Artigo de método

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

DOI:

10.3791/52358

⸱

10 de janeiro de 2015

 ,  , 
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2), Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA, RWTH Aachen University

Neste artigo

Resumo

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Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Resumo

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A combinação de gravações de patch clamp de dois (ou mais) neurónios sinapticamente acoplados (gravações emparelhados), em preparações de fatias cerebrais agudos com simultânea enchimento biocitina intracelular permite uma análise correlacionada das suas propriedades estruturais e funcionais. Com este método, é possível identificar e caracterizar os neurônios pré e pós-sinápticos pela sua morfologia e padrão de resposta eletrofisiológica. Gravações emparelhadas permitem estudar os padrões de conectividade entre estes neurónios, bem como as propriedades de ambos transmissão sináptica química e eléctrica. Aqui, vamos dar uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para obter gravações emparelhados confiáveis, juntamente com uma ótima recuperação da morfologia neurônio. Vamos descrever como pares de neurônios conectados via sinapses químicas ou junções comunicantes são identificados em preparações fatia cérebro. Vamos delinear como os neurônios são reconstruídos para obter sua morfologia 3D da Dendritic e domínio axonal e como contatos sinápticos são identificadas e localizadas. Também vamos discutir as ressalvas e limitações da técnica de gravação emparelhado, em especial os associados truncations dendríticas e axonais durante a preparação de fatias do cérebro, porque estes afetam fortemente as estimativas de conectividade. No entanto, devido à versatilidade da abordagem gravação emparelhado irá permanecer um instrumento valioso na caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro.

Introdução

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Microcircuitos neuronais entre dois neurônios synaptically acoplados são os blocos de construção de redes de grande escala no cérebro e são as unidades fundamentais do processamento de informações sináptica. Um pré-requisito para a caracterização de tais microcircuitos neuronais é conhecer a morfologia e as propriedades funcionais de ambos os neurónios parceiros pré e pós-sinápticos, o tipo de conexão sináptica (s) e a sua estrutura e mecanismo funcional. No entanto, em muitos estudos de ligações sinápticas, pelo menos, um dos neurónios em um microcircuito não está bem caracterizada. Isto resulta a partir dos protocolos de estimulação relativamente não específicos, muitas vezes utilizados em estudos de conectividade sináptica. Portanto, as propriedades estruturais e funcionais do neurónio pré-sináptico quer não são identificadas em todos ou apenas a um pequeno grau (ou seja, a expressão de proteínas marcadoras etc.). Gravações emparelhados em combinação com coloração intracelular por marcadores such como biocitina, neurobiotin ou corantes fluorescentes são mais adequados para o estudo de pequenas microcircuitos neuronais. Esta técnica permite investigar muitos parâmetros estruturais e funcionais de uma conexão sináptica identificadas morfologicamente, ao mesmo tempo.

Os chamados conexões monosinápticos «unitária» entre dois neurônios têm sido investigados em ambas as regiões cerebrais corticais e subcorticais 10/01 usando preparações fatia agudas. Inicialmente, microeléctrodos afiados foram usadas nestas experiências; mais tarde, a gravação de patch clamp foi utilizada a fim de obter gravações de sinais sinápticos com um nível de ruído mais baixo e uma resolução temporal melhorada.

Um avanço técnico significativo foi o uso de diferencial de infravermelho interferência contraste (IR-DIC) óptica 11-14, uma técnica microscópica que melhorou significativamente a visibilidade e identificação de neurônios na fatia do cérebro, de modo que se tornou possível to de obter gravações de visualmente identificados conexões sinápticas 15-17. Em geral, as gravações emparelhados são feitas em preparações de fatias agudas; só muito poucas publicações são gravações de relatórios disponíveis de neurônios conectados synaptically in vivo 18-20.

