Artigo de método

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

DOI:

10.3791/52385

⸱

28 de fevereiro de 2015

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1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

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Os mosquitos transmissores da malária têm uma série de características epidemiologicamente importantes que só podem ser detectadas usando técnicas moleculares. Utilizando uma plataforma de genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF, desenvolvemos um ensaio para detectar simultaneamente várias características-chave (espécie, resistência a inseticidas, infecção parasitária e escolha do hospedeiro) de vetores da malária.

Resumo

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O complexo de espécies Anopheles gambiae inclui a maior mosquitos transmissores da malária na África. Porque estas espécies são de tal importância médica, várias características são tipicamente caracterizados por meio de ensaios moleculares para auxiliar em estudos epidemiológicos. Essas características incluem a identificação das espécies, resistência a inseticidas, estado de infecção do parasita, e preferência de acolhimento. Dado que as populações do complexo Anopheles gambiae são morfologicamente indistinguíveis, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é tradicionalmente usado para identificar as espécies. Uma vez que a espécie é conhecida, vários ensaios a jusante são rotineiramente realizados para elucidar outras características. Por exemplo, as mutações conhecidas como KDR em um gene par conferir resistência contra o DDT e piretróides. Além disso, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) ou Plasmodium ensaios de PCR de detecção do DNA do parasita são usados ​​para detectar parasitas presentes nos tecidos de mosquito. Por último, uma combinaçãn de PCR e digeridos com enzimas de restrição pode ser utilizado para elucidar preferência hospedeira (por exemplo, humano versus animais de sangue) por rastreio de farinha de sangue para mosquitos de ADN específico do anfitrião. Nós desenvolvemos um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos os ensaios acima mencionados numa única multiplex 33SNPs genotipagem reacção durante 96 ou 384 amostras de cada vez. Porque o MDA inclui vários marcadores para as espécies, a detecção de Plasmodium, e identificação sanguíneo hospedeiro, a probabilidade de gerar falsos positivos ou negativos é muito reduzida a partir de ensaios anteriores que incluem apenas um marcador por traço. Este ensaio robusto e simples pode detectar essas características-chave do mosquito de forma rentável e em uma fração do tempo de ensaios existentes.

Introdução

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Arabiensis Anopheles, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae são os principais vetores responsáveis ​​pela transmissão da malária na África 1. Estas três espécies são morfologicamente indistinguíveis 2 e só pode ser distinguido por testes moleculares 3-9. Além disso, existem muitos ensaios a jusante rotineiramente realizados para auxiliar genética epidemiológicos e populacionais estudos. Estas incluem: (1) um ensaio de genotipagem para ilhas de especiação 10-12, (2) um ensaio de genotipagem reconhecendo SNPs não sinônimas no 1014 th posição do aminoácido códon do gene para (a resistência knock-down, ou kdr, SNP) 13 -18, (3) a detecção de parasitas PCR 19-23, e (4) de triagem para DNA específica do host no intestino médio do mosquito 24,25.

Foi desenvolvido um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos estes ensaios numa única reacção multiplex com o objetivo de umalyzing características epidemiologicamente importantes de vetores da malária em África. O ensaio MDA inclui múltiplos marcadores para a detecção (1) espécie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou outro (nenhum dos três)), (2) a resistência aos inseticidas representada em kdr SNPs (ambos L1014F e L1014S) , (3) a presença de dois grandes parasitas da malária, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) a partir de uma fonte de sangue aviária e seis hospedeiros mamíferos.

Tradicionalmente, estes ensaios foram realizados em reacções em cadeia de polimerase separadas. Quando todos esses ensaios são feitos usando uma plataforma PCR convencional, requer a realização de ensaios de reacção de PCR 10/08 e acompanha os passos de eletroforese em gel. Cada reação individual PCR de preparação para resultados documentando leva 4-5 horas, enquanto o método aqui apresentado MDA leva cerca de 5 horas em sua totalidade. Isto é equivalente a uma economia de 90% em custos de trabalho sozinho. O MDA apresentou aqui custa US $ 5por amostra de genotipagem de todos os 33 SNPs. Isto é consideravelmente mais barato do que as solteiras ensaios baseados em gel de agarose, que custa cerca de US $ 1,50 por amostra. Ensaios que detectam todas as características abrangidas pelo MDA requereria um mínimo de 8-10 ensaios separados baseadas em gel de agarose a um custo de $ 12-15 por amostra. Além disso, o MDA reduz grandemente a possibilidade de gerar uma falsa positiva ou negativa através da utilização de pelo menos três marcadores para cada parasita ou fonte de acolhimento de detecção.

