Artigo de método

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

DOI:

10.3791/52392

⸱

6 de dezembro de 2014

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1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a dissociação rápida não enzimática de fragmentos de tecido humano fresco para avaliação qualitativa e quantitativa de células CD45+ (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Além disso, o sobrenadante obtido do homogeneizado de tecido primário pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

Resumo

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A capacidade das células malignas para evadir o sistema imune, caracterizado por escape do tumor a partir de ambas as respostas imunes inatas e adaptativas, é agora aceite como uma característica importante do cancro. Nossa pesquisa sobre câncer de mama centra-se no papel ativo que os linfócitos tumor infiltrando desempenhar na progressão do tumor e evolução de pacientes. Com esse objetivo, foi desenvolvida uma metodologia para o rápido isolamento de células linfóides intactas de tecidos normais e anormais em um esforço para avaliá-los próximo ao seu estado natal. Homogeneizados preparados utilizando um show Dissociator mecânica tanto maior recuperação e viabilidade celular, preservando a expressão do receptor de superfície em comparação tecidos para enzima-digerida. Além disso, a digestão enzimática do material insolúvel restante não recuperou células adicionais CD45 +, indicando que as medidas quantitativas e qualitativas no homogeneizado primária provável genuinamente refletem infiltrando as subpopulações no fragm tecidoent. As células linfóides em homogenatos estes podem ser facilmente caracterizadas utilizando imunológica (fenótipo, proliferação, etc.) ou molecular (DNA, RNA e / ou proteína) se aproxima. As células CD45 + pode também ser utilizado para a purificação subpopulação, expansão in vitro ou de criopreservação. Um benefício adicional desta abordagem é que o sobrenadante de tecido primário a partir dos homogeneizados podem ser utilizados para caracterizar e comparar as citocinas, quimiocinas e imunoglobulinas, antigénios presentes em tecidos normais e malignos. Este funções de protocolo extremamente bem para tecidos mamários humanos e deve ser aplicável a uma grande variedade de tecidos normais e anormais.

Introdução

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O microambiente tumoral é composto por vários tipos de células, com numerosos estudos mostrando que cada uma delas desempenha papéis distintos e importantes na tumorigênese1,2. Estes incluem, mas não estão limitados a, células imunes infiltrantes, células estromais, células endoteliais e células tumorais3. Estudos ex vivo de linfócitos infiltrantes tumorais (TIL; Células CD45+ ou leucócitos, que são predominantemente linfócitos em tumores de mama) de amostras frescas de tecido humano é dificultado por sua baixa frequência, os pequenos tamanhos de amostra frequentemente disponíveis para pesquisa e o potencial de perda de viabilidade durante a extração. Como as células imunes que se infiltram nos tumores geralmente estão presentes como passageiros e não como residentes permanentes, em geral, elas são mais fáceis de liberar da matriz tecidual.

A dissociação do tecido tumoral, mantendo a integridade celular, é tecnicamente desafiadora e tem sido tradicionalmente realizada usando uma combinação de etapas mecânicas e enzimáticas para preparar suspensões unicelulares4-8. Essa abordagem envolve longos períodos de incubação e está associada a uma redução significativa na viabilidade celular, bem como à perda de receptores de superfície celular por clivagem enzimática. Estudos de citometria de fluxo de alta qualidade que caracterizam o TIL no microambiente tumoral, bem como purificações limpas de subpopulações CD45+ por citometria de fluxo ou grânulos revestidos com anticorpos, são mais difíceis de obter a partir de tecido tumoral digerido por enzima. Além disso, o sobrenadante (SN) do homogeneizado tumoral resultante não é passível de análise posterior, incluindo quantificação de proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, imunoglobulinas ou antígenos tumorais) ou tratamento experimental de células normais, devido ao potencial de degradação de proteínas nas digestões enzimáticas.

