Artigo de método

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em

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DOI:

10.3791/52345

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5 de abril de 2015

 , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um método econômico para definir interações químico-genéticas em leveduras em brotamento. A abordagem é construída sobre técnicas fundamentais em biologia molecular de leveduras e é adequada para o interrogatório mecanicista de pequenas e médias coleções de produtos químicos e outros ambientes de mídia.

Resumo

Determinando o modo de acção de produtos químicos bioactivos é de interesse para uma larga gama de académico, farmacêuticos, industriais e cientistas. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de brotamento, é um modelo eucariota para que um conjunto completo de ~ 6000 mutantes de deleção do gene e gene essencial hipomórfico mutantes estão disponíveis comercialmente. Estas colecções de mutantes pode ser usado para detectar interacções químicas sistematicamente-gene, isto é, genes necessários para tolerar um produto químico. Esta informação, por sua vez, comunica com o modo provável de acção do composto. Aqui nós descrevemos um protocolo para a rápida identificação de interações químicas-genética em brotamento da levedura. Demonstramos o método usando o agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tem um mecanismo bem definido de acção. Os nossos resultados mostram que o TRAMP nuclear RNA e de exossoma enzimas de reparação de ADN são necessários para a proliferação na presença de 5-FU, o que é consistente com m anterioricroarray abordagens genéticas baseadas em códigos de barras de produtos químicos e o conhecimento de que 5-FU afeta adversamente o metabolismo de RNA e DNA. Os protocolos de validação necessárias dessas telas de alto rendimento são também descritos.

Introdução

As ferramentas e os recursos disponíveis no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae genéticas permitiram grande escala genômica funcional estudos que fornecem coletivamente uma nova visão sobre como os genes funcionam como redes de cumprir os requisitos de sistemas biológicos. A pedra angular dessas ferramentas foi a criação colaborativa de um conjunto completo de deleções de genes não essenciais de todos os quadros de leitura aberta em levedura 1,2. Uma observação interessante foi que apenas ~ 20% dos genes de levedura são necessários para a viabilidade, quando cultivada como haplóides, sob condições laboratoriais padrão. Isto realça a capacidade de uma célula para o tampão contra perturbações genómicas, através da utilização de vias alternativas biológicas. Mutantes genéticos que sejam viáveis ​​individualmente, mas em combinação letal, sinalizar caminhos biológicos paralelas ligadas ou convergentes e formam redes de interação genéticas que descrevem a função biológica. Com o desenvolvimento do te condicionalalelos mperatura-sensíveis e hipomórfico de genes essenciais da tecnologia não tem sido limitada para o estudo dos genes não essenciais 3,4. Este conceito foi aplicado em escala genômica produzindo um mapa imparcial interação genética que ilustra como os genes envolvidos em processos celulares similares agrupam 5.

Perturbações químicos de redes genéticas deleções de genes imitam (Figura 1) 6. Consultando os compostos inibidores do crescimento contra uma matriz de alta densidade de estirpes de deleção de hipersensibilidade identifica um perfil de interacção química-genético, isto é, uma lista de genes que são necessários para tolerar o stress químico. Como interacções genéticas, telas em larga escala de bibliotecas químicas têm mostrado que os compostos com um modo semelhante de acção de cluster em conjunto 7. Portanto, ao estabelecer o perfil de interação química, genética de um composto o modo de ação pode ser deduzida por comparação com larinteração genética genética e química sintética ge-escala conjuntos de dados de 8,9.

Telas químico-genética em larga escala, onde dezenas de compostos são interrogados, foram realizados ensaios de competição por código de barras. Nesta abordagem, o conjunto reunido de estirpes de deleção é cultivado em massa por várias gerações em um pequeno volume de um meio contendo uma substância química. Uma vez que cada mutante de deleção abriga um código de barras genético único, a viabilidade / crescimento de mutantes individuais dentro da piscina de estirpes de deleção é rastreado por microarray ou de alto rendimento seqüenciamento 10.

Deduzir aptidão monitorando tamanho da colônia de mutantes fisicamente vestiu cultivadas em agar sólido contendo um composto bioativo também é um método eficaz para identificar as interações químicas genético 11,12. Esta abordagem fornece uma alternativa de baixo custo para triagem baseado na competição e é bem adequado para ensaiar pequenas bibliotecas de produtos químicos.Esboçado aqui é uma metodologia simples para a produção de uma lista de interações químicas-genética em S. cerevisiae que não confia em molecular manipulações de biologia ou de infra-estrutura. Ela exige apenas uma coleção de levedura eliminação, um aparelho de pinagem robótico ou manual e software de análise de imagens disponíveis gratuitamente.

