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Artigo de método

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

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DOI:

10.3791/52370

⸱

12 de março de 2015

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo sobre como determinar a quantidade e distribuição de metais em uma amostra usando fluorescência de raios X síncrotron. Nós nos concentramos nas células aderentes e descrevemos o método de fixação química para preparar esta amostra. Em seguida, descrevemos como montar e obter imagens da amostra usando raios-X síncrotron.

Resumo

A imagem de fluorescência de raios-X nos permite medir de forma não destrutiva a distribuição espacial e a concentração de vários elementos simultaneamente em áreas de amostra grandes ou pequenas. Tem sido aplicado em muitas áreas da ciência, incluindo ciência dos materiais, geociências, estudo de obras de patrimônio cultural e biologia química. No caso da biologia química, por exemplo, visualizar as distribuições de metais dentro das células nos permite estudar tanto os íons metálicos que ocorrem naturalmente nas células, quanto os metais introduzidos exogenamente, como drogas e nanopartículas. Devido à natureza totalmente hidratada de quase todas as amostras biológicas, a criofixação seguida de imagem sob temperatura criogênica representa a modalidade de imagem ideal atualmente disponível. No entanto, sob as circunstâncias em que tal combinação não é facilmente acessível ou prática, a fixação química à base de aldeído permanece útil e às vezes inevitável. Este artigo descreve com o máximo de detalhes possível a preparação de células de mamíferos aderentes por fixação química para imagens fluorescentes de raios-X.

Introdução

De raios-X de imagens por fluorescência permite tanto a identidade e quantidade de elementos presentes numa amostra a ser espacialmente resolvido. Incidentes raios-X, de uma energia seleccionada para ser maior do que a energia do elemento mais pesado de interesse de ligação de electrões, ultrapassar a energia de ligação dos electrões de concha interior do núcleo 1. Isso cria um "buraco" na camada de elétrons. Tal como electrões de alta energia cair para estes orifícios, raios-X fluorescentes são emitidos cujo comprimento de onda é dependente da energia de separação dessas orbitais. Uma vez que o espaçamento entre a energia das orbitais é característica de um dado elemento, a emissão de fluorescência de raios-X também tem comprimentos de onda característicos, dependentes do elemento. É esta emissão a um comprimento de onda característico que permite a identificação dos elementos presentes. A calibração da intensidade de fluorescência permite a quantificação dos elementos presentes.

Fluorescência de raios X microscopy (XFM) tornou-se cada vez mais utilizada, em parte devido ao desenvolvimento de fontes de síncrotron de raios-X muito brilhantes, como as que estão em Spring-8 no Japão, o Mecanismo Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) em França, eo Advanced Photon Source ( APS) em os EUA 2. Estas fontes fornecem muito elevado de intensidade de raios-X. Ao mesmo tempo, as melhorias na óptica de raios-X, tal como a tecnologia de placa de zona, permitiu a focagem de feixes para estes pontos de sub-micron, embora bastante ineficiente 3. Com muito feixes de alta intensidade, mesmo uma quantidade relativamente pequena de luz que pode ser focado é suficiente para excitar os metais endógenos nas células, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível detector. Assim, o estudo da biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso de muitos dos desenvolvimentos recentes nesta técnica 4-10.