A vantagem mais importante das gravações emparelhados é o facto de que uma caracterização funcional pode ser combinada com uma análise morfológica, tanto a luz e electrões nível microscópico (ver por ex., 7,16,21). Após o processamento histoquímica, a morfologia dendrítica e axonal do par neurônio synaptically conectado é rastreado. Subsequentemente, é possível quantificar características morfológicas, tais como comprimento, densidade espacial, orientação, padrão de ramificação, etc. Estes parâmetros podem então proporcionar uma base para a classificação objectiva de uma conexão sináptica específico. Além disso, em contraste com a maioria das outras técnicas utilizadas para estudar connecti neuronaisvidade, emparelhado gravações também permitir a identificação dos contatos sinápticos para conexões sinápticas unitários. Isso pode ser feito diretamente, usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica 16,21-27 ou usando imagens de cálcio 28,29 das espinhas dendríticas. No entanto, com esta última abordagem só excitatório, mas não conexões inibidoras pode ser estudada como requer o influxo de cálcio através dos canais dos receptores pós-sinápticos.

Além de uma análise detalhada da transmissão sináptica em um microcircuito emparelhado gravações neuronais definidas também permitem o estudo das regras de plasticidade sináptica 30,31 ou - em combinação com a aplicação de agonista / antagonista - a modulação da transmissão sináptica por neurotransmissores tais como acetilcolina e 32 adenosina 33.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a Directiva da União Europeia para a Protecção dos Animais, o Animal Welfare Act Alemã (Tierschutzgesetz) e as Diretrizes da Federação de Associação de Ciência Animal Laboratório Europeu.

1. Set-up de Eletrofisiologia

Antes de começar com a gravação emparelhado, um eletrofisiologia set-up tem que ser construído. Um breve esboço como tal set-up é montado é dado abaixo:

  1. Instalar uma tabela anti-vibração em que o microscópio, os manipuladores e todos os outros equipamentos serão colocados.
    NOTA: vibração ou qualquer outra espécie de movimento deve ser tão pequeno quanto possível quando a gravação a partir de conexões sinápticas porque esta requer uma mudança de pipetas (procurando eléctrodo substituído por eléctrodo de gravação).
  2. Coloque uma gaiola de Faraday volta da mesa de anti-vibração para reduzir o ruído elétrico. Conecte todos os equipamentos dentro do ca Faradayge com o aterramento elétrico.
  3. Instale um microscópio com um eixo foco motorizado que se baseia em uma mesa xy motorizada na mesa de anti-vibração de acordo com as orientações do fabricante. Isto permite de forma fiável para mover o microscópio para neurónios que não estão no mesmo campo de visão, como é o caso para as ligações translaminar no neocórtex.
  4. Instalar uma câmera de vídeo na porta da câmera do microscópio e conectá-lo ao analógico e / ou telas digitais para observar a preparação fatia e o movimento de eletrodos. Use uma câmera, que pode ser alternado entre uma imagem de um close-up de baixa e uma ampliação de alta potência para obter uma visão geral e, respectivamente, do par de células neuronais synaptically acoplado. Isto também ajuda a controlar o movimento dos eléctrodos de conexão.
  5. Instalar uma mesa de amostra que contenha uma aposta para a câmara de banho (perfurados em casa a partir de um bloco de perspex) para a preparação fatia do cérebro. Esta tabela amostra não deve ser ligada àmicroscópio, ou seja, deve ser fixado à mesa de ar e do microscópio deve ser manobrável sob ele.
  6. Monte dois (ou mais se necessário) micromanipuladores de alta precisão, que podem ser movidos em todas as três dimensões. Instale patch-clamp pré-amplificador sobre os manipuladores e conectá-los ao amplificador principal.
    NOTA: Se manipuladores adicionais necessários podem ser instalados para, por exemplo, mais de dois pré-amplificadores, eletrodos de estimulação extracelulares, sistemas de distribuição de medicamentos, etc.
  7. Coloque a câmara de banho na tabela do espécime. Instale uma solução de entrada e saída e conectá-los ao sistema de perfusão.
  8. Usar uma bomba peristáltica para manter a perfusão da câmara de registo com fluido cerebrospinal artificial (ACSF; Tabela 1) a um caudal estável de 4 - 6 ml / min para a viabilidade da fatia óptima.
    NOTA: Não exceda este caudal de forma significativa, uma vez que irá resultar em turbulência no ASCF e, portanto, o movimento da fatia.
  9. Instale titulares para a sonda de temperatura e eletrodo terra Ag / AgCl para a mesa de amostra. Isto é necessário para permitir que a sonda e eletrodo para provar o banho na câmara.
  10. Para uma boa visibilidade dos neurônios na preparação fatia usar iluminação infravermelha no microscópio. Isso reduz a difração da luz e, portanto, a desfocagem da imagem. Certifique-se de que o microscópio é equipado com óptica de contraste de interferência diferencial para atingir um "visualização 3D' semelhante. Isso ajudará a remendar neurônios e permitem que atinge os neurônios profundas na fatia (60 m ou mais profundo).
  11. Durante a experiência, manter em fatias de cérebro de uma câmara experimental com uma lamela de vidro na parte inferior. Coloque um 'harpa platina' no topo da fatia para evitar fatias de flutuar. Uma harpa platina é feita a partir de em forma de U, fio de platina achatada com cordas de fio dental colada.
  12. Manter o ACSF perfundir a fatia a uma temperatura de 32 - 35 ° C para assegurar a optcontrole imal de oxigenação e pH. Isto pode ser realizado por aquecimento da solução com um dispositivo Peltier instalado perto da entrada para a câmara de ACSF banho.
    NOTA: Use cobertura ultrafina desliza para que mesmo condensadores microscópio com uma alta abertura numérica e distância de trabalho curta pode ser focado no espécime. Isto é necessário para uma iluminação óptima da fatia.
    Para uma imagem e uma descrição de um eletrofisiologia set-up otimizado para gravações emparelhados na preparação fatia do cérebro ver Figura 4 na Ref. 34.