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Protocolo

NOTA: O fluxo de trabalho geral deste procedimento é descrito na Figura 2.

1. Determinação da dose de inibição de crescimento

  1. Preparação da cultura de levedura durante a noite
    NOTA: Os meios de crescimento de levedura-extract-peptone dextrose (YEPD) utilizados neste protocolo é uma receita padrão 13.
    1. Expelido BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) as células em uma placa de agar de YEPD e incubar durante 48 horas a 30 ° C ou até formar colónias visíveis.
    2. Prepare a culturas de uma noite inoculando 5 ml de meio líquido YEPD num vaso de cultura estéril com uma única colónia. Incubar durante a noite a 30 ° C com rotação contínua ou agitação. A cultura será tipicamente atingir a saturação da manhã (2 x 10 ~ 8 células / ml).
  2. Preparação ágar sólido contendo doses químicas diferentes
    1. Prepare diversas unidades populacionais deo produto químico a ser testado em 100x a concentração final desejada em um solvente apropriado.
      NOTA: As concentrações eficazes irão depender da natureza da substância, e deve ser determinada empiricamente. Por isso, é aconselhável testar inicialmente uma ampla gama de concentração final, ou seja, a partir de baixo � a alta mM.
    2. Para cada concentração de produto químico a ser testado, alíquota de 3 ml de agar de YEPD fundido a um tubo de cultura em vários estéril. Lugar no 55 ° C banho de água para manter-se de solidificação.
    3. Para cada concentração de produto químico a ser testado adicionar 30 ul do composto a 100x meios fundidos, vortex 2-3 segundos para misturar, e pipeta de 1 ml em cada par de cavidades em duplicado de uma placa de 12 poços. Certifique-se de incluir um veículo único controle. Permitir placas para definir durante a noite à temperatura ambiente. Descarte qualquer mídia extra.
  3. Células se espalham chapeamento
    1. Inocular 10 ml de meio líquido YEPD com 2 ul de uma cultura saturada de levedura, cultivada durante a noite, como no Passo 1.1.2.
    2. Placa de 25 ul de cultura de levedura diluída por poço, espalhe uniformemente com esferas de vidro estéreis ou vara, e permitir que o prato para secar sob uma chama. Incubar a placa a 30 ° C durante 48 h.
    3. Avaliar o crescimento de leveduras (tanto o número total e tamanho de colónias) nas placas. Escolher a uma concentração sub-letal de composto que não iniba o crescimento em mais de 10% -15% para realizar a tela.