Em nossa busca por um método para preparar homogeneizados de células únicas a partir de tecidos mamários [incluindo tecidos mamários tumorais, não tumorais não adjacentes (NANT) e normais (de reduções mamárias)] sem digestão enzimática, testamos uma variedade de técnicas de homogeneização mecânica. Os homogeneizados preparados usando um dissociador mecânico aumentaram a viabilidade celular (2 vezes) e a recuperação celular total (2 vezes), preservando a expressão do receptor de superfície. A digestão enzimática do material insolúvel remanescente não recuperou células CD45+ adicionais, sugerindo que todas foram liberadas no homogeneizado inicial. Assim, essa abordagem rápida e simples permite a avaliação qualitativa e quantitativa das subpopulações CD45+ presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Uma vantagem adicional dessa abordagem é que o SN do homogeneizado inicial (SN do tecido primário) pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

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Protocolo

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NOTA: Todos os espécimes foram adquiridos através de um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Instituto Jules Bordet com consentimento informado por escrito obtido de cada paciente.

1. Preparação do homogenato de tecido

  1. Dissecar tecidos ressecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para a coleta imediata. Tumor, NANT (tomado a maior distância possível do tumor) e fragmentos de tecidos normais são rotineiramente processados ​​dentro de 1-3 horas de excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 utilizando procedimentos de biossegurança padrão para os tecidos humanos. Um diagrama de fluxo do protocolo é ilustrada na Figura 1.
  2. Pesar todos os fragmentos de tecido (normal, NANT e tumorais) e medir o comprimento, largura e altura (comprimento x largura x altura). Este é um passo importante para a posterior normalização de subpopulações de células, RNA extraído, etc.
    NOTE: A gama de tamanho da amostra é de 100 a 10.000 mm3, sem gordura, se possível.
  3. Imprimir o fragmento de tumor numa lâmina de vidro para H & E coloração para verificar se o tecido é realmente parte do tumor.
    1. Faça isso pressionando uma lâmina de microscópio de vidro sobre o fragmento de tumor e aplicar uma leve pressão com os dedos por alguns segundos.
    2. Corrigir o diapositivo com isopropanol durante 2 min, seguido por um passo de lavagem em água. Contracorante o tecido durante 30 segundos com hematoxilina de Mayer.
    3. Lave o slide em seis banhos de água. Mancha em Floxina B 2% por 15 segundos.
    4. Lave em um banho de água, seguido de quatro banhos de isopropanol e terminar com um banho de água.
    5. Incubar em isopropanol, durante 1 min e de drenagem. Limpar em dois banhos de xileno.
    6. Montar com meio de montagem com base xileno. Examinar para a celularidade do tumor (Figura 2).
      NOTA: Principalmente, as células tumorais ficar com o slide impressa - o estroma, linfóide ou adipose células permanecem raramente, deixando espaços entre as células de tumor (Figura 2).
  4. Inserir o fragmento de tecido em um pequeno prato de cultura contendo 1 mL de o, meio de células hematopoiéticas isento de soro quimicamente definido (daqui em diante referido como meio) à temperatura ambiente e corte em pedaços pequenos (~ 1 - 2 mm 2), utilizando um filtro estéril bisturi.
  5. Transfira tudo (fragmentos de tecido + média) para um tubo de Dissociator C mecânica.
  6. Lavar a placa de Petri e bisturi com 2 ml de meio com uma pipeta de Pasteur e adicionar este ao tubo C (volume de meio de dissociação = 3 ml).
  7. Use a A.01 programa Dissociator mecânica para tubos C (o programa mais suave) para homogeneizar os fragmentos de tecido em uma suspensão de células individuais. Colocar o tubo C no aparelho e executa o programa de duas vezes em sucessão (um ciclo = 25 seg).
    NOTA: Este procedimento homogeneização foi estabelecido e validado para o tecido mamário humano, outro tumou ou tecido tipos pode precisar usar um programa diferente e deve ser testado pela primeira vez.
  8. Remover o tubo C do aparelho e decanta-se o homogeneizado directamente para um filtro de células de 40 mm assentado em um tubo de 50 ml. Usando a mesma pipeta de Pasteur, como na etapa 1.6, transferir qualquer líquido remanescente no tubo C para o coador de células.
  9. Transferir o líquido filtrado para um tubo de 15 ml utilizando uma ponta de micropipeta 1 ml. Temporariamente manter o filtro de células e o seu tubo de 50 ml.
  10. Lavar o tubo C com um adicional de 3 ml de meio e transferir este, de novo usando a mesma pipeta de Pasteur, como na etapa 1.6, para o filtro de células ainda sentado no tubo de 50 ml. Esprema um montante máximo do líquido residual preso no tecido unhomogenized para dentro do tubo de 50 ml, movendo-a suavemente ao redor do filtro com uma pipeta Pasteur limpa ou 1 ml dica que é posteriormente jogado fora para evitar a contaminação do fluido.
  11. Coloque o filtro de células de cabeça para baixo em tele tubo original C e enxagua-se com 3 ml de meio de modo que o tecido unhomogenized cai de volta para dentro do tubo C.
  12. Re-homogeneizar como no passo 1.7 para dois ciclos do programa A.01.
  13. Coloque esta segunda homogenato através do filtro de células sentado no tubo de 50 mL, enxaguar o tubo C de novo com 3 mL de meio (tal como no passo 1.10) e de transferência com a pipeta de Pasteur para o coador de células sentado no tubo de 50 ml novo apertando um máximo quantidade de líquido a partir do tecido conjuntivo residual preso no filtro celular.
  14. Neste ponto, um volume de ~ 2,5 ml é no tubo de 15 ml e ~ 9 ml no tubo de 50 ml.