Há muitos fatores críticos a serem considerados ao appdeitada XFM para investigar a distribuição elementar e quantificação de células de mamíferos em cultura ou outras amostras biológicas. Em primeiro lugar, a amostra tem de ser mantidas intactas, quer estruturalmente quer no que diz respeito à sua composição elementar, em ordem para a medição de ser significativa. Em segundo lugar, a amostra deve ser também preservada de alguma forma de modo que seja resistente aos danos que a radiação pode ser causada por um feixe de raios-X concentrado. Uma maneira que uma amostra pode atender a esses critérios ao mesmo tempo, deve ser rapidamente congelados em um vítreo, gelo amorfo 11,12. Congelação rápida é muitas vezes conseguida através de várias técnicas de criopreservação, como o congelamento de mergulho ou de alta pressão congelamento 13-16. É geralmente aceite que a criopreservação preserva arquitectura celular em geral e composições químicas em amostras biológicas quanto à proximidade estado nativo quanto possível. Fixação química, por outro lado, devido à penetração lenta e selectiva de fixadores em células e tecidos como well alterações posteriores como na permeabilidade da membrana, pode permitir que vários íons celulares especialmente os íons difusíveis, como Cl, Ca e K a ser lixiviados, perdidos ou realocados, tornando assim investigação destes elementos sub�timas 17-19. Apesar da clara vantagem de crio-fixação sobre fixação química em geral, para células de mamíferos aderentes, em particular, a criopreservação tem várias limitações 20-23. A mais óbvia é que nem todo laboratório de pesquisa tem fácil acesso a instrumentos de criopreservação. A maioria dos congeladores alta pressão actuais nem mergulhar congeladores são dispendiosos e de propriedade apenas de um subconjunto de instalações de crio, que pode ser medida a partir de onde as células são incubadas. O benefício de criopreservação pode ser trocado por a desvantagem de estresse viagens colocado sobre as células. Assim, enquanto a criopreservação é certamente a forma mais rigorosa para preservar amostras para análise de fluorescência de raios-X, não é certamente o mais acessível a todos os investigadores em todas as circunstâncias;nem sempre é essencial - se os metais de interesse estão fortemente ligados a macromoléculas fixável, e a resolução na qual a amostra vai ser trabalhada é maior do que o dano para o ultra-microestrutura que pode ocorrer durante a secagem. Ciente das ressalvas 24, fixação química e secagem pode ser uma escolha adequada.

Outros fatores em um raio-X experimento imagens de fluorescência de sucesso incluir uma análise adequada. Fluorescência de raios X de imagem é, fundamentalmente, de raios-X espectroscopia de emissão de fluorescência combinado com raster-digitalização para fornecer resolução espacial. Os espectros de emissão de fluorescência de raios-X recolhidos conter uma combinação de sobreposição de picos de emissão de fundo, e os picos de espalhamento de elásticos e inelásticos do feixe incidente. Software que permite que o de-convolution dessas contribuições e na concepção dos picos de emissão, tem sido um desenvolvimento crítico a esse campo 25. Além disso, o desenvolvimento comercial e distribution de padrões de película fina de composição conhecida e utilizada para calibrar a intensidade da fluorescência em relação à quantidade de material, também tem sido muito importante.

Este protocolo fornece uma descrição da preparação de células aderentes por fixação química e secagem ao ar. Um passo fundamental neste processo é o crescimento das células nas janelas de nitreto de silício, que muitas vezes não aderem bem, fazendo lavagem suave em uma chave de moda especial para o sucesso.