2. Systematic Tela Chemical Genetic

  1. Manutenção de supressão-mutante-array (DMA) e Preparação de Fonte Placa
    1. Para uma descrição detalhada sobre a construção de matrizes de mutantes de deleção de stocks de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Uma vez que os mutantes de deleção foram dispostas a uma densidade de 384 colónias por placa, o DMA podem ser armazenados durante vários meses a 4 ° C. Replicar em agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418, como necessário para prevenir crescimento de colónias em cadaoutro.
      NOTA: múltipla repetições em série deve ser evitada para evitar a perda de estirpes de crescimento lento e minimizar o aparecimento de mutantes supressores. Isto é particularmente relevante se a manutenção das coleções como haplóides.
    2. Execute todas as etapas replica-chapeamento usando um microbiana arraying sistema robótico. Alternativamente, manipular colônias utilizando ferramentas manuais vestiu de aprisionamento.
      NOTA: A coleção de levedura eliminação está disponível como haplóides e diplóides de várias fontes comerciais e geralmente é enviado como stocks de glicerol em placas de 96 poços.
  2. Condensação da matriz mutante de deleção
    1. Preparar 250 ml de caldo YEPD meios de agar contendo 200 ug / ml de G418. A concentração eficaz de G418 pode variar e cada lote deve ser testada empiricamente.
    2. Preparar cinco placas de agar de YEPD vertendo 50 ml de agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418 por placa. Faça isso um dia antes da condensação da matriz e permitir que as placas para esfriar à temperatura ambienteratura durante a noite em uma superfície lisa.
      NOTA: Quatro placas serão necessários para a recolha de densidade 1536-deformação, o quinto placa é derramado como um extra.
    3. Remover os pratos de Petri contendo 16 a recolha mutante de deleção, a uma densidade de 384 colónias por placa e deixar vir à temperatura ambiente (~ 1 hora).
    4. Limpe qualquer condensação que se formou sobre a tampa de cada placa usando uma tarefa delicada wipe. Não fazer isso pode resultar em gotas de água que está sendo depositado sobre a matriz e contaminação cruzada de mutantes dispostas.
    5. Usando uma matriz fixando robô microbiana, condensar o DMA de uma densidade de 384 colônias por placa (16 placas de Petri) a 1.536 colônias por placa (4 placas de Petri). Realizar isso para que a 1ª colônia de placa 1 pins para a linha 1 coluna 1 da matriz condensado, o 1º colônia de placa 2 para a linha 1 coluna 2, o 1º colônia de placa 3 a linha 2 e coluna 1, e a colônia 1º de placa 4 a linha 2coluna 2.
    6. Incubar a matriz consolidada a 30 ° C durante a noite.
    7. Examine a matriz para assegurar a transferência uniforme de colônias a partir de placas de origem. Haverá várias posições em branco, propositadamente incorporados na matriz, que servem como guia para assegurar o DMA foi condensada correctamente (Figura 4A).
      NOTA: Estas serão as placas de base para a réplica de placas em meios contendo o composto de teste. A chapa única fonte pode ser usado para várias pinnings. Além disso, muitos robôs terão um recurso de compensação, o que irá garantir um número semelhante de levedura estão sendo transferidos de cada vez.
  3. Placa Replica variedade mutante de deleção
    1. Prepare 700 ml de controle (veículo só) e 700 ml de mídia experimental (contendo química). Isto é suficiente para realizar o ensaio em triplicado (12 placas por condição, além de dois extras).
    2. Despeje 50 ml de agar YEPD contendo substância química de ensaio ou de controlo por placa. Permitir que as placas to esfriar à temperatura ambiente durante a noite em uma superfície lisa.
    3. Usando o robô para placa réplica, o DMA para inocular três conjuntos de placas que contêm produtos químicos com a concentração determinada experimentalmente, bem como três conjuntos de placas contendo o controlo do veículo. Incubar as placas à temperatura ambiente, durante 24-48 h.

3. As placas de imagem e análise de dados

  1. Retirar as placas da incubadora e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (~ 1 hora) antes da imagem. Isso vai evitar a formação de condensação enquanto a imagem das placas.
  2. Placas de imagem em 24 e 48 horas por remover a tampa e colocar o rosto para baixo em um scanner de mesa. Capturar imagens com uma resolução de pelo menos 300 dpi. Como alternativa, use uma câmera digital para capturar imagens. Se fazê-lo, placas lugar enfrentam-se em um fundo escuro e remover as tampas para a imagem.
    NOTA: O formato de arquivo e de posicionamento das placas dependerá do programa de quantificação utilizados.
  3. Execute quantificação e comparação dos tamanhos colônia matriz usando um dos vários programas de código aberto, incluindo Balony 15, SGAtools 16, e ScreenMill 17.

4. Validação de Tela

NOTA: Nesta fase, várias exclusões de leveduras mutantes vai marcar como hipersensibilidade à substância química de interesse. Essas interações químicas-genético deve ser validado junto de duas maneiras. Primeiro a identidade de cepas sensíveis devem ser confirmados por PCR. Em segundo lugar, a sensibilidade química deve ser marcado de forma independente. Descritos abaixo é um breve protocolo para realização de ensaios mancha para validar hipersensibilidade tensão, uma técnica comum em biologia levedura.