2. Separação do sobrenadante de células e tecidos

  1. Centrifugar os homogeneizados em 15 mL e tubos de 50 ml durante 15 minutos a 600 xg à temperatura ambiente.
  2. Decantar o SN do tubo de 15 ml para um tubo limpo e armazenar temporariamente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primário, NANT ou ti normaisssue SN (volume final de 2,5 ml) é posteriormente clarificada e aliquotadas antes do armazenamento a -80 ° C para futuras análises (ver abaixo).
  3. Descartar o sobrenadante do tubo de 50 ml.
  4. Suavemente ressuspender ambos os peletes de células, num volume final de 1 ml de meio. Resumidamente, em primeiro lugar quebrar suavemente o sedimento de células em ambos os tubos (tocando o tubo sobre uma superfície dura). Ressuspender o sedimento de células soltas no 50 ml com 500 ul de meio e transferir esta suspensão celular para o tubo de 15 ml para ressuspender o sedimento de segundo. Repetir esta etapa uma vez com o segundo 500 ul de meio para a recuperação máxima de células.
  5. Transferir 10 uL da suspensão de células para um pequeno tubo, misturar com 10 ul de azul de tripano (diluição 1: 1) e contar o número de células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro.
    NOTA: Neste ponto, uma fracção da suspensão de células podem também ser analisados ​​por citometria de fluxo para avaliar o tamanho das células, granularidade e se desejado um número limitado de marcadores de subpopulação para mais precise avaliação da distribuição de célula relativa no homogeneizado antes da análise extensiva ou experimentação. Todas as análises por citometria de fluxo incorporar rotulagem CD45 para normalizar as subpopulações.
  6. Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. As células do tumor, NANT, ou tecido normal são agora pronta para purificação adicional ou análise. Estes passos adicionais são melhor quando realizada no mesmo dia que a cirurgia.
    NOTA: Para a análise de citometria de fluxo, mas não de separação de células dos glóbulos vermelhos residuais devem ser lisadas após marcação com anticorpos pela adição de 0,4 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos para a pelete de células, imediatamente vortex durante 1 seg e incubar um mínimo de 10 min a sala temperatura (protegido da luz), antes da análise.

3. Clarificação do sobrenadante Tissue

  1. Centrifugar os tubos de 1,5 ml com SN tecido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  2. Retire com cuidado tele sobrenadante sem tocar ou perturbar o sedimento. Transferir para um tubo limpo (ou tubos), dependendo do número e volume de alíquotas desejados.
  3. Armazenar o sobrenadante a -80 ° C para uso futuro.

4. O sangue do paciente

  1. Recolher uma amostra de sangue de cada paciente como um controlo por venipunctura para dentro de tubos heparinizados o dia antes da cirurgia. Centrifuga-se o sangue a 400 xg durante 10 min a 20 ºC, com o travão para se obter o plasma e um creme leucocitário.
  2. Remover o plasma e esclarecer-o por centrifugação a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alíquotas e armazenamento de plasma a -80 ° C para uso futuro. Diluir o creme leucocitário em meio
  3. Separam-se as células mononucleares utilizando centrifugação em gradiente de padrão de Ficoll-Hypaque antes da análise imediata, isolamento subpopulação, / ARN de extracção de ADN / proteína ou de criopreservação.