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Protocolo

1. Preparação de instrumentos, substratos, Meios de Cultura e pratos

  1. Manuseio de nitreto de silício (Si 3 N 4) janelas.
    1. Abrir a cápsula, apertando ligeiramente uma extremidade que contém a janela de tal modo que não espremer a própria janela, enquanto se rodam a outra extremidade da cápsula com a outra mão.
    2. Confira um par de reverso, uma pinça de ponta fina, sob lupa para se certificar de que não há adesivas, lacunas ou curvas na ponta. Caso contrário, as janelas podem ser quebrado pelas pinças ou voar fora deles durante as etapas subsequentes.
    3. Remover a janela a partir da cápsula por cuidadosamente agarrar o quadro da janela, com uma pinça, enquanto apertando suavemente a cápsula perto da extremidade aberta da aplicação de pressão numa direcção de modo a tornar a cápsula mais amplo, onde as extremidades da janela precisa de sair.
  2. Janela de pré-lavagem (opcional).
    1. Se desejado, janelas de pré-lavagem por suavemente mergulhando-em água destilada durante 5 segundos, seguido de 2 min de lavagem com etanol a 70% e 2 min de lavagem em etanol a 100%.
  3. Aposição e esterilização janelas na placa de cultura.
    1. Para fixar as janelas, defina a janela com o lado liso para cima, na parte inferior da placa de cultura, coloque um pedaço de fita em uma lâmina de vidro limpa. Corte uma tira de cerca de um quarto de polegada a descer o lado longo da fita. Tome uma fatia de fita fora o lado mais curto (pelo ⅛ "por ¾"), com uma lâmina de barbear limpo.
    2. Utilize uma pinça para aplicar a fatia de fita para a extremidade da grade ou janela. Use o suficiente para aderir-lo de forma segura, sem cobrir a própria abertura da janela. Manipular a fita colada, com uma pinça, defina a janela para baixo para o fundo da placa de cultura. Utilize a ponta da pinça para aderir a fita para o fundo do prato de cultura com firmeza.
    3. Aplicar uma outra tira de fita adesiva para o outro bordo e isso para aderir firmemente a parte inferior com a ponta da pinça.
    4. Uma vez que todas as janelas sãogravadas, esterilizar janelas em placas de cultura com radiação ultravioleta (UV). Realizar isto colocando o prato sob a lâmpada UV numa câmara de fluxo laminar durante cerca de 1 h.
    5. (Opcional) Se as janelas são para ser pré-revestida com poli-lisina, de modo que após a esterilização janela. Brasão da janela com 10 ml de solução estéril de 0,01% de lisina poli-L-1 para hr em um 37 ° C incubadora, e depois enxaguar o restante solução fora com o meio de cultura.
  4. Prepare buffers para lavagem final antes XFM.
    1. Prepare ou um sistema tampão Tris-glicose ou piperazina-N, N'-bis (ácido etanossulfónico) (PIPES) -sacarose tampão isento de quaisquer vestígios de metais, com a osmolalidade e pH equivalente ao tampão salino de fosfato da Dulbecco (D-PBS) sem cálcio e magnésio. Use um desses buffers para lavar células após células são fixadas quimicamente.
      1. Para fazer a solução de Tris-glucose (10 mM Tris, 260 mM de glucose, 9 mM de ácido acético), adicionar 1,4 g de glicose, 36 mg de base Tris e16 ul de ácido acético a 20 ml de água ultrapura. Em seguida, ajustar o volume final para 30 ml com água ultrapura. Não é necessário qualquer ajuste de pH. Armazenar à temperatura ambiente até uma semana.
      2. Para fazer com que os tubos de sacarose (20 TUBOS mM, 200 mM sacarose) adicionar 0,18 g de tubos e 2,0 g de sacarose em 20 ml de água ultrapura e ajustar o pH para 7,4 com pequenas quantidades de ácido acético concentrado. Em seguida, ajustar o volume final para 30 ml com água ultrapura. Armazenar à temperatura ambiente até uma semana.
        Observação: A razão para evitar o uso de PBS no enxaguamento final é que as concentrações de fosfato, cloreto e potássio em PBS são tão alta que possa interferir com XFM se não for completamente removido antes da secagem por ar.
  5. Prepare buffers para revestimento celular.
    1. Prepare ou para levar todos os meios, tais como o meio RPMI 1640, 1x solução de tripsina-EDTA, D-PBS, e quaisquer outros reagentes necessários, como para a linha de células aderentes em particular como seria normalmente feita por passagem das células aderentes de of interesse, e aquecê-los a 37 ° C.

2. chapeamento de Células

  1. Para o prato de cultura esterilizado contendo as janelas, na câmara de fluxo laminar, adicionar suavemente suportes (10 ml para um prato de cultura de 100 milímetros), ao longo do lado do prato de cultura com ele inclinado num ângulo. Evite criar tensão superficial desnecessária ou deixar cair a mídia diretamente na superfície das janelas de nitreto de silício. Como a mídia é adicionada, lentamente aliviar o ângulo de inclinação para revestir a grade e uma janela com a mídia.
  2. Prepare a linha de células aderentes de interesse de forma adequada, trypsinizing ou raspar as células fora das placas, como de costume para passaging a linha celular. Executar qualquer contagem de células, ou de outra preparação necessária antes de aplicar as células à placa fresca.
  3. Adicionar células a placas de cultura com janelas numa densidade celular que é necessário para alcançar tipicamente 50% -70% de confluência dentro de 24-72 h, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de dióxido de carbono.
  4. Observar o crescimento das células, ocasionalmente, usando um microscópio óptico invertido, até a densidade celular desejada (geralmente 50% -70% de confluência) é alcançado.