  1. Streak fora desejado (hipersensibilidade) mutantes da coleção eliminação fermento em agar YEPD contendo 200 ug / ml de G418. Incubar a 30 ° C até formar colónias. Verifique se o genótipo da estirpe por PCR com primers de diagnóstico de acordo com ao protocolo do fabricante.
  2. Inocular 5 ml de líquido YEPD para cada estirpe e incubar durante a noite a 30 ° C com rotação ou agitação.
  3. Meça OD 600 e diluir cada cepa de DO600 = 1 em dH estéril 2 O. Estes são agora as culturas de levedura normalizados.
  4. Dispensar 100 ul de normalizada levedura do tipo selvagem (BY4741) a cultura bem A1 de uma placa de 96 poços. Dispensar 100 l de até sete estirpes adicionais para poços B1-H1.
  5. Use uma pipeta multicanal para dispensar 90 ul de dH 2 O estéril para poços A2-H2 através A6-H6. Finalmente, preparar uma série de diluições 1:10 de culturas de levedura normalizados. Comece serialmente pipetando 10 ul de coluna 1 para a coluna 2 com um pipetador multicanal, e continuar ao longo da placa de 96 poços até seis diluições são feitas (isto é, 10 0 a 10 -5).
  6. Transferir 2-5 ul de culturas de levedura diluídos em uma grade usando um multicanalpipettor em meios sólidos YEPD contendo controle químico e do veículo. Incubar as placas à temperatura apropriada, durante 24-48 h.
  7. Inspeccionar placas e comparar a sensibilidade de escolha para mutantes química (em relação ao controle BY4741). Placas de imagem às 24 e 48 horas como no passo 3.2.
    NOTA: Embora a identificação de várias cepas de hipersensibilidade com ontologias ou funções de genes relacionados empresta confiança para a validade da tela, a transformação de uma estirpe eliminação hipersensibilidade com um plasmídeo contendo uma cópia do tipo selvagem do gene é necessário para estabelecer formalmente que um gene eliminação de interesse (e não escondidos segundo mutações no local) faz com que a sensibilidade de drogas.

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Resultados

Como uma validação desta abordagem foi realizado um rastreio genético química representativa interacção do agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), seguindo o protocolo descrito acima. 5-FU é conhecido por perturbar a timidilato-sintase, assim como o metabolismo do ADN e ARN 18. As interações químicas genéticos de 5-FU são bem estudados e foram investigados por meio de técnicas de levedura de código de barras de microarranjos utilizando ambas as coleções de deleção heterozigotos e homozigotos 8,1...

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Discussão

Esboçado aqui é uma abordagem para a geração de perfis de interação química-genética. O método é simples: comparando dimensões das colónias de cada estirpe em colecções de deleção de genes completos, na presença e ausência de uma substância química, todos os genes necessários para tolerar uma agressão química são identificados. Análise anotação enriquecimento da lista resultante de estirpes sensíveis pode então ser usada para fornecer uma visão sobre o modo de acção de produtos químicos. Enquanto este protocolo foi otim...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Pesquisa no laboratório CJN é apoiado por subsídios operacionais de NSERC, o Instituto Sociedade Canadense do Câncer Research (CCSRI), eo Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Extrato de leveduraBioBasicG0961Para meios líquidos / sólidos YEPD, adicione a 1% de concentração final (p / v)
Pó de TirptonaBD Biosciences211820Para meios líquidos / sólidos YEPD, adicione a 2% de concentração final (p / v)
Anachemiadextrose31096-380Para meios líquidos/sólidos YEPD, adicione até 2% de concentração final (p/v) — Não autoclave. Prepare a solução estoque a 20%, esterilize com filtro e adicione à mídia após a autoclavagem.
Ágar ABio BasicFB0010Para meios sólidos YEPD adicionar a 2% de concentração final (p / v)
G418AG Scientific Inc.G-1033Prepare 1.000x estoque a 200  mg/ml em dH2O e esterilizar com filtro. 
Placa de 12 poçosGreiner Bio One655180
Tubos de cultura de 5 mlEvergreen Scientific222-2376-080
Placa de Petri de 10 cmVWR25384-302
ROTOR HDASinger Instruments ROT-001robô de fixação de matriz microbiana de alto rendimento
PLUSPLATE© Instrumentos de Cantor de Placa de Petri PLU-001Caixa de 200 pratos
384 Short-Pin RePadSinger Instruments RP-MP-384Caixa de 1.000 almofadas
1536 Short-Pin RePadSinger Instruments RP-MP-1536Caixa de 1.000 pads
Ferramentas alternativas de fixação:
Sistemas Robtic totalmenteautomatizados S& P robóticahttp://www.sprobotics.comVários sistemas automatizados de manuseio de colônias robíticos e de imaginação disponíveis.
Ferramentas de fixação manualV& P Scientifichttp://www.vp-scientific.comFerramentas e acessórios de replicação portáteis. 

Referências

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