2. Cérebro Slice Preparação

  1. Ligeiramente anestesiar o animal a partir do qual o tecido cerebral deve ser tomado com isoflurano (concentração final <0,1%).
    NOTA: Outros anestésicos também pode ser usado. O uso do anestésico deve cumprir as recomendações e regras do respectivo comitê animal. Assegure-se sempre que o animal não está irritado ou sob estresse depois de adicionaro anestésico.
  2. Decapitar o animal, abrir o crânio e remover o cérebro tão rapidamente quanto possível, utilizando o procedimento descrito no Refs 34,35..
  3. Transferir o cérebro em solução arrefecida (4 ° C) fluido cerebrospinal artificial arejada com uma mistura de gás carbogénio com 95% de O2 e 5% de CO 2.
  4. Isolar a região do cérebro que devem ser estudados.
    NOTA: Os parâmetros para obter preservação óptima e truncagem mínima de dendritos e axônios dos neurônios pré e pós-sinápticos deve ser determinado com antecedência para cada ligação neuronal e estágio de desenvolvimento sob investigação. Em uma fatia de cérebro optimamente dissecado, o axónio do neurónio pré-sináptico, não é necessária a ser paralelo à superfície da fatia. Em vez disso, eles devem apontar para as fatias com um ângulo raso. A aplica-se para o dendrito apical de neurônios piramidais pós-sinápticos; este deve ser verificado sob o microscópio de luz. Isto é particularmente importante para não local ou tconexões sinápticas ranslaminar, isto é., onde somata pré- e pós-sináptica são mais do que 200 um de distância e a probabilidade de truncamentos dendríticas e axonais é susceptível de ser substancialmente mais elevada do que para ligações locais.
  5. Transferir o cérebro para a câmara de micrótomo. Com base em resultados empíricos, diferentes soluções de corte extracelular são utilizadas, dependendo da idade do animal (ver Quadros 2 e 3; informações úteis também podem ser encontrados sob " http://www.brainslicemethods.com/ ').
  6. Apare o cérebro até a região alvo é visível.
  7. Para obter fatias com uma visibilidade célula boa, corte 300-400 ^ M grossas fatias de cérebro se o animal está madura (> 3 semanas). Se o animal é imaturo (1ª a 2ª semana pós-natal para camundongos e ratos) fatias podem ser cortadas com uma espessura de ~ 600-800 mm, sem prejudicar substancialmente visib celularility.
    NOTA: Isto irá melhorar a estabilidade de fatias "imaturas" e reduzir o número de possíveis truncations de dendrítica de longo alcance e garantias axonal.
  8. Transferir fatias a partir da câmara de micrótomo para uma câmara de incubação com a solução corte arejada com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO 2. Manter as fatias na câmara de incubação durante pelo menos 30 minutos a 1 hora ou à temperatura ambiente ou a ~ 30 ° C, dependendo do tipo de experiência.