5. Citometria de Fluxo

  1. Células etiqueta de acordo com a produçãoinstruções de r, a 4 ° C, protegidos da luz. Lisar as células vermelhas do sangue em suspensões de células a partir de fragmentos de tecido após a marcação de anticorpos por adição de 0,4 ml de tampão de lise de células para a pelete de células.
  2. Vortex imediatamente por 1 segundo e incubar um mínimo de 10 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Passe as células marcadas em um citômetro de fluxo para aquisição de dados, sem lavar.

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Resultados

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A digestão enzimática de fragmentos de tecido, quer com soluções comercialmente disponíveis de dissociação de tecido ou várias misturas de laboratório de colagenase, ADNase e / ou inibidores de hialuronidase, clivar uma grande variedade de receptores na superfície das células. Os nossos estudos, inicialmente centrado sobre as células T CD4 + que infiltram os tumores de mama, foram rapidamente apresentados com um grande problema técnico, devido à clivagem dos receptores de CD4 de superfície utilizando protocol...

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Discussão

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Este estudo descreve um método otimizado para o preparo rápido de homogeneizados normais e malignas do tecido mamário, sem digestão enzimática para classificação subseqüente celular, extração, criopreservação e / ou análise fenotípica de CD45 + subpopulações. O objetivo dessa abordagem experimental é produzir imagens da TIL que refletem de perto seu estado in vivo e compará-los aos tecidos normais com mínima manipulação dos tecidos frescos da sala de cirurgia. Até o momento, o nosso laboratório tem u...

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Divulgações

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Os autores declaram que não existe conflito de interesses.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por doações fromthe Fundo Belga de Pesquisa Científica (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-operação Télévie, Câncer da Bélgica Plan, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson e Fonds Barsy.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GentleMacs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine é um pouco equivalente
Centrífuga 5810 REppendorfou outra centrífuga de mesa padrão
Centrífuga 5417 REppendorfou outra microcentrífuga padrão
Esco Classe II A2 Biossegurança GabineteESCO globalou outro padrão BSL2 capuz
Microscópio invertidoNikon eclipse TS100ou outro microscópio compatível para um hemacitômetro
Bü rker CâmaraMarienfield 640210ou outro hemacitômetro padrão
Navios Citômetro de FluxoBeckman Coulterou outro citômetro de fluxo (8-10 cores recomendadas)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine usa Filcon
Cell Culture DishSarstedt72,710ou outros materiais plásticos não pirogênicos
Bisturi descartávelSwann-Morton0510ou bisturi estéril de uso único padrão
BD Cell Strainer 40 µ mBecton Dickinson734-0002ou outro material plástico não pirogênico
BD Falcon Tube 50 mlBecton Dickinson352070ou outro material plástico não pirogênico
BD Falcon Tube 15 mlBecton Dickinson352097ou outro material plástico não pirogênico
BD FACS Tube 5 mlBecton Dickinson352008ou outro material plástico não pirogênico
Pasteur estéril Pipeta de 5 mlVWR612-1685ou outro material de plástico não pirogénico
Tubo de microfuga de 1,5 mlEppendorf7805-00ou outro material de plástico não pirogénico
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qmeio isento de soro recomendado
Solução salina tamponada com fosfatoLonzaBE17-516Fpadrão fisiológico PBS
Azul de tripanoVWR17942Eou outra mancha vital
VersaLyseBeckman CoulterA09777para experimentos de citometria de fluxo
Viabilidade fixável Dye eFluor 780eBioscience65-0865-14para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD3 FITCBD Biosciences345763para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363para experimentos de
citometria de fluxoanti-CD4 PEBD Biosciences345769para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD4APC Miltenyi Biotec130-091-232para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD8 ECDBeckman Coulter737659para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643para experimentos de citometria de fluxo
anti-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906para experimentos de citometria de fluxo

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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