Artigo de método

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

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DOI:

10.3791/52408

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17 de fevereiro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para gerar uma co-cultura composta por 2 populações neuronais diferentes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são reprogramadas a partir de fibroblastos humanos usando vetores epissómicos. Colônias de iPSCs podem ser observadas 30 dias após o início da reprogramação de fibroblastos. As colônias pluripotentes são colhidas manualmente e cultivadas em meio de indução neural para permitir a diferenciação em células progenitoras neurais (NPCs). As iPSCs se convertem rapidamente em células neuroepiteliais em 1 semana e mantêm a capacidade de se auto-renovar quando mantidas em alta densidade de cultura. Os NPCs primários de camundongos são diferenciados em astrócitos pela exposição a um meio contendo soro por 7 dias e formam uma monocamada sobre a qual os neurônios corticais de rato embrionários do dia 18 (E18) (transfectados com channelrodopsina-2 (ChR2)) são adicionados. Os NPCs humanos marcados com a proteína fluorescente, dímero tandem Tomato (tdTomato), são então semeados na cultura de neurônios astrócitos / corticais no dia seguinte e podem se diferenciar por 28 a 35 dias. Demonstramos que esse sistema forma conexões sinápticas entre neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais, evidentes a partir de um aumento na frequência das correntes sinápticas após a fotoestimulação dos neurônios corticais. Este sistema de co-cultura fornece uma nova plataforma para avaliar a capacidade dos neurônios derivados de iPSC de criar conexões sinápticas com outras populações neuronais.

Introdução

Nos últimos anos, a nossa compreensão do neurônio e função do circuito neuronal foram revolucionou por várias ferramentas Optogenetic que controlam a excitabilidade neuronal. Uma dessas ferramentas é o canal de cátions ativado por luz, channelrhodopsin-2 (ChR2): neurônios que expressam ChR2 potenciais de ação fogo em resposta à estimulação de luz 1-3. Porque os neurónios não são normalmente sensíveis à luz, esta capacidade notável abre novos caminhos para o controlo temporal e espacial exacta da actividade de populações geneticamente definidas de neurónios 4 e tem estudos da função cerebral grandemente acelerada. ChR2 foi aplicada a investigação em células estaminais para fins diferentes, de acompanhamento do desenvolvimento neuronal 5 a atividade de redes neurais 6 regulação.

Aqui usamos ChR2 para aumentar a utilidade de um sistema de co-cultura neuronal. Sistemas de co-cultura permitir a avaliação das interações entre os diferentes tipos de células.Co-culturas de neurónios e células da glia, os principais tipos de células do sistema nervoso, são comumente usados ​​para investigar a sinalização entre estes tipos de células diferentes, bem como para avaliar a significância do presente sinalização para respostas fisiológicas, a propagação de danos e para examinar o mecanismos moleculares que estão potencialmente envolvidos no presente sinalização 7. Um estudo prévio revelou que iPSCs humanos diferenciar-se em neurónios muito rapidamente na presença de meio de cultura contendo os neurónios corticais de rato primários, astrócitos, oligodendrócitos, microglia e 8.

Neste protocolo, demonstramos um método que utiliza ChR2 em um sistema de co-cultura para interrogar conexões sinápticas entre os neurônios e neurônios corticais de rato derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos). Nós descrevemos etapas para dissecar e colheita tecidos cerebrais 9, bem como para manter e diferenciar as células progenitoras neurais de rato (NPCs) em astrócitos e NPCs humanos intO neurónios para criar o sistema de co-cultura. Para estabelecer este sistema de co-cultura, foi utilizado o método de reprogramação sem integração descrito por Okita et al. 10 para gerar iPSCs humanos. Estes foram, em seguida, de forma eficiente iPSCs diferenciadas em NPCs em condições quimicamente definidas utilizando inibidores de moléculas pequenas, tal como descrito por Li et al. 11

Na co-culturas, as diferentes populações de neurónios podem ser identificados através de detecção de expressão ChR2 em neurónios corticais e de marcação de neurónios iPSC derivados através da proteína fluorescente, em tandem dímero de tomate (tdTomato). Combinando registos electrofisiolicos de neurónios iPSC derivados com fotoestimulação optogenetic dos neurónios corticais permite avaliar a capacidade destes dois tipos de neurónios para formar circuitos uns com os outros. Especificamente, fotoestimulação de ChR2 expressando neurônios corticais evocar respostas sinápticas em neurônios iPSC derivados que se formaram circuitos sinápticoscom a rede de neurônios corticais photostimulated. Nós demonstramos que o aumento correntes pós-sinápticos são realmente detectado em neurônios iPSC derivados sob tais condições. Este protocolo permite a avaliação de circuitos sináptica sob uma variedade de condições experimentais, incluindo recapitulação dos diferentes modelos de doenças neurológicas usando iPSCs derivadas a partir de fibroblastos de pacientes com a doença.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos são realizados de acordo com protocolos aprovados pelo cuidado e uso Comitê de animal Institucional da SingHealth.

