Aqui, apresentamos um protocolo sobre como determinar a quantidade e distribuição de metais em uma amostra usando fluorescência de raios X síncrotron. Nós nos concentramos nas células aderentes e descrevemos o método de fixação química para preparar esta amostra. Em seguida, descrevemos como montar e obter imagens da amostra usando raios-X síncrotron.
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Artigo de método
Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de fluorescência de raios-X nos permite medir de forma não destrutiva a distribuição espacial e a concentração de vários elementos simultaneamente em áreas de amostra grandes ou pequenas. Tem sido aplicado em muitas áreas da ciência, incluindo ciência dos materiais, geociências, estudo de obras de patrimônio cultural e biologia química. No caso da biologia química, por exemplo, visualizar as distribuições de metais dentro das células nos permite estudar tanto os íons metálicos que ocorrem naturalmente nas células, quanto os metais introduzidos exogenamente, como drogas e nanopartículas. Devido à natureza totalmente hidratada de quase todas as amostras biológicas, a criofixação seguida de imagem sob temperatura criogênica representa a modalidade de imagem ideal atualmente disponível. No entanto, sob as circunstâncias em que tal combinação não é facilmente acessível ou prática, a fixação química à base de aldeído permanece útil e às vezes inevitável. Este artigo descreve com o máximo de detalhes possível a preparação de células de mamíferos aderentes por fixação química para imagens fluorescentes de raios-X.
Introdução
De raios-X de imagens por fluorescência permite tanto a identidade e quantidade de elementos presentes numa amostra a ser espacialmente resolvido. Incidentes raios-X, de uma energia seleccionada para ser maior do que a energia do elemento mais pesado de interesse de ligação de electrões, ultrapassar a energia de ligação dos electrões de concha interior do núcleo 1. Isso cria um "buraco" na camada de elétrons. Tal como electrões de alta energia cair para estes orifícios, raios-X fluorescentes são emitidos cujo comprimento de onda é dependente da energia de separação dessas orbitais. Uma vez que o espaçamento entre a energia das orbitais é característica de ....
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Protocolo
1. Preparação de instrumentos, substratos, Meios de Cultura e pratos
- Manuseio de nitreto de silício (Si 3 N 4) janelas.
- Abrir a cápsula, apertando ligeiramente uma extremidade que contém a janela de tal modo que não espremer a própria janela, enquanto se rodam a outra extremidade da cápsula com a outra mão.
- Confira um par de reverso, uma pinça de ponta fina, sob lupa para se certificar de que não há adesivas, lacunas ou curvas na ponta. Caso contrário, as janelas podem ser quebrado pelas pinças ou voar fora deles durante as etapas subsequentes.
- Remover a janela a partir da cápsula por cuidadosamente agarra....
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Resultados
A capacidade de imagiologia por fluorescência de raios-X para fornecer informações sobre amostras biológicas depende destas amostras a ser preparada de tal maneira que eles são robustos para os danos da radiação na escala temporal da experiência, e mesmo assim a sua características químicas e estruturais são bem preservada. Ao observar o resultado de uma amostra que tenha sido preparado tal como descrito acima e fotografada, é possível ver que existe uma variação nos elementos presentes - indicando que a fixação preserv.......
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Discussão
Fluorescência de raios X de imagem é útil em muitos campos, incluindo geociências, ciência dos materiais e biologia química 26-34. Avanços no síncrotron de raios-X, e sua focalização, têm produzido muito feixes de alta intensidade. Raio-X Focused vigas suficiente para excitar os metais endógenos em células já existentes, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível silício detector drift. E estudar a biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Stefan Vogt por sua ajuda no ajuste dos dados representativos mostrados neste artigo e discussões úteis. Os autores também agradecem a Chris Jacobsen por seu apoio a Q. J.
O uso da Fonte Avançada de Fótons, linhas de luz 2-ID-E e 8-BM-B, no Laboratório Nacional de Argonne, foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Escritório de Ciências Básicas de Energia, sob o Contrato No. DE-AC02-06CH11357.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Janelas de nitreto de silício | Silson Ltd / J B J Business Park / Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Reino Unido | SiRN-5.0-200-2.0-200. Ordenar por tamanho. Tamanho da membrana: 1,5 mm x 1,5 mm. Espessura: 200 Nm. Tamanho do quadro: 5 mm x 5 mm. Espessura da estrutura: 200 ′ microm. | Fonte alternativa: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA. |
| Pinças reversas | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ligação gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Pinças Ultra Finas |
| Tapete de grade de borracha | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ligação gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Tapete de grade redonda |
| Ácido acético | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | Metais Traços Grau Concentrado Ácido Acético |
| PIPES buffer | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | tampão PIPES sólido |
| Solução de estoque de formaldeído | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ligação gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 ampolas de 10 ml de paraformaldeído aquoso a 20% |
Referências
- Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 6....
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Reimpressões e permissões