A plataforma que utilizado não está limitado a vetores da malária, mas pode ser utilizado numa ampla variedade de aplicações, tais como a medicina, e medicina veterinária, e biologia de base 26-28. Em profundidade estudos de associação ou de genética de populações estudos envolvendo um grande número (em ordem de 100s) das amostras exigem ensaios rentáveis ​​triagem para múltiplos marcadores simultaneamente. A maioria dos estudos que utilizam dois ou mais ensaios de PCR separadas poderia implementar o MDA para resultados mais rápidos a um custo menor.

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Protocolo

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1. Amplificação por PCR

  1. Misturar todos os iniciadores de PCR (Ver Tabela S1 suplementar) em um microtubo de 1,5 mL. Cada SNP tem dois iniciadores (directo e inverso). Certifique-se de que a concentração de estoque de cada um dos iniciadores de PCR é mantida a 100 uM. Faça a mistura de iniciadores suficiente para 500-1.000 reações para reduzir pipetagem erro e tempo no banco (ver Tabela S2 suplementar). Se desejado, preparar alíquotas de 100-200 reacções por tubo, e armazenar a -20 ° C.
  2. Prepare PCR cocktail como descrito no protocolo do fabricante (Tabela 1). O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%. Vortex o tubo contendo o cocktail de PCR ligeiramente e centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g.
  3. Dispensar 3 ul do cocktail de PCR em cada poço de um não-contornado placa de 96 poços. A pipeta repetidora pode economizar tempo para este processo.
  4. Adicionar 2 ul de DNA genómico adequada de mosquitos em cada poço.
    NOTA: Processo de obtenção de ADN genómico a partir de m tecidos osquito (cabeça / tórax, abdômen ou do corpo inteiro) é descrito em outras literaturas 29-32. Escolha um protocolo de extração de DNA adequado para diferenciar aqueles com Plasmodium no sangue (abdómen) de mosquitos infecciosos (Plasmodium na cabeça / tórax). Normalmente usamos DNA extraído de partes do corpo (cabeça / tórax ou abdômen) de mosquitos, por isso, concentração de DNA varia de 0.05-2ng / l. Embora a entrada de DNA total é menor do que a recomendação do fabricante (5-10ng / rxn), que costuma ter robusto SNP chamadas de 98% das amostras de DNA sem amplificação do genoma inteiro.
  5. Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g.
  6. Usar o seguinte protocolo termociclador para realizar a amplificação por PCR: (1) 94 ° C durante 2 minutos, (2) 94 ° C durante 30 segundos, (3) 56 ° C durante 30 segundos, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir o passo (2) - (4) por 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, 4 ° C e preensão.
_title "> 2. O tratamento da SAP

  1. Preparar a solução de enzima SAP em uma placa de 96 poços (Ver Tabela 2). Processar 96 amostras em uma placa. O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%.
  2. Vortex o tubo de solução de enzima SAP levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul da solução de enzima SAP em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo.
  3. Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Incubar a placa como se segue: (1) 37 ° C durante 40 minutos, (2) 85 ° C durante 5 min, para inactivar a enzima, (3) a 4 ° C preensão. Ao terminar este passo, a placa de armazenar a -20 ° C antes de continuar. Processar a placa armazenado dentro de 2 semanas.

3. SNP Extension

  1. Se a placa de amostra é congelado após o tratamento SAP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir.
  2. Preparar a mistura de extensão do primer (Tabela Suplementar S2). Cada SNP tem uma extension iniciador. Manter a concentração estoque de cada iniciador de extensão em 500 M. Opcionalmente, alíquota de 100-200 reacções por tubo e armazenar a -20 ° C.
  3. Preparar a mistura de extensão como descrito na Tabela 3. O volume de reacção 96 inclui uma saliência de 20%.
  4. Vortex o tubo de extensão cocktail levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul do cocktail de extensão em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo.
  5. Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Thermocycle da placa, como mostrado na Figura 1. Neste momento, proceder à espectrometria de massa ou armazenar a placa à temperatura de -20 ° C até 2 semanas.

