Artigo de método

Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

DOI:

10.3791/52351

⸱

10 de janeiro de 2015

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

Neste artigo

Resumo

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Usando ensaios ex vivo otimizados de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), mostramos que uma preparação de produto de tabaco combustível suprime acentuadamente as citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores e a capacidade citolítica de PBMCs efetores. Esses ensaios rápidos podem ser úteis na avaliação do produto e na compreensão dos potenciais efeitos a longo prazo da exposição ao tabaco.

Resumo

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Entre outras alterações fisiopatológicas, a exposição crónica ao fumo do cigarro provoca a inflamação e a supressão imunitária, que têm sido associados ao aumento da susceptibilidade dos fumadores a infecções microbianas e a incidência de tumores. Ex vivo supressão de respostas imunes mediadas por receptores em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) tratadas com constituintes do fumo é uma abordagem atraente para estudar os mecanismos e avaliar os possíveis efeitos a longo prazo da exposição a produtos do tabaco. Aqui, nós optimizado métodos para realizar ensaios ex vivo utilizando PBMC estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano, um receptor-ligando 4 de tipo Toll. Os efeitos do meio condicionado de fumo todo (WS-CM), a preparação de produtos de tabaco combustível (TPP), e nicotina foram investigados sobre a secreção de citocinas e alvo morte celular por PBMC nos ensaios ex vivo. Mostramos que as citocinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, e IL-8 e citocinas intracelulares IFN-47 ;, o TNF-α, e MIP-1α foram suprimidos em PBMC WS-CM-expostos. A função citolítica de PBMC efectoras, conforme determinado por um ensaio de matar células K562 alvo também foi reduzida por exposição a WS-CM; nicotina era minimamente eficaz nestes ensaios. Em resumo, é apresentado um conjunto de ensaios melhorados para avaliar os efeitos de UTEs em ensaios ex vivo, e estes métodos podem ser facilmente adaptados para testar outros produtos de interesse.

Introdução

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Um corpo substancial de pontos de conhecimento para os efeitos adversos para a saúde de tabagismo crônico, incluindo a doença cardiovascular (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e câncer de 1,2. Fumar do cigarro crónica tem sido conhecido por causar inflamação e supressão imune, e estas alterações estão relatados para contribuir para o aumento do risco de infecção microbiana e o cancro em fumadores 3. Estudos in vitro e ex vivo, as técnicas são úteis para elucidar a base molecular dos efeitos patofisiológicos de fumaça de cigarro 4-9 (Tabela 1) e são reconhecidos como importantes ferramentas para orientar a regulamentação emergente de vários produtos do tabaco 10,11.

Por exemplo, nós demonstramos que inflamáveis ​​produtos do tabaco (UTEs), como meio de toda com ar-fumo (WS-CM) e material particulado total (TPM) são muito mais citotóxica e prejudicial paraDNA de UTEs não-combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, foi recentemente informou que UTEs combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, que recentemente informou que UTEs combustíveis causou acentuada imunodepressão. Isto foi demonstrado pela supressão da Toll- como receptores (TLR) -ligands, estimulou a secreção de citocinas, e célula-alvo (K562) matando por PBMC em um modelo ex vivo 14. Dada a importância da inflamação em processos de doença induzida por fumo de cigarro, uma maior optimização das condições de ensaio para avaliar os efeitos imunomoduladores do fumo do cigarro é apresentado no presente relatório.

Os ensaios ex vivo tipicamente medido intracelular e citocinas, bem como a função citolítica das células T citotóxicas e de células K562 NK em ensaios de morte 14 segregada. Os ensaios envolvidos pré-incubação com WS-CM e nicotina e subsequente estimulação de PBMCs com agonistas de TLR durante um período de 3 dias; as leituras finais são realizadas utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) e / ou citometria de fluxo. Utilizamos o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), que se liga a receptores TLR-4 e estimula as CMSPs resultando na produção de citocinas intracelulares e de secreção de citocinas. Além disso a optimização das diversas etapas do ensaio para avaliação dos efeitos imunomoduladores da UTEs, também presentes métodos para isolar as PBMC, ensaios de morte celular, e a quantificação de IL-8. Estes métodos podem ser aplicados para abordar outras questões de pesquisa e mais refinado para avaliar os produtos do tabaco no contexto regulamentar.