3. Emparelhados patch-clamp Gravação e biocitina Filling

Dependendo do tipo de conexão sináptica três abordagens diferentes são usados ​​para encontrar neurônios synaptically acoplados. Se a probabilidade de conexão é baixa (como pode ser esperado para conexões mais excitatórios), proceda da seguinte forma:

  1. Conexões neuronais com uma baixa conectividade
    1. Encha as pipetas com uma solução de remendo interno da composição listadana Tabela 4 Para todas as gravações com a configuração de célula inteira adicionar biocitina a concentrações entre 3 -. 5 mg / ml para a solução interna (pipeta) para se obter bons resultados de coloração para os neurónios pré e pós-sinápticos. Deixe biocitina difusa para dentro da célula durante, pelo menos, de 15 - 30 minutos (dependendo do tamanho do neurónio).
      NOTA: Não adicionar biocitina à solução utilizada nas pipetas 'procurando' mencionados abaixo.
    2. Remendar um neurónio pós-sináptico putativo no modo de célula inteira. Use pipetas de patch com uma haste longa e esguia. Isso facilita a manobrabilidade da pipeta no âmbito do objectivo e reduz artefatos de movimento que podem ocorrer quando o eletrodo é introduzido na fatia.
    3. Então, remendar um potencial neurônio pré-sináptico em uma configuração ligado à célula usando uma 'procura' pipeta pedaço de 8-10 resistência mohms e um diâmetro pequeno ponta. Com estas pipetas estabelecer um patch anexado-cell 'solto'. Fill a 'procura' pipeta com uma solução interna em que K + são substituídos por Na + (Tabela 5), a fim de não despolarizar os neurónios durante procura para uma célula pré-sináptica.
      NOTA: A resistência do selo 'solto' não está na faixa GÊ mas normalmente em torno de 30-300 mohms.
    4. Segure o potencial de membrana sob o selo 'solto' para cerca de -30 a -60 mV no modo braçadeira atual. Em seguida, aplicam-se grandes pulsos de corrente (0,2-2 nA) para eliciar um potencial de acção no potencial da célula pré-sináptica. Observe este potencial de ação como uma pequena spikelet sobre a resposta de tensão.
    5. Defina a frequência de estimulação a 0,1 Hz para evitar run-down de uma resposta pós-sináptica. Use freqüências de estimulação inferiores no caso de o tecido cerebral é muito imaturo ou a conexão sináptica não muito confiável.
    6. No caso de o neurônio "pós-sináptico" não responder à estimulação do testados neu 'pré-sináptico'ron, remendar um novo neurônio em modo 'solto' selo. Não substitua o 'pesquisar' eletrodo remendo enquanto o selo com uma resistência de> 30 mohms é estabelecida. Teste até 30 neurônios pré-sinápticos potencialmente desta forma.
      NOTA: Para evitar a danificação do neurónio durante a pesquisa com o procedimento de fixação de membranas solta, apenas suavemente sucção deve ser aplicado para a pipeta de pesquisa em comparação com a aplicada ao penso pipeta de célula inteira.
    7. Se a estimulação nos modo selo resultados 'soltas' em um EPSP / IPSP com uma latência <5 ms no neurônio pós-sináptico remover o 'pesquisar' pipeta da neurônio pré-sináptico.