3. Fixação de Células

  1. Preparar uma solução de paraformaldeído a 4% em STP-D através da diluição de um estoque adquirido (tal como 25% de paraformaldeído) e ajustando o pH para 7,4 com ácido acético (para evitar a adição de sódio em excesso para a amostra).
  2. Quando as células foram cultivadas como desejado, e todas as manchas vitais (tais como Hoescht) foram aplicadas e fotografada, remova a mídia através de aspiração ligeira, inclinando o prato em um ângulo de 45 ° com uma mão, e aspiração, com uma pipeta mão com a outra .
    NOTA: Em vez de mídia de pipetagem passado, uma alternativa é pegar a janela para cima, mergulhe a janela para microtubos com D-PBS duas vezes e, em seguida, colocá-lo em um novo recipiente de cultura com soluções fixadoras de 20 minutos, seguido de dois tempos de lavagem PBS para remover os fixadores residuais. Se este for escolhido, ir dirrectamente para o passo 3.5.
  3. Lavar o prato gentilmente com D-PBS e substituir o líquido retirado imediatamente por adição suavemente a fresco 4% PFA / PBS, mantendo o prato a um ângulo de 45 °, de pipetagem para o lado do prato, e relaxa-se lentamente o ângulo de inclinação para permitir a solução fixadora para cobrir as janelas. Manter as células cobertas com o fixador durante 20 min à temperatura ambiente.
  4. Retirar o líquido por aspiração suave, mais uma vez, como acima, inclinando o prato um pouco e aspirando à mão.
  5. Substituir o líquido removido, adicionando suavemente algumas das PIPES / solução de sacarose, utilizando o método de inclinação e de pipetagem descrito no Passo 3.3.
  6. Repita os passos 3.4 e 3.5.
  7. Prepare os materiais para a secagem.
    1. Reúna toalhas que não soltem fiapos, como Kimwipes, e puxar para fora da caixa, por isso é útil muito rapidamente e facilmente.
    2. Prepare um lugar limpo e não-nível para definir a janela para secar. Definir uma esteira grade de borracha do tipo utilizado em microscopia eletrônica, que tem sulcos assima janela pode ser apoiado em uma das extremidades, enquanto que seque. Isto irá manter a janela de ficar presa à superfície de secagem medida que seca, e drenar todo o tampão restante para o bordo da amostra.
  8. Tweeze cuidadosamente a fita anexada à janela para manter a janela para fora do líquido. Recuperar janelas que saem da fita através da aplicação de uma pequena quantidade de tubos / sacarose para levá-los a flutuar e, em seguida, pegando-os com a pinça reversos.
  9. Cuidadosamente (sem tocar na própria janela) e completamente rebocam qualquer excesso PIPES / sacarose a partir da borda da janela com um Kimwipe. Também a rebocam de volta a área de recuado usando uma dobra arredondada de uma Kimwipe.
    NOTA: A meta é ter tão pouco cristalização de sais ou tampões sobre a superfície da janela que for possível.
  10. Coloque a janela sobre o tapete grid. Certifique-se de que a janela não está deitado no tapete grid, mas apoiado em uma borda (usando os cumes do tapete grid) e tocar tão pouco da gradeesteira possível. Deixe a janela seco.