Tabela 1. relatos de in vitro e ex vivo Publicado métodos usados ​​para estudar varilus efeitos fisiopatológicos de preparações de produtos de tabaco CS, médio fumaça de cigarro.; CSC, fumaça de cigarro condensado; CSE, cigarro extrato de fumo; ELISA, enzima-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; qPCR, a reação em cadeia da polimerase quantitativa; RT, em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa; TS, fumo de tabaco.

Autor (ano de estudo) Laan et al. (2004) Moodie et al. (2004) Oltmanns et al. (2005) Vayssier (1998) Witherden et al. (2004) Birrell, et al. (2008)
As células usadas Células do endotélio brônquicas humanas (BEAS-2B), neutrófilos humanos Células epiteliais alveolares Humanos (A549) Vias aéreas células musculares lisas Humanos (HASMC) As células U937 premonocytic Humanos, monócitos humanos Alveolares tipo II células epiteliais (ATII) Monocytic HumanoA linha de células (células THP-1), os macrófagos de pulmão humano
TPP usado CSE CSC CSE TS CSE CS
Método usado ELISA, qPCR, migração, mudança electromobility Imuno-química, electroforese, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforese Mudança Gel-mobilidade A microscopia óptica, microscopia eletrônica, eletroforese, ELISA qPCR, ELISA, kit de E-toxate (Sigma), o ensaio de placa de p65 (TransAM), electroforese, vários kits de imunoensaio
Medida IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, a migração Acetiltransferases de histona, desacetilases de histonas, NF-kB, IL-8, pi-kB α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina Proteínas de choque térmico / estresse (HSP / Hsp70), fator de transcrição HF, NF-kB,TNF-α Proteína tensioactiva (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, o TNF-α, IL-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilação de ERK, cJun: ligação de ADN, a glutationa, o p65: ligação de ADN
Resultado final CSE regula negativamente a produção de citocinas por meio de supressão da activação de AP-1. H 2 O 2 e CSC melhorar a acetilação de proteínas histona, diminuir a actividade de histona-desacetilase, diferencialmente regulam a libertação de citocina pró-inflamatória. A fumaça do cigarro pode causar a liberação de IL-8 de HASMC, reforçada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 libertação, a inibição da eotaxina e RANTES por fumaça de cigarro. TS activado fator de transcrição HF, que foi associado com Hsp70 superexpressão e inibição da actividade NFkB e TNF-α liberação vinculativo. Redução ATII níveis de quimiocinas derivadas de células compromisso alveoreparação lar, contribuindo para o cigarro induzida pelo fumo dano alveolar e enfisema. Dados fornecer explicação mecanicista para infecções respiratórias por que os fumantes têm aumentado. Supressão da resposta inata é acompanhada por um aumento na produção de IL-8.

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Protocolo

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NOTA: consentimento informado por escrito para fazer este estudo foi obtido em uma unidade de pesquisa clínica local, sob aprovação IRB, por Boas Práticas Clínicas. Processamento do sangue, o isolamento de PBMC e as outras experiências de cultura de células são realizadas em condições estéreis, utilizando reagentes e fornecimentos microbiologicamente estéreis.

1. Preparação WS-CM

  1. Gerar WS-CM como descrito anteriormente 12.
    1. Prepare WS-CM, passando fumaça de quatro 3R4F cigarros de referência através de Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol usando o seguinte esquema de fumar: 35-60-2, o volume de sopro em ml, intervalo de sopro em segundo, ea duração do sopro no segundo, respectivamente. Cada preparação gera uma amostra de 20 ml.
  2. Tubo (s) etiqueta com data, hora concluída, eo nome e número de cigarros. Armazenar os 500 mL alíquotas a -80 ° C imediatamente após o tabagismo está concluída.
  3. Analise alíquotas de WS congelados-CM Para determinar os níveis de nicotina, nitrosaminas específicas do tabaco, e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, tal como anteriormente descrito 12.