    8. Substitua a 'procura' pipeta de patch com um eletrodo de patch preenchido com solução interna regular contendo biocitina. Assegurar esta pipeta remendo gravação tem uma resistência de 4-8 mohms; quanto maior for o tamanho menor será a soma da resistência do eléctrodo pode ser.
    9. Corrija a pré-sinápticoneurônio e registro na célula inteira, o modo atual-clamp. Provocar potenciais de ação por injeção de corrente nos neurônios pré-sinápticos e gravar a resposta pós-sináptica. Armazenar os dados em um computador para análise posterior off-line.
  2. Conexões neuronais com uma conectividade de alta
    NOTA: Para microcircuitos neuronais com uma relação de conectividade de alta (> 30%) utilizam um procedimento diferente para encontrar conexões sinápticas. Este procedimento está descrito a seguir e é frequentemente utilizado para a conexão sináptica inibidora que têm, em média, uma proporção mais elevada do que a conectividade conexões excitatórios 36. Ela não deve ser usado quando o rácio conectividade cai abaixo deste valor.
    1. Remendar um neurónio pré-sináptico directamente no modo de célula inteira. Então, remendar um potencial neurônio pós-sináptico, também no modo de células inteiras. Ambas as células devem estar sob o controle de aperto atual. Eliciar um potencial de acção na célula pré-sináptica. Monitorar o neurônio pós-sináptico prospectivo para uma postsypotencial naptic.
    2. No caso de o neurónio não mostram uma resposta à estimulação pré-sináptico, um remendo neurónios novo no modo de célula completa usando um eléctrodo de adesivo cheio com solução interna regular. Se a conexão for encontrada, não altere a pipeta de patch, mas continuar com a gravação. Em seguida, proceda como no passo 3.1.9.
  3. Conexões neuronais via GAP-junções
    NOTA: Para procurar as ligações eléctricas (gap-junction) use o procedimento a seguir, que é uma versão modificada do que usado para conexões de baixa probabilidade.
    1. Remendar um neurónio pós-sináptico na configuração de fixação de membranas de células inteiras.
    2. Posteriormente, remendar um neurônio pré-sináptico putativo na configuração solta-seal (baixa resistência selo de 30-300 mohms) usando uma 'procura' pipeta pedaço de 7-10 resistência mohms. Esta pipeta deve ser preenchido com a solução interna modificada alta Na + para a estimulação solta-seal.
    3. INJECt 100-300 ms longos pulsos de corrente hiperpolarizantes através do selo 'solto'; o potencial de comando pipeta deve ser definido para cerca de -60 a -70 mV. Observar uma conexão junção gap Se isso resultar de estimulação em uma pequena resposta hiperpolarizante no neurônio 'pós-sináptica.
    4. Repatch o neurónio "pré-sináptica", no modo de célula inteira e proceder como acima descrito.
      NOTA: Para garantir uma boa coloração dos processos axonais e dendríticas, utilize o protocolo dado abaixo. Este protocolo é descrito em breve aqui, no entanto, um protocolo detalhado para processamento histoquímica utilizada no nosso laboratório é dada no Exemplo de Ref. 37.