4. Montagem Sample and Imaging

  1. Uma vez que a amostra tenha secado, verificar a presença de células sobre as janelas usando um microscópio de luz. Execute esta verificação, antes de preparar as amostras para o transporte para um síncrotron.
  2. Embale as janelas para o transporte para o beamline síncrotron hospedar seu experimento. Suavemente apor as janelas com fita de dois lados para uma lâmina de vidro, em seguida, fixar a lâmina de vidro com fita para o fundo de uma placa de Petri de plástico. Tape o prato Petri fechada.
    NOTA: Antes deste ponto, estes passos podem ser realizados em qualquer laboratório típico. Os passos seguintes seriam o melhor feito em uma linha de luz síncrotron.
  3. Retire a fita da janela delicadamente com uma pinça. Use unha polonês, em uma camada fina e uniforme ao longo da borda da janela, para proteger as janelas para um suporte de alumínio fornecido pelos colaboradores beamline no síncrotron.
  4. Insira o suporte de alumínio emuma cinemática de montagem, em seguida, coloque-a na posição no microscópio de raios-X. Monte a amostra num suporte de conectá-lo a estágios motorizados, no interior da câmara de amostra na linha de luz.
  5. Depois de sair de raios-X da área de amostra instrumento microscópio (a gaiola feita de paredes cheias de chumbo), a configuração da digitalização. Usando um software específico de linha de luz, escolher a área apropriada da amostra para fazer a varredura, enquanto visualiza a posição do feixe de raios X sobre a amostra usando uma câmera equipada com um cross-cabelo vídeo e pré-alinhados com uma câmera cintilador downstream.
  6. Escolha a resolução apropriada para a amostra, com base na estimativa do tamanho da menor característica de interesse. For Imaging células de mamíferos de solteiro (~ 20-40 mm de tamanho), use uma resolução de 0,25-0,5 um. Para as áreas de tecidos de imagem, e distinguir camadas de células do outro, use uma resolução de 2-20 mm.
  7. Escolha o tempo de permanência adequado para a amostra, com base na estimativa da quantidade de metal de interesse presente. Para uma verificação rápida visão geral, ou se grandes quantidades de metais estão presentes, use scans voar com tempos de permanência de 30-300 ms por pixel. Se pouco material está presente, ou para medir metais de baixa abundância relativa, use scans passo com tempo de espera de 1-2 segundos por pixel.
  8. Programar as digitalizações em software específico do beamline. Adquirir uma imagem raster-scan. Trabalhar em conjunto com os colaboradores beamline para analisar os dados com o software que irá identificar os picos de energia característicos para cada elemento.

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Resultados

A capacidade de imagiologia por fluorescência de raios-X para fornecer informações sobre amostras biológicas depende destas amostras a ser preparada de tal maneira que eles são robustos para os danos da radiação na escala temporal da experiência, e mesmo assim a sua características químicas e estruturais são bem preservada. Ao observar o resultado de uma amostra que tenha sido preparado tal como descrito acima e fotografada, é possível ver que existe uma variação nos elementos presentes - indicando que a fixação preserv...

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Discussão

Fluorescência de raios X de imagem é útil em muitos campos, incluindo geociências, ciência dos materiais e biologia química 26-34. Avanços no síncrotron de raios-X, e sua focalização, têm produzido muito feixes de alta intensidade. Raio-X Focused vigas suficiente para excitar os metais endógenos em células já existentes, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível silício detector drift. E estudar a biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Stefan Vogt por sua ajuda no ajuste dos dados representativos mostrados neste artigo e discussões úteis. Os autores também agradecem a Chris Jacobsen por seu apoio a Q. J.

O uso da Fonte Avançada de Fótons, linhas de luz 2-ID-E e 8-BM-B, no Laboratório Nacional de Argonne, foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Escritório de Ciências Básicas de Energia, sob o Contrato No. DE-AC02-06CH11357.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Janelas de nitreto de silícioSilson Ltd / J B J Business Park / Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Reino UnidoSiRN-5.0-200-2.0-200. Ordenar por tamanho. Tamanho da membrana: 1,5 mm x 1,5 mm. Espessura: 200  Nm. Tamanho do quadro: 5  mm x 5 mm. Espessura da estrutura: 200 ′ microm.Fonte alternativa: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Pinças reversasElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ligação gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-845078520-5XEMS 5X, NC – Pinças Ultra Finas
Tapete de grade de borrachaElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ligação gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-845071170Tapete de grade redonda
Ácido acéticoSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052338826Metais Traços Grau Concentrado Ácido Acético
PIPES bufferSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052P6757tampão PIPES sólido
Solução de estoque de formaldeídoElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ligação gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450RT 1711310 ampolas de 10 ml de paraformaldeído aquoso a 20%

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