1. A colheita precoce pós-natal mouse Brains

  1. Antes de dissecção, preparar o hipocampo solução digestão do tecido: papaína 10 ul por Solução Salina Equilibrada de 1 mL 1x de Earle (EBSS) (+ 1% de HEPES) com Desoxirribonuclease I (ADNase I) (250 U / ml) e Dispase II (1 L / ml). Adicione cerca de 2,5 ml da solução de digestão do tecido e filtrá-la usando uma unidade de filtro de 0.20 mm. Manter a solução quente a 37 ° C até à sua utilização.
  2. Anestesiar o pós-natais dia 5 (P5) filhotes de rato, colocando-os em gelo por 5 min. Retire do gelo e de teste para reflex dor via toe ou cauda pitada. Pulverizar os filhotes com 70% de etanol. Decapitar os filhotes e coloque as cabeças em uma placa de Petri com gelo.
  3. Realizar uma incisão na pele ao longo da linha mediana, a partir da base do crânio para o nariz, com um par de pequenas scissors ou fórceps de dissecação finos. Destaque a pele e fazer uma incisão semelhante através do crânio. Fazer dois cortes horizontais suplementares em cada lado do crânio, uma rostral (no bregma) e um caudal (no lambda).
  4. Peel abrir o crânio, ao longo das linhas de incisão para expor o cérebro subjacente. Utilizar um par de fórceps para remover o crânio que recobre os bulbos olfativos, e qualquer osso linha média entre elas. Faça isso, mantendo a cabeça estável, com uma pinça na mão não-dissecação.
  5. Aliviar a parte plana de uma espátula entre a parte ventral do cérebro e da base do crânio, na extremidade caudal. Mantendo a espátula paralelo à base do crânio, sob o cérebro, movê-lo no sentido da extremidade rostral do crânio para cortar quaisquer adesões entre o cérebro e da base do crânio.
    1. Colher o cérebro para fora com a espátula e coloca-se uma placa de Petri contendo gelada 1x EBSS (+ 1% de HEPES). Mantenha tecidos submersas em todos os momentos.
  6. Para todosetapas micro-dissecção, trabalho sob um microscópio de dissecação e usar um par de pinças de dissecação finas em cada mão, uma para corte de tecidos, e outra para segurar o tecido estável.
  7. Faça um corte imediatamente posterior ao córtex cerebral para separá-lo do cérebro posterior. O corte ao longo da linha média para separar o córtex cerebral nos seus dois hemisférios. Retire as meninges dos hemisférios cerebrais.
  8. Coloque um hemisfério lado medial e inserir a pinça no ventrículo lateral por baixo do hipocampo. Corte o mesencéfalo.
    1. Faça cortes nas extremidades superior e inferior do hipocampo, e perto da junção córtex denteado / entorrinal para isolar o hipocampo do córtex. Recolhe-se o hipocampo em um prato contendo gelada 1x EBSS (+ 1% de HEPES).

2. Hippocampal Dissociation Tissue

  1. Transferir o hipocampo para um prato que contém a solução de pré-aquecido a digestão de tecido de hipocampo. Mince tele tecidos do hipocampo para tão fina quanto possível e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  2. Suavemente dissociar tecidos em células individuais por células de pipetagem e de transferência mecânicos para um tubo de centrífuga de 15 ml.
  3. Centrifugar a 200 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  4. Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de 0,5x Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) contendo sacarose (0,9 M) e centrifugar a 200 xg durante 10 min.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio de manutenção NPC (Tabela 1), colocado no topo de 10 ml de 4% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em solução 1X de EBSS e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  6. Remover o sobrenadante e adicionar o meio de manutenção NPC rato (Tabela 1) ao sedimento de células. Pipeta suavemente para cima e para baixo 5-10 vezes para assegurar a pelete de células é dividida em células individuais.
  7. Transferir meio contendo as células em placas pré-revestidas de Matrigel e adicionar o factor de crescimento epidérmico (EGF) e fibroblafactor de crescimento de r 2 (FGF2) (ambos de 20 ng / ml) em heparina (5 mg / ml). Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2.