2. Isolamento de PBMC

  1. Coletar sangue fresco de doadores saudáveis ​​(que são não-consumidores de produtos de tabaco) Isolar PBMC de sangue fresco conforme descrito abaixo em uma aprovação separada do Wake Forest Baptist Health IRB 15.
    1. Antes da chegada da bolsa de sangue, possuem uma garrafa de 500 ml, uma tesoura, tampão de isolamento, e salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) pronto em um nível de segurança biológica 2 (BSL-2) cultura de células de capa. Tampão de isolamento deve ser protegido da luz.
    2. Mantenha o saco de sangue de cabeça para baixo e cortar o tubo logo abaixo onde foi preso deixando pelo menos 3 cm de tubagem.
    3. Retire a tampa da garrafa de 500 ml e mantenha o tubo acima da abertura do frasco. Pegue o saco de sangue e inverter para permitir que o sangue flua livremente do saco em tele garrafa até que o saco está vazio. Permitir que o sangue flua para a parede interior da garrafa contra directamente para baixo a fim de evitar a criação de bolhas.
    4. Pour tampão de isolamento para dentro da garrafa a uma proporção de 1: 5 de tampão de isolamento de sangue. Tapar o frasco firmemente e suavemente invertê-lo, a cargo de ponta a ponta, 10 vezes. Deixar o frasco dentro do capuz de cultura de células a incubar com as luzes apagadas, durante 1 h à TA.
    5. A, camada de cor de palha luz vai construir acima do sangue. Remover esta camada usando uma pipeta de 25 ml sorológico em 50 ml tubos cônicos. O valor arrecadado pode variar 50-300 ml, dependendo do assunto que doou sangue.
    6. Centrifugar os tubos a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    7. Aspirar o sobrenadante translúcido, deixando um pelete de cor de sangue escuro. O pellet será solto, mas viscoso.
    8. Pipetar 3 ml de tampão de isolamento em tubos cónicos de 15 ml.
    9. Para ressuspender o sedimento, adicionar 20 ml de DPBS para cada 50 ml de líquido cor de palha recolhidos em step 2.1.5. Vortex para misturar bem, e consolidar o líquido novamente suspensas a partir de vários tubos. Este líquido contém suspenso células sanguíneas.
    10. Com uma pipeta de transferência, a transferência de 5 ml de células sanguíneas em suspensão em 3 ml de tampão de isolamento no passo 2.1.8. Inclinar o tubo cónico de 15 ml que contém a suspensão de células lenta e suavemente para criar duas camadas separadas. Centrifugar os tubos a 400 xg durante 40 min à temperatura ambiente com o mínimo de aceleração e sem travão.
    11. Usar uma pipeta de transferência para remover a camada resultante turva meio (buffy coat) contendo PBMCs em um tubo de 50 ml. Evite desenho outras camadas claras abaixo dela. Transferência não mais do que 25 ml em cada tubo de 50 ml.
    12. Adicionar 25 ml de tampão corrente fria (ou mais para preencher todo o volume restante do tubo de 50 ml) para lavar as células. Centrifuga-se as células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
    13. Ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de corrida. Este contém PBMC. Contar as células e usar immediata ou colocar no gelo para congelar.