4. Histochemical Processing

  1. Transferir a fatia de cérebro com o par de neurónios sinapticamente acoplados para um frasco contendo 4% de paraformaldeído dissolvido em tampão fosfato 0,1 M e fixar a fatia durante 24 h. Para a microscopia eletrônica, fixar a fatia usando 2,5% glutaraldeído e 1% de paraformaldeído.
  2. No dia seguinte, transferir as fatias em tampão de fosfato não contendo normais fixador. Lavar as fatias com tampão fosfato para 6 - 8 vezes durante 10 - 15 minutos cada para remover o excesso de fixador.
  3. Incubar durante 20 min fatias em um 3% de H 2 O 2 em solução tampão de fosfato 0,1 M para minimizar a reacção da peroxidase endógena. Observar a formação de bolhas forte. Continuar a reacção até que não haja mais bolhas são produzidos. Em seguida, enxaguar as fatias em tampão fosfato 0,1 M para 6 - 8 vezes (durante 10 min cada) para remover qualquer remanescente H 2 O 2.
  4. Reacções imunocitoquímicos e cromogénicos
    A visualização dos neurónios encheu-biocitina baseia-se numa reacção de peroxidase de rábano biotinilada-estreptavidina catalisada com diaminobenzidina; isso produz um precipitado escuro que produz uma mancha roupas com alta resolução espacial. Os seguintes procedimentos são utilizados para a reacção cromogénica:
    1. Preparar a solução ABC, conforme o protocolo do fabricante. Adicionar a 14,55 ml de tampão de fosfato suplementado com 150 ul de 10% de Triton X100 (Tabela 6; apenas por microscopia de luz) e manter a solução durante cerca de 30 min no escuro. Incubar fatias nesta solução O / N antes do uso.
    2. Incubar fatias em solução ABC num agitador durante 1 hora à temperatura ambiente e no escuro. Subsequentemente, manter fatias O / N a 4 ° C num frigorífico. Na manhã seguinte, as fatias incubar à temperatura ambiente durante uma hora adicional.
    3. Depois disto, enxaguar fatias pelo menos quatro vezes durante 10 minutos cada em tampão de fosfato. Em seguida, incubar num agitador durante cerca de 30 min no escuro em 2 ml de uma solução 3-3'-diaminobenzidina-níquel intensificada (Tabela 7). Tenha muito cuidado ao manusear diaminobenzidina e usar apenas sob o exaustor; é extremamente cancerígeno mesmo em concentrações muito baixas.
    4. Adicionar 6,5 mL de 3% de H 2 O 2 para o contendo diaminobenzidinasolução. Monitorar a reacção cromogénica sob um microscópio de luz até neurônios manchadas marrom-preto são claramente visíveis. Em seguida, parar a reacção por lavagem imediatamente fatias várias vezes em tampão de fosfato.
    5. Fatias Monte com neurônios manchadas em adesivo, Histobond revestido de silano ou extrusadas lâminas objeto padrão.
    6. Mantenha as lâminas em câmara úmida, com, pelo menos, 80% de umidade O / N. No dia seguinte, as fatias de deixar secar ao ar durante mais 10 min. Antes da incorporação, as lâminas de transferência em soluções com concentrações crescentes de etanol (20 - 100%), a fim de desidratar-los.
      NOTA: O processo de desidratação deve ser lento em contrário distorções nos processos dendríticos e axonal é provável que ocorram 37. Se um procedimento alternativo de incorporação é escolhido, por exemplo, um com o Moviol à base de glicerol, uma desidratação não é necessária; no entanto, este é provável que resulte em uma compressão inhomogeneous da fatia e, portanto, uma morpholo neuronal distorcidaGy.
    7. Finalmente, incubar por 10 min em xilol, incorporar as fatias em um meio de incorporação hidrofóbico para microscopia de luz e colocar um lamelas de ultra-finas na parte superior. Deixe lâminas secar durante 20 minutos à temperatura ambiente.