3. Manutenção de Adherent Rato Hippocampal NPCs

  1. Preparar as placas revestidas / frascos, pelo menos, uma hora antes da passagem em ratinho NPCs hipocampo. Adicionar Matrigel suficiente para cobrir a área de superfície de cada placa ou frasco e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Remova a mídia da 90% confluente rato culturas NPC e lavar uma vez com 1x tampão fosfato (PBS), em seguida, aspirar PBS off.
  3. Adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços / frascos e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  4. Certifique-se de que todas as células têm destacado por olhar sob um microscópio de campo claro invertida em aumento de 10x. Se ainda houver células ligadas, incubar vaso de cultura durante mais 1-2 minutos e verifique novamente as células. Adicionar o dobro da quantidade de modificação F-12 Nutrient Mixture Eagle Medium / Ham Dulbecco (DMEM / F-12)que como solução de separação celular aos poços / frascos uma vez que todas as células têm destacado.
  5. Transferir DMEM / F-12 contendo células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de manutenção de rato NPC (Tabela 1). Pipeta suavemente para cima e para baixo para quebrar agregado de células em células individuais.
  7. Placa de um terço do total de células em cultura nova poços / frascos e top-se meio de cultura suficiente suplementadas com EGF e FGF2. Incubar vasos de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2. Reabastecer médio a cada dois dias e dividir células 1: 3 a cada 3 a 4 dias. Evitar o crescimento excessivo de culturas rato NPC para evitar a agregação e desapego.

4. Diferenciação de Rato NPCs em astrócitos

  1. Prepare poli-L-lisina (PLL) / laminina revestido 12 milímetros óculos cobrir, pelo menos um dia de antecedência antes de iniciar a diferenciação dos NPCs do mouse em astrócitos. Adicionar coverslips em uma placa de 24 poços e cobrir toda a área de superfície de poços com suficiente PLL (1 mg / ml em tampão borato).
    1. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, retire PLL e lavar uma vez com 1x PBS.
  2. Adicionar laminina (1 mg / ml em DMEM frio de gelo / F-12), mais uma vez que cobre toda a área da superfície de cada poço, depois incubar durante pelo menos 4 horas a 37 ° C.
  3. Remova a mídia a partir de culturas de NPC do mouse e lavar uma vez com 1x PBS, em seguida, aspirar PBS off.
  4. Adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços / frascos e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  5. Certifique-se de que todas as células têm destacado em seguida, adicione o dobro da quantidade de DMEM / F-12 como a de solução desprendimento de células para os poços / frascos.
  6. Transferir DMEM / F-12 contendo células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  7. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio de diferenciação de astrócitos (Tabela 1). Gentilmente suspensio célula pipetan cima e para baixo para quebrar agregado de células em células individuais. Contar o número de células individuais com um hemocitómetro.
  8. As células em placas a 5 x 10 4 células / cm2 em 500 ul de meio para cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. Substituir metade do meio com meio fresco a cada segundo dia. Rato NPCs diferenciar rapidamente em astrócitos prazo de 2 dias e são diferenciados por uma semana antes de iniciar novos experimentos.

5. colheita embrionárias de rato Brains e Cortical Dissociation Tissue

  1. Remover meio de diferenciação de astrócitos (Tabela 1) a partir de culturas de astrócitos e substitua com meio de neurónios primários (Tabela 1), pelo menos, 4 horas antes do início da colheita de cérebros de ratos embrionários.
  2. Antes de dissecção, preparar a solução de digestão do tecido cortical: 10 ul por 1 ml de papaína 1x EBSS (+ 1% de HEPES), com 12,1 mg / ml de L-cisteína. Adicione cerca de 20,5 ml da solução de digestão do tecido e filtrá-la usando uma unidade de 0.20 mm filtro. Manter a solução quente a 37 ° C até à sua utilização.
  3. Eutanásia da barragem grávida por asfixia dióxido de carbono utilizando gás comprimido. Teste para reflex dor via toe ou cauda pitada.
  4. Coloque o lado ventral animais acima em um pano absorvente e absorver a sua área abdominal com etanol 70%. Comprima a pele com um par de pinças e fazer uma incisão lateral com um par de tesouras cirúrgicas, suficientemente larga para expor o abdómen. Segure o peritônio com a pinça e cortar abrir a cavidade abdominal.
  5. Levante o corno uterino com a pinça e corte-o livre ao longo da mesométrio. Coloque o útero dissecado em uma placa de Petri com gelo. Separa-se cada embrião cortando o tecido uterino entre eles.
    1. Realizar uma incisão no saco embrionário. Gentilmente desembolsar o feto através da abertura. Decapitar o feto e colocar a cabeça em uma placa de Petri com gelo.
  6. Para colher embryonic cérebros de ratos, siga a descrição das etapas 1,3-1,5.
    1. Para dissecar tecidos corticais, coloque um hemisfério cerebral lateral, virada para cima. Corte o hemisfério em dois lateralmente a partir do meio. Descartar a metade mais próxima da base do cérebro. Apare o tecido extirpado para remover o mesencéfalo.
  7. Transfira os tecidos corticais a um prato que contém a solução de pré-aquecido a digestão do tecido cortical. Picar os tecidos corticais tão fina quanto possível e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  8. Transferir os tecidos corticais a partir de solução de digestão de tecido para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 10 ml de meio primário neurónio pré-aquecido (Tabela 1). Dissociar os tecidos corticais por pipetagens repetidas los cima e para baixo em uma pipeta sorológica, até que uma solução homogénea, sem pedaços de tecido é obtido.
  9. Passe a solução de tecido através de um filtro de células 70 um para filtrar os restantes aglomerados de tecido. Alíquota da solução de tecido em 15 mltubos de centrífuga, adicionando cerca de 3 ml em cada tubo.
  10. Adicionar 800 uL de 7,5% de BSA em PBS 1x a parte inferior de cada tubo, formando duas camadas de tecido com a solução no topo e na parte inferior de BSA.
  11. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, aspirando a partir da interface das duas camadas. Evitar perturbar o sedimento de células na parte inferior do tubo.
  12. Ressuspender cada pelete de células em 1 ml de meio de neurónios primários (Tabela 1) e combiná-los num tubo de centrífuga de 15 ml. Determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro.