3. congelamento e descongelamento do PBMC

  1. Centrifugar as PBMCs que foram recolhidas no passo 2.1.13 durante 10 min a 400 x g.
  2. Encher o recipiente de congelamento com álcool isopropílico acordo com as instruções do fabricante. CUIDADO: O álcool isopropílico é inflamável e altamente tóxico.
  3. Ressuspender o sedimento com meio RPMI 1640 (4 ° C) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esta é meio RPMI 1640 congelação. Ressuspender o sedimento com uma quantidade de meio que irá resultar numa suspensão com cerca de 5 x 10 7 células / ml de congelação. O número de células disponíveis para a congelação irá variar.
  4. Distribuir aliquotas de 1 mL de suspensão de células em tubos criogénicos de 2 ml e colocar os tubos criogénicos de congelação no recipiente. Coloque o recipiente de congelamento com criotubos em freezer a -80 ° C para armazenar O / N e, em seguida, remover os criotubos e transferir para armazenar em umcongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C.
  5. Remover o tubo criogénico de armazenamento criogénico e descongelar rapidamente com agitação suave num banho de água a 37 ° C.
  6. Transferir imediatamente as PBMCs foram descongeladas em tubo criogénico a um tubo de 15 ml com 10 ml de meio RPMI 1640 completo (4 ° C) contendo 10% de FBS, 1% de Pen / Strep e 1% de L-glutamina. O conteúdo do criotubo descongelado deve ser o mais rapidamente possível transferido para obter a viabilidade celular máxima 15.
  7. Centrifuga-se as PBMC a 400 xg durante 10 min.
  8. Ressuspender o sedimento com 5 ml RPMI 1640 completo e contar as células.
  9. Medir a viabilidade celular por meio de métodos estabelecidos, tais como o método de exclusão de azul de tripano. Geralmente a viabilidade celular, com este método é de cerca de 90-95%. As PBMC agora está pronto para usar em experiências.

4. morte celular da Determinação

NOTA: As diluições são listadas aqui para o propósito deste study. As diluições podem ser alteradas em conformidade.

  1. Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 uL / ​​poço, como indicado abaixo.
  2. Diluir WS-CM às seguintes concentrações: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 ug / mL de unidades de equi-nicotina (com base no teor de nicotina no WS-CM) 12.
  3. Diluir nicotina em meio RPMI com as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente.
  4. Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
  5. Para o propósito deste estudo, preparar dois conjuntos de placas como anteriormente. Cobrir as placas e incubar uma placa durante 24 horas e uma placa durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste pontos de tempo que for necessário.
  6. Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
  7. Adicionar 95 ul de tampão de corrida seguido por 5 ul de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para cada poço de um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
  8. Adicione 100 ml de tampão de corrida para tubos de fragmentação. Transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo.
  9. Determinar a percentagem de células 7AAD-positivo utilizando o software de análise de citometria de fluxo.

5. CE 50 Determinação

  1. Os valores de EC50 de WS-CM e nicotina são determinadas por coloração 7AAD-positivo de PBMC.
  2. O valor de EC50 é definido como o ácido clorídrico coneentration à qual 50% das células já não eram viáveis ​​num ensaio de 24 horas, e os valores são expressos como ug de equi-nicotina unidades / ml.
  3. Para as finalidades deste estudo, os valores de EC 50 foram determinados como sendo 1,56 ng / mL e 1,650 ug / ml para o WS-CM e nicotina, respectivamente.

6. As citocinas secretadas

NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade.

  1. Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina.
  2. Diluir nicotina para as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / mL. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente.
  3. Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço.O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
  4. Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e, finalmente, a suspensão de células com 200 ul de tampão de corrida de gelo frio e repetindo o passo de lavagem mais uma vez.
  6. Adicionar 200 ul de meio RPMI completo, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
  7. Adicionar 200 ul de 10 ug / ml de LPS meio a cada poço.
  8. Cobrir a placa e incubar durante 4 h, 24 h, 48 h, ou 72 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste os tempos de incubação, se necessário.
  9. Centrifugar a placa a 300 x g durante 3 min.
  10. Tome 175 mL de sobrenadante de cada bem e guarde em um freezer a -80 ° C para realizar os ensaios em etapas 7 e 8.