5. Neuronal Reconstrução e Synaptic Contato Localização

  1. Examinar as lâminas com neurónios rotulados-biocitina sob um microscópio de luz equipado com uma objectiva 60X / imersão em óleo de 100X e um condensador com uma elevada abertura numérica para resolução espacial óptima. Certifique-se de que boutons axonal e espinhas dendríticas são claramente visíveis.
  2. Seguir neurônios ou pares de neurônios synaptically acoplado usando um neurônio comercial sistema de rastreamento (ver Tabela de Specific materiais / equipamentos) para obter reconstruções neuronais 3D. Realizar rastreamento manualmente sob inspeção visual constante para detectar até mesmo pequenos axonal ou colaterais dendríticas. Para gravações pareadas de neurônios acoplados synaptically traçado manual ainda é o método deescolha, porque a atribuição de, por exemplo, um perfil axonal, quer o neurônio pré ou pós-sináptica requer experiência reconstrução substancial.
  3. Se necessário, fazer contagens de boutons axonal e / ou espinhas dendríticas. Por causa espinhas ou mesmo subtipos da coluna e boutons axonal pode apresentar uma distribuição e densidade específica em relação à eg, camada cortical ou área, isso pode ajudar a caracterizar os tipos de células neuronais.
  4. Para pares de neurônios acoplados synaptically, verifique o axônio pré-sináptico e pós-sinápticos dendrites para aposições perto com a maior ampliação disponíveis. Observar uma Bouton axonal e uma espinha dendrítica pós-sináptico ou o eixo está no mesmo plano focal pode ser considerado como um contacto sináptico putativo. Marque esse contato na reconstrução.
  5. Corrija as reconstruções neuronais para o encolhimento em todas as três dimensões espaciais na seção apropriada do programa de rastreamento.
    NOTA: Durante a fixação, processamento histoquímicae desidratação deformação mecânica substancial e a contracção ocorrem; isso vai afetar medidas de comprimento axonais e dendríticas e distorcer gravemente o seu arranjo espacial. Fatores de correção contração para o meio de incorporação são ~ 1.1 para direções x e y e ~ 2.1 para a direção z 37.
  6. Para uma análise morfológica quantitativa usar um programa de análise de dados para a neurofisiologia (ver Tabela de Specific materiais / equipamentos).

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Resultados

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Gravações emparelhados são o método de escolha para uma caracterização detalhada das conexões sinápticas uni ou bidirecionais morfologicamente identificadas, bem como a junção da diferença conexões (elétricas) (Figura 1). Um exemplo de uma gravação emparelhado na camada 4 do córtex somatossensorial tambor é mostrado na Figura 1A. Ambos excitatório unidireccional e conexões sinápticas inibidoras pode ser caracterizado (Figura 1B, C). Além disso gravações emparelhadas per...

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Discussão

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Gravações pares de excitatório sinapticamente acoplados e / ou os neurónios inibitórios são uma abordagem muito versátil para o estudo de microcircuitos neuronais. Não só esta abordagem permitem estimar conectividade sináptica entre os tipos de neurônios, mas também permite determinar as características funcionais da conexão e da morfologia dos neurônios pré e pós-sinápticos. Além disso, agonista e / ou antagonista pode ser facilmente aplicado aos neurónios em preparações de fatias. Isto permite estudar os efeitos da ne...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Grupo 'Função dos Microcircuitos Neuronais' do Instituto de Neurociência e Medicina, INM-2, Centro de Pesquisa Jülich e do Grupo 'Função dos Microcircuitos Corticais' do Departamento de Psiquiatria, Psicoterapia e Psicossomática, Faculdade de Medicina, JARA, Universidade RWTH Aachen pelas discussões frutíferas. Este trabalho foi apoiado pelo grupo de pesquisa DFG sobre a função do córtex do barril (BaCoFun).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AmplificadorHEKAEPC 10 USB Triplocom 2 - 3 pré-amplificadores
MicroscópioOlympusBX51WIcom 2 portas de câmera, uma objetiva de 4X e uma objetiva de imersão em água de 40X
CâmeraTILL PhotonicsVX55câmera CCD infravermelha
Estação de trabalhoLuigs & NeumannInfrapatch 240com uma platina x-y motorizada e um eixo de foco motorizado para o microscópio
MicromanipuladorLuigs & Manipuladores NeumannSM-5x-y-z para 2 - 3 pré-amplificadores
Gaiola de FaradayLuigs & Neumann
Mesa antivibraçãoNewport Spectra-Physics
PatchmasterHEKA
Microtome Microm InternationalHM650V
Extrator de micropipetasHEKASutter P-97
Sistema NeurolucidaMicrobrightfieldcom softwares Neurolucida e Neuroexplorer

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
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