6. Eletroporação e chapeamento de Primary neurônios corticais

NOTA: A transferência de genes pode ser conseguida utilizando vários métodos, incluindo electroporação, transfecção com fosfato de cálcio e transdução virai. Neste protocolo, descrevemos eletroporação para entregar ChR2 construir em neurônios corticais primárias.

  1. Centrifugar 6 x 10 6 de rato neurónios corticais umt 200 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Pelo menos 6 x 10 6 neurónios corticais são necessários para electroporação para assegurar a formação de uma rede neuronal por neurónios sobreviventes.
  2. Adicione 100 ml de solução de eletroporação para a célula pellet e ressuspender delicadamente. Combinar 100 ul da suspensão de células com 6 ug de plenti-sinapsina-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmídeo e transferência para uma cuvete certificada. Evitar a produção de bolhas de ar durante a transferência.
  3. Selecionar e aplicar programa apropriado para eletroporação de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Após a electroporação, adicionar 500 ul de MEM de suspensão de células / ADN para a cuvete. Transfira a amostra em 11,5 mL de meio de neurónios primários (Tabela 1) e ressuspender cuidadosamente. A quantidade total do material é suficiente para toda uma placa de 24 poços. Aliquota de 500 ul de meio para cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO 2.

7. Geração de pluripotentes induzidas Células-Tronco

NOTA:. Este método foi adaptado de Okita et al 10

  1. Culturas de fibroblastos humanos em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em placas de 6 poços.
  2. Antes de iniciar a reprogramação de fibroblastos, revestimento 6-poços com Matrigel e incubar durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Em 80% de confluência, remova a mídia da cultura de fibroblastos e lavar uma vez com 1x PBS.
  3. Adicionar suficiente 0,25% de tripsina-EDTA para cobrir toda a placa e incubar a 37 ° C durante 10 min.
  4. Uma vez que as células foram desalojadas dos poços, adicionar duas vezes a quantidade de meio DMEM com FBS a 10% que a de tripsina para extinguir a digestão de tripsina. Gentilmente pipeta de células em suspensão cima e para baixo para quebrar células. Contar o número de células individuais com um hemocitómetro.
  5. Transferência de 7 x 10 5 células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a suspensão de células a 200 xg durante 5min.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento de células em solução de electroporação. Electroporate os fibroblastos de acordo com as instruções do fabricante. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de electroporação e adicionar 1 ug de cada vector episómico. Células electroporate com configurações de 1.650 V, 10 ms e 3 pulsos de tempo.
  7. Suspensão de células de transferência em DMEM suplementado com FBS a 10% e a placa de 5 x 10 4 culas por po de uma placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  8. Após 48 horas, remover a mídia de cultura de fibroblastos transfectadas e coloque meio mTeSR. Substitua meios de cultura diariamente até células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) colônias estão prontos para ser isolado. IPSC colónias pode ser observada depois de 28-35 dias.
  9. Quando pronto para isolamento, cortado mecanicamente uma colónia iPSC e propagar novamente em meio mTeSR com 10 uM de Rho-associated protein quinase (ROCK) inibidor (Y-27632) sobre um revestimento de Matrigel placa de 6 poços 12. Substituir meio de cultura diária.