7. Cytometric Bead Matriz Assay

  1. Descongelar os sobrenadantes de células preparadas a partir do passo 6.10 e utilização no ensaio de CBA. Realizar o ensaio de matriz de esferas de citometria (CBA), conforme as instruções do fabricante.

8. IL-8 ELISA

  1. Descongelar os sobrenadantes de células do passo 6.10 e utilização no ELISA de IL-8. Realizar o ensaio ELISA, conforme as instruções do fabricante.

9. intracelular Coloração e Citometria de Fluxo

NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade.

  1. Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina.
  2. Na mesma placa, diluir nicotina para as concentrações seguintes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e ambientalmente hazardous.
  3. Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
  4. Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 x g durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
  6. Adicionar 200 ul de meio RPMI completo para a placa, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
  7. Preparar as concentrações de trabalho de 2 ul / ml GolgiPlug e 10 ug / ml de LPS, utilizando meio RPMI completo e adicionar 200 ul a cada poço.
  8. Incubar a placa durante 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  9. No final do passo 9.8, lavar as células com tampão de corrida (4 ° C) e centrifugação a 300xg durante 3 min a 4 ° C.
  10. Adicionar 100 ul de Cytofix a cada poço e incubar durante 20 min a 4 ° C.
  11. Lavam-se as células 3 vezes, conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C.
  12. Adicionar 45 ul de 1x Cytoperm a cada poço seguido por 5 ul de cada um de um dos seguintes anticorpos para cada cavidade: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min.
  13. Lavar as células duas vezes conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) e uma vez com tampão de corrida (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C.
  14. Ressuspender as células com 200 uL de paraformaldeído a 2% (4 ° C). Transferência das células em 12 × 75 mm tubos, e analisar as amostras em citômetro de fluxo. CUIDADO: O paraformaldeído é corrosivo, altamente tóxico e um perigo para a saúde.

10. K562 Ensaio Killing

NOTA: As células devem ser cultivadas K562em cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 com meio RPMI completo até atingirem 80% de confluência antes do ensaio.

  1. Prepare um mM 5 carboxyfluorescein solução éster succinimidyl (CFSE) estoque, adicionando 18 mL de DMSO para o frasco.
  2. Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço para alcançar as unidades de equi-nicotina desejadas ou as concentrações de nicotina para cada poço. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente.
  3. Adicionar 100 ul de PBMC em meio RPMI completo a uma concentração de 1,5 x 10 6 células / poço. O volume total de células com WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
  4. Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Lavam-se as células K562 por adição de 10 ml de DPBS e centrifugar a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
  6. Ressuspender as células com 10 ml de DPBS e contar as células K562.
  7. Prepare CFSE workisolução ng por adição de 1 ml de solução de estoque de CFSE a 1 ml de DPBS.
  8. Adicionar 1 ml de solução de trabalho de CFSE a 1 ml da suspensão de células K562 contendo 1-2 x 10 7 células. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT.
  9. Imediatamente adicionar 200 mL de FBS. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT.
  10. Adicionar 10 ml de meio RPMI completo e centrifugar o tubo a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
  11. Remover o sobrenadante e meio RPMI romper a pelota e ressuspender as células com 10 ml de meio RPMI completo e contar as células K562 marcadas com CFSE.
  12. Lavam-se as CMSPs por centrifugação a placa a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por decantação do líquido. Substituir a tampa e vortex a parte inferior da placa. Adicionar 200 ul de meio RPMI completo e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
  13. Adicionar células K562 marcadas com CFSE, na proporção de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a cada poço da placa de amostra de CMSP e ainda incubate durante 5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  14. Lava-se a mistura de células por centrifugação a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por se eliminar o líquido. Coloque a tampa e vortex a parte inferior da placa.
  15. Adicionar 200 ul de tampão de corrida e repetir o passo de lavagem descrito no passo 10,14 mais uma vez.
  16. Adicionar 95 ul de tampão de corrida, seguido por 5 mL de 7AAD a cada poço para um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
  17. Adicionar 100 ul de tampão de corrida a cada poço e transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo.
  18. Determinar a percentagem de células positivas 7AAD e CFSE-positivos usando software de análise de citometria de fluxo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (quatro amostras do dador). T-teste do aluno entre amostras de controlo tratados e não tratados foi realizada utilizando o software Excel, bem como comparações t-teste para todos os tratamentos com seus controles correspondentes. A significância estatística foi indicada por: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.

