soro de baixa proteína)BD Biosciences355500use para fazer meio invadopódio
ParaformaldeídoAcros416785000normalmente fazem 10% de estoque em 1x PBS, preparam em capela de exaustão e adicionam alguns ml de NaOH forte para dissolver o paraformaldeído facilmente e, em seguida, trazem de volta ao pH 7,4 com HCl forte)
PBS (estéril)Cellgro21-040-CVuso para cultura de células
RPMI 1640Cellgro10-040-CVuso para fazer meio invadopódio
Borohidreto de sódioSigma-Aldrich452882preparar fresco em capela de exaustão 1 mg/ml em 1x PBS
Metaborato de sódio tetrahidratadoSigma-AldrichS0251use para fazer tampão borato
SacaroseRPIS24060normalmente faça 10 ml de solução de sacarose a 1% / gelatina a 1% em PBS e armazene a 4 ° C (pré-aqueça PBS para dissolver a gelatina facilmente)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA16046faça 10% de estoque em 1x PBS e use como está para remoção de células em ensaio de força de tração ou dilua com 1x PBS para coloração
As são Life

Referências

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572(2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015(2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).

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