8. Neural indução e manutenção de NPCs Humanos

NOTA:. Este método foi descrito por Li et al, 11

  1. Quando as culturas iPSC são em torno de 20% de confluência, remova o meio mTeSR e substituir por meio de indução neural (Tabela 1). Reabastecer médio a cada segundo dia.
  2. Após 7 dias, retire meio de indução neural e coloque meio humano manutenção NPC (Tabela 1). Reabastecer médio a cada dois dias até 7 dias antes passaging culturas.
  3. Antes passaging culturas, placas de revestimento / frascos com Matrigel à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora.
  4. Remova a mídia da confluentes culturas NPC humanos e lavar uma vez com 1x PBS, em seguida, aspirar PBS off.
  5. Adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços incubar durante 5 min a 37 ° C.
  6. Certifique-se de que todas as células têm destacado. Adicionar o dobro da quantidade de DMEM /F-12 como a da solução de separação de células para os poços / frascos.
  7. Transferir DMEM / F-12 contendo células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  8. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio de manutenção humana NPC (Tabela 1). Gentilmente pipeta de células em suspensão cima e para baixo para quebrar células.
  9. Placa de um terço do total de células em cultura Matrigel revestidos poços / frascos e top up médio suficiente suplementado com 10 mM Y-27632. Incubar vasos de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2.
    1. Culturas de divisão 1: 3 a cada 3 a 4 dias e reabastecer meio todos os outros dias. Manter culturas NPC humanos em alta densidade para evitar diferenciação.

9. Diferenciação de NPCs Humanos em neurônios em co-culturas

  1. Adicione o vetor de lentivírus Synapsin1-tdTomato à cultura NPC humano antes de iniciar a diferenciação em neurônios. Prepare astrocyte / neurônio cortical co-culturasum dia de antecedência antes de diferenciar NPCs humanos.
  2. Lavar as culturas NPC humanos uma vez com PBS 1x e adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços / frascos depois incubar durante 5 min a 37 ° C.
  3. Certifique-se de que todas as células têm destacado. Adicionar duas vezes a quantidade de DMEM / F-12 como a da solução de separação de células para os poços / frascos. Transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  4. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio de diferenciação neuronal (Tabela 1). Gentilmente pipeta de células em suspensão cima e para baixo para quebrar pellet celular em células individuais. Contar o número de células individuais com um hemocitómetro.
  5. Aspirar cuidadosamente meio de astrócitos / culturas de neurônios corticais. Placa NPCs humanos a 5 x 10 3 células / cm2 em 500 ul de meio de diferenciação neuronal (Quadro 1) suplementado com 10 ^ M Y-27632 para cada um de 24 poços. Delicadamente, adicionar meio contendo NPCs humanos em cada poçopara evitar incomodar os astrócitos e neurônios corticais.
  6. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. Substituir metade do meio com meio fresco a cada dois a três dias para, pelo menos, 28 dias.

10. As gravações eletrofisiológicas de neurônios iPSC derivadas

  1. Confirme se iPSCs humanos se comportam como neurônios maduros.
    1. Encontre células diferenciadas de iPSCs humanos por visualização de tdTomato usando um microscópio confocal vertical equipado com um 60X (0,9 NA) lente de imersão em água.
    2. Puxar a gravação pipeta para uma resistência de 4 a 6 células M. perfundir à temperatura ambiente em uma solução externa (Tabela 1) borbulhado constantemente com 95% de O2 / 5% de CO 2. Encher a micropipeta com uma solução de gravação interno (Tabela 1).
    3. Remendo tdTomato + celular no modo de células inteiras e ação registro potencial de queima em resposta a injeção de corrente (1 seg de duração, 10 incrementos PA) em curaluguel de grampo.
  2. Confirme se o potencial das células corticais que expressam ChR2 ação é evocado de forma confiável por estímulo luminoso.
    1. Encontre células corticais que expressam ChR2 pela visualização do GFP sob um microscópio confocal. Execute de célula inteira gravação patch clamp em células corticais seguindo os passos 10.1.2 a 10.1.3.
    2. Potencial de seleção ação é evocado de forma confiável por iluminação de luz com lâmpada de arco de mercúrio (100 W). O comprimento de onda do filtro de excitação é 480/40 nm.
  3. Realizar estimulação optogenetic.
    1. TdTomato remendo + célula no modo de célula inteira e definir voltage clamp em -70mV. Filtro de sinais de corrente em 2 kHz e digitalizar a 10 kHz. Monitorar resistências série que variam de 10 a 20 M para a consistência durante as gravações.
    2. Estimular a campo inteiro por 100 W filtro lâmpada de mercúrio com 480/40 nm de excitação durante 30 segundos.
    3. Correntes pós-sinápticos Grave (CSP) da célula remendada induzida por fotoestimulação de ChR2 expressando cor pré-sinápticoneurônios ticos. Detectar e medir unidades de atendimento. Definir limite de amplitude e área de correntes em 5 pA e 20 pc, respectivamente. Inspecionar manualmente esses eventos para descartar quaisquer vestígios não-PSC.