Para medir o efeito da exposição a WS-CM e nicotina, as PBMC foram tratadas com diferentes concentraçõ...

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Discussão

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Nós e outros autores demonstraram previamente que o tratamento das PBMC com UTEs suprime a várias respostas, incluindo a expressão e a secreção de citocinas e medidas funcionais, tais como células alvo de matar 14. Os métodos experimentais descritos na obra anterior exigem períodos de incubação mais longos e eram modestas em magnitude 14. Dadas as potenciais aplicações desse modelo atrativo ex vivo para pesquisa básica e aplicada, investigamos se algum dos parâmetros do ensaio nestes ensai...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é financiado pela RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) sob um contrato de investigação em colaboração com a Escola Wake Forest University of Medicine. GL Prasad é um funcionário em tempo integral da RJRT.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de 12 x 75 mmBD Falcon352058
Tubos cônicos de 15 mlCorning430790
Microtubos de 2 ml AxygenMCT-150-CS
3R4F cigarros de referênciaUniv. de Kentucky, Faculdade de Agricultura3R4F
Tubos cônicos de 50 mlCorning430828
frascode 500 mlCorning430282
7AADBD Pharmingen559925
placa de fundo plano de 96 poçosTermo Nunc439454
placas de fundo redondo de 96 poçosBD Falcon353077
Capuz de cultura de célulasCentrífuga Thermo Scientific1300 Series A2
Eppendorf58110R
CFSESondas Moleculares Life TechnologiesC34554
Tubos de clusterCorning4401Nocivo se ingerido, cancerígeno
Cytofix/Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028Inflamável
DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma-AldrichD8418
DPBSLonza17-512F
FBSSigma-AldrichF2442
FCAP ArrayBD Biosciences652099Software analisa dados CBA
Unidade de filtroNalgene156-4020
Citômetro de fluxoBD BiosciencesFACS Canto II8 cores, em Ex 405 e Em 785.
Citômetro de fluxoBD BiosciencesFACS Calibur4 cores em Ex 495 e Em 785.
Software de análise de citometria de fluxoTree StarFlowJo
Recipiente de congelamentoNalgene5100-0001Contém DMSO, irritante
GogliPlugBD Biosciences555029Carcinógeno, irritante, corrosivo
H2SO4Sigma-Aldrich339741
Kitde citocinas inflamatórias humanasBD Biosciences551811
IFN-&gama; V-500 AnticorpoBD Horizon561980sensibilizador de pele
IL-8 ELISA KitR e D SistemasDY208
Tampão de isolamentoIsolymph, CTL Scientific Corp.1114868Líquido inflamável, irritante
Álcool isopropílicoSigma-AldrichW292907
L-GlutaminaGibco Life Technologies25030-081
LPSSigma-AldrichL2630
MIP1-α Anticorpo PEBD Pharmingen554730Toxicidade aguda, oral
MonensinaSigma-AldrichM5273
NaClSigma-AldrichS7653
NicotinaSigma-AldrichN3876Toxicidade aguda, perigo ambiental
ParafilmBemis" M"
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148Inflamável, irritação da pele
Caneta/estreptococoGibco Life Technologies15140-122
RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
Buffer de corridaMACS Running Buffer, Miltenyi Biotech130-091-221
Th1/Th2 CBA KitBD Biosciences551809
TNF-&alfa; Alexa Fluor 488 AnticorpoBioLegend502915
Pipeta de transferênciaFisher Scientific13-711-20
Tris BaseSigma-AldrichT1503

Referências

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