4. Condicionado o SNP extensão do produto para otimizar Análise Espectrometria de Massa

  1. Se a placa de amostra é congelado após a extensão SNP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir.
  2. Transferir 15 mg de resina a partir da sua Container na placa covinha usando uma colher alongada. Use o raspador para espalhar resina para os poços da placa de covinha. Varrer o raspador de lado a lado ao longo da placa para espalhar a covinha resina. Verifique se há resina em cada poço.
  3. Raspe o excesso de resina da placa covinha usando o raspador. Deixe que a resina de suporte na placa de ondulação para a, pelo menos, 20 min. Enquanto a resina deixando ficar na placa de ondulação, adicionar 41 ul de água para HPLC a cada poço da placa de amostra.
  4. Delicadamente, coloque a placa de amostra de cabeça para baixo, sobre a placa covinha. Certifique-se de repor a placa de amostra contra o pequeno posto arredondada da placa covinha, que alinha os poços na placa de amostra com os poços da placa covinha.
  5. Segurando a placa de amostra ea placa covinha juntos, lançá-los suavemente sobre modo a resina cai para fora da placa covinha nas cavidades da placa de amostra. Toque na placa covinha de modo a resina cai na placa de amostra. Certifique-se de toda a resina no diplaca mple cai nos poços da placa de amostra. Centrifugar a placa a 3200 xg durante 30 seg.
  6. Girar a placa de amostras num rotor durante 5 min à TA. Rotator deve girar a placa de amostra de 360 ​​° sobre o eixo longitudinal.
  7. Centrifuga-se a amostra na placa de 3.200 xg durante 5 min. Após este passo, armazenar a placa de amostra a -20 ° C até 2 semanas antes de prosseguir para o próximo passo.

5. MALDI-TOF Espectrometria de Massa

  1. Transferir o produto da extensão do SNP condicionado para um bioarray tais como SpectroCHIP conforme as instruções do fabricante. Usamos MassARRAY Nanodispenser para este passo.
  2. Assim que a transferência for concluída, definir a forma como os ensaios e as placas estão a ser criado no banco de dados do ensaio. Nome do ensaio e placas de tal forma que cada placa tem identificador único que liga ao design ensaio específico (Tabela Suplementar S3).
  3. Depois de ensaio e placa foram definidos, adquirir espectros usando um espectrômetro de massa.

6. Análise de Dados

  1. Realizar análise de dados utilizando uma análise em tempo real PCR software de interpretação de dados, como Tipos Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obter dados em formato .xml que contém o layout da amostra, espectrograma de massa para cada bem, as informações marcador incluindo nome, massa esperada para cada variante do SNP correspondente, e qualquer erro ou mensagens de aviso associado a cada reação. Ver Figura 2 para o espectrograma de massa resultante.
  2. Realizar análise do genótipo SNP agrupamento, definindo o limite de detecção (magnitude ou sinal-ruído) e tolerância / variação permitida para cada genótipo. A Figura 3 mostra um exemplo de uma 04707-KDR # 2 clusters genótipo SNP.
  3. Exportar os resultantes chamadas genótipo SNP em um programa de planilha.

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Resultados

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A identificação das espécies:

Os cinco SNPs seguintes juntos identificar três espécies (A. arabiensis coluzzii A. e A. gambiae) (Tabela 4). Se a amostra não é uma das três espécies, os três SNPs (01073-213, 04.679-157 e 10313 -052) não conseguem amplificar.

genótipo kdr para inferir resistência a inseticidas:

A 1014 ° codão do canal de sódio parágrafo te...

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Discussão

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O MDA é composto por cinco etapas principais: amplificação de PCR, fosfatase alcalina de camarão (SAP) de reacção, de extensão SNP, o produto de extensão condicionado, e de matriz assistida por laser de dessorção / ionização - tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa de 33-37. O primeiro passo de amplificação de PCR amplifica ADN que flanqueia cada SNP, de modo que o ADN molde suficiente estará disponível no passo de extensão de SNP. A reação SAP neutraliza dNTPs não utilizados que possam interferir c...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Drs. Anthony Cornel e Laura Norris na UC Davis e Dr. Katharina Kreppel na Universidade de Glasgow para a prestação de espécimes de mosquitos da Tanzânia. Agradecemos Ms. Smita Das e Dr. Douglas Norris da Johns Hopkins School of Public Health para a partilha de amostras de mosquitos da Zâmbia. Agradecemos também o Sr. Lee V. Millon do Laboratório de Genética Veterinária para o treinamento no projeto ensaio. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder R01AI 078.183 e R21AI062929.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MassARRAY Analyzer CompactSequenomMT9MALDI-TOF espectrometria de massa para aplicações genômicas para análise de ácidos nucléicos.
MassARRAY NanodispenserSequenomRS1000Transfere produtos de reação iPLEX concluídos para o
conjunto de reagentes de genotipagem SpectroCHIP iPLEX GoldSequenom10158Reagentes usados para o ensaio iPLEX, incluindo o kit SAP.

Referências

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  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215(2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163(2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112(2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285(2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

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