Resultados

Aqui, um protocolo descrevendo os vários passos envolvidos na geração de uma co-cultura consistindo astrócitos, os neurónios corticais e neurónios humanos é ilustrado. IPSCs humano foram obtidas através da reprogramação de fibroblastos utilizando vectores epissomais 10 e especificada na linhagem neural com um cocktail de inibidores de moléculas pequenas, tornando NPCs 11 que foram mantidas a uma densidade elevada (Figura 1A). Vários passos são necessários para gerar a co-cultura: diferenciação dos NPCs do mouse em astrócitos, chapeamento de neurônios corticais de ratos que expressam ChR2, e semeadura de NPCs humanos marcados com tdTomato (Figura 1B). No dia 2 de diferenciação, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) + astrócitos podem ser facilmente observadas nas nossas culturas (Figura 1C). Rato NPCs foram deixadas diferenciar durante pelo menos uma semana antes do plaqueamento neurónios corticais que expressam ChR2 sobre a monocamada de astrócitos (Figura 1D). Após 34 semanas de diferenciação NPC humano, tdTomato + neurónios foram detectados nas culturas (Figura 1E).

Este sistema de co-cultura permite a detecção de correntes coerentes de neurónios pós-sinápticos iPSC derivados individuais em resposta à estimulação luminosa (Figura 2A). Quando estimulada por luz, potenciais de acção foram gerados em neurónios corticais que expressam ChR2 (Figura 2B). iPSC-neurónios derivados também são excitáveis ​​(Figura 2C), que mostra o aumento da acção de disparo potencial como a amplitude de despolarização impulsos de corrente foi aumentada (Figura 2D). Assim, estas células exibem propriedades neuronais maduros. Na ausência de luz, os neurónios derivados de iPSC recebido entradas sinápticas espontâneas (Figura 2E). Estas correntes dentro pós-sinápticos foram predominantemente mediado por receptores AMPA, porque as correntes através de receptores GABA seria ida e receptores NMDA não carregam uma correnteta segurando potencial de -70 mV. Pelo menos alguns desses insumos eram de neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2, porque a estimulação de luz aumentou consideravelmente a frequência das correntes pós-sinápticos (Figura 2E). O tempo de este aumento na entrada sináptica é mostrado na Figura 2F: fotoestimulação dos neurônios corticais foi sustentado ao longo do 30 seg longo luz do flash. Embora a frequência das unidades de atendimento foi elevada quando ChR2 expressando neurônios corticais foram photostimulated (Figura 2G), a sua amplitude não foi afetada (Figura 2H). Em resumo, estes resultados indicam que os neurônios iPSC derivados exibiu propriedades neuronais maduras e poderia formar conexões sinápticas com neurônios corticais pré-sinápticos.

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Figura 1: diagramas esquemáticos para a geração de co-cultura(A) Timeline sistema. para a reprogramação fibroblastos humanos em iPSCs e indução neural para NPCs. (B) Timeline para diferenciação terminal de NPCs humanos em neurônios maduros sobre corticais neurônios e astrócitos culturas. (C) rato NPCs diferenciar rapidamente em GFAP + astrócitos após 2 dias in vitro. (D) Após uma semana, os neurónios corticais que expressam ChR2 foram plaqueadas em astrócitos GFAP +. (E) com 4 a 5 semanas após a diferenciação de NPCs humanos, registos electrofisiolicos foram efectuados em tdTomato + neurónios. Barras de escala representam 100 um.

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Figura 2: Análise Optogenetic de conectividade sináptica funcional. (A) derivado de células iPSC marcados com tdTomato (vermelho) foram co-cultivadas com os neurónios corticais que expressa o activado pela luzcanal, ChR2 (verde). Gravações de neurônios iPSC derivados revelou atuais (PSC) respostas pós-sinápticos, o que poderia vir de qualquer neurônios corticais ou outros neurônios iPSC derivados. (B) Iluminação (barra azul) provocou uma série de potenciais de ação em neurônios corticais que expressam ChR2. ( células C) iPSC derivados são evocadas por injecção de corrente. (D) Firing vs curva de corrente de células iPSC derivados. (E) fotoestimulação dos neurônios corticais ChR2 expressando (barra azul) aumentou a freqüência de unidades de atendimento em neurônios iPSC derivadas . Claro que (F) Hora do aumento na freqüência PSC produzido por fotoestimulação. Barra azul indica o tempo de fotoestimulação. (G, H) Enquanto frequência CPS foi aumentada por fotoestimulação (G), a amplitude do PSC não foi afectada (H). * Indica p <0,05 comparado com o controlo com o teste t de estudante.

Discussão

Optogenética fornece precisão temporal e espacial para a ativação de populações de neurônios 13. Em nossos experimentos, todo o campo da objetiva do microscópio foi iluminado por 30 s para foto-estimular apenas neurônios corticais que expressam ChR2. Isso nos permitiu determinar se conexões sinápticas foram formados entre diferentes populações de neurônios dentro do co-cultura. Nossos resultados revelaram que fotoestimulação aumenta freqüência PSC em neurônios iPSC derivados, o que demonstra que esses neurônios recebem a entrada sináptica dos neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2. Este, por sua vez, demonstrado que os neurónios iPSC derivados incorporados com sucesso em circuitos com os neurónios corticais.

Existem vários passos críticos para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que as culturas de astrócitos de rato NPC-derivados são saudáveis, com a morte celular mínima, antes de prosseguir com chapeamentode outros tipos de células. Os neurônios corticais e NPCs humanos atribuem bem em astrócitos saudáveis ​​e registros eletrofisiológicos dependem fortemente das condições de cultivo. As outras etapas fundamentais neste protocolo são a eletroporação e chapeamento de neurônios corticais em culturas de astrócitos. Como um grande número de células morrem após a electroporação, é importante para assegurar que, pelo menos, 6 milhões de neurónios corticais são electroporadas para placas com as culturas de astrócitos em placas de 24 poços. Temos observado que, quando menos do que 6 milhões de células foram electroporadas, o número de neurónios que sobrevivem não formar uma rede neuronal densa, que afectou registos electrofisiolicos. O número de neurônios corticais eletroporados também deve ser consistente para cada experimento co-cultura para permitir a comparação entre os diferentes estudos. Para todas as etapas que envolvem a digestão enzimática, é essencial para não deixar as células em solução digestivo durante muito tempo, pois pode levar à morte da célula.

Esteabordagem pode ser utilizada para rastrear a capacidade de neurónios derivados de fibroblastos específicos do paciente para formar contactos sinápticos com outros neurónios. Os neurónios derivados de fibroblastos de pacientes que sofrem da perturbação do neurodesenvolvimento síndrome de Rett (RTT) apresentam defeitos de transmissão sináptica: RTT neurónios apresentam uma redução significativa na frequência e amplitude de PSC comparada com os neurónios saudáveis, presumivelmente devido à menor conectividade sináptica 14. Nosso sistema de co-cultura permite o exame dos efeitos da droga sobre os neurônios que apresentam defeitos de desenvolvimento. Isto pode ser realizado por meio de adição de compostos de interesse durante a semeadura de NPCs humanos doentes, bem como durante a exposição contínua a compostos ao longo do tempo de diferenciação neuronal.

Embora este sistema de co-cultura pode também ser utilizada como um modelo para o teste da droga, uma limitação desta abordagem é que o processo de investigar os efeitos de cada composto candidato pode ser longo e tedioso quantonão é um método de rastreio de alto rendimento. Após o tratamento com compostos candidatos, os neurónios derivados de iPSC tem que ser corrigido individualmente para determinar os efeitos de cada composto sobre PSCs. Além disso, atualmente há não muitos fibroblastos disponíveis e iPSCs de pacientes. Portanto, será de interesse em um futuro próximo para ter mais células do paciente e também para adaptar este protocolo para triagem de alto rendimento. Por exemplo, por marcação de neurónios iPSC derivados com um indicador de actividade, tais como sensores geneticamente codificados de iões, ou o potencial de membrana, seria possível aumentar a taxa de produção substancialmente pelo procedimento electrofisiológico demorado-pisar lado. Como todo o processo de gerar este sistema de co-cultura, a partir de fibroblastos de reprogramação para executar registos electrofisiolicos, requer mais do que 90 dias, recomenda-se que tanto os iPSCs humanos ou NPCs ser expandida, após a reprogramação e etapas de indução neural respectivamente,e criopreservadas para reduzir o tempo necessário para experiências futuras.

Em nossos experimentos, nós expressamos ChR2 em neurônios corticais sob o promotor synapsin1. Porque este promotor é pan-neuronal, que presumivelmente foram photostimulating ambos os neurônios corticais inibitórios e excitatórios. Se o objectivo de experiências futuras é interrogar especificamente circuitos ou inibitórios ou excitatórios, promotores mais específicos podem ser usados. Como alternativa, os neurônios corticais poderia ser obtido a partir de transgênicos (ou injetada-virus ratos) onde a expressão ChR2 é especificamente orientada para as subpopulações geneticamente definidos de neurônios. Por exemplo, os tecidos corticais colheita de um rato que tem Cre recombinase expressa em interneurons contendo parvalbumina (Interneurônios PV) que é cruzada com um mouse com floxed ChR2 renderá uma situação em que os únicos neurônios corticais que expressam ChR2 será interneurons PV 15. O uso de tais ChR2-expressando interneurónios no nosso pedido co-cuLTURE sistema permitirá a determinação de se um neurônio iPSC derivado remendada é capaz de incorporar em um circuito com interneurons PV.

Com base em um estudo anterior 9, os neurônios corticais são maduros com sobreposição de dendrites após 14 dias in vitro. Assim, se fotoestimulação não desencadeia uma resposta de um neurónio iPSC derivado de patched, deve indicar que o neurónio não tem a capacidade para fazer ligações sinápticas com neurónios corticais. Um neurônio iPSC derivada é capaz de receber a entrada sináptica ou de outros neurônios iPSC derivados ou neurônios corticais. Se foram utilizadas gravações de sujeição do emplastro tradicional, não seria possível distinguir onde a entrada sináptica é proveniente. A vantagem do nosso sistema é que as respostas pós-sinápticos de entrada presynaptic cortical pode ser evocado seletivamente e identificados. Os procedimentos descritos aqui fornecer uma abordagem simples para avaliar a capacidade dos neurônios iPSC derivados de integrarnuma rede neuronal definido.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos K. Deisseroth e S. Je para as construções de lentivírus ChR2 e Synapsin1-tdTomato respectivamente, C. Chai para a partilha de conhecimentos e na geração de protocolo iPSC, WY Leong para o suporte técnico, membros do laboratório Goh para reagentes e experiência de compartilhamento. Este trabalho foi financiado pela Abbott Nutrition e do Centro Acadêmico de Excelência (ACE) prêmio de pesquisa da GlaxoSmithKline (GSK) para ELG, pela Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura no âmbito do seu Programa de Pesquisa Competitiva (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) para ELG e GJA, e pelo Instituto de Classe Mundial (WCI) Programa da Fundação Nacional da Coreia Pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia (MEST) (NRF Grant Number: WCI 2009-003) para GJA

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Proliferação Neurocult (Mouse)STEMCELL Technologies5702Contém NSC Basal Medium e NSC Suplemento
de Proliferação Epi5 Episomal iPSC Kit de ReprogramaçãoInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Meio NeurobasalInvitrogen
MEM sem glutaminaInvitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B27Invitrogen17504044
L-glutaminaInvitrogen25030081
suplemento GlutaMAXInvitrogen35050061
PenStrepInvitrogen15140122
BSASigmaA7906
Humano LIFInvitrogenPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biotech130103926
SB431542SigmaS4317
Composto EMerck Millipore565790
EGFMerck Millipore324856
FGF2R& D Systems233FB025
Grau de Pesquisa FBSThermo ScientificSV30160.03Para meio de diferenciação de astrócitos
Definido FBSThermo ScientificSH30070.03Para meio de neurônio primário
PBSThermo ScientificSH30028.02
GlicoseSigmaG8270Para meio de neurônio primário
SacaroseSigmaS0389
HeparinaEMD Millipore375095
PapainWorthington3126
HBSSInvitrogen14175095
DNase IRoche10104159001
Dispase IISTEMCELL Technologies7923
HEPESGibco15630080Para colheita de cérebros
EBSSInvitrogen14155063
L-CisteínaSigmaC7352
Tripsina-EDTAInvitrogen25200056
70 µ filtro de células mBD Biosciences   352350
20 µ unidade de filtrom Sartorius Stedim16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D(+)-glicoseSigmaG7520Para estudos eletrofisiológicos
K-gluconatoSigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375Para estudos eletrofisiológicos
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
Capilares de vidro borossilicatoWorld precision instruments, Inc1604323
tubo de centrífuga de 15 mlBD Biosciences 
tubo de centrífuga de 50 mlBD Biosciences352070
Placas de 24 poçosCorning9761146
Placas de 6 poçosFrascos Corning720083
T25Corning430641
12 mm Protetores de VidroMarienfeld-Superior111520
AMAXA nbsp;LonzaVPG1003Para eletroporação de neurônios corticais primários
Sistema de Transfecção de Néon InvitrogenMPK5000Para eletroporação de fibroblastos humanos
Mini Análise SynaptosoftMini Análise v.6Para medição de PSCs
Fibroblastos Humanos Dérmicos NormaisPromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPREAddgene20945
Lâmpada de arco curtode mercúrio OSRAMHBO 103 W / 2
21103049352096 Kit de Nucleofector de Neurônio de Rato